曾舒泉,鈕徐融,魏聰聰,何明川,蘭明先,謝永輝,王志江,詹莜國,吳國星,金紅崗

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,云南 昆明 650201;2.云南省煙草公司 昆明市公司,云南 昆明 650051;3.云南中煙有限責(zé)任公司 紅云紅河集團(tuán) 原料部,云南 昆明 650231)

煙草黑脛病(Tobacco black shank)是由煙草疫霉(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)引起的土傳性真菌病害[1]。近年來,該病由于發(fā)病快、分布廣、防治難等特點(diǎn),已經(jīng)成為我國煙草最嚴(yán)重的病害之一[2]。目前在烤煙生產(chǎn)上對煙草黑脛病采用以抗病品種篩選利用和合理輪作的農(nóng)業(yè)防治措施為主,化學(xué)防治及其他防治措施為輔的綜合防治手段[3]。但由于對農(nóng)藥的不合理使用,各地烤煙田間病原菌開始出現(xiàn)不同程度的抗藥性[4-6]。化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用不僅會使病原菌抗性進(jìn)一步加強(qiáng),更會加大環(huán)境污染，引發(fā)糧食安全問題。生物防治兼具高效、無毒、無殘留和低成本等特點(diǎn)[7],利用微生物進(jìn)行防治的方法在植物病害治理的舞臺上亦扮演著愈來愈關(guān)鍵的角色,已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。近年來,對煙草黑脛病拮抗菌的研究逐漸增多。目前已報道的對煙草黑脛病具有防治效果的細(xì)菌主要有芽孢桿菌(Bacillusspp.)[8-11]和假單胞菌(Pseudomonasspp.)[12-14]兩大類,其中有關(guān)假單胞菌的報道較少[15]。因為假單胞菌能產(chǎn)生大量的抗生素物質(zhì)，所以常被作為生防菌加以利用[16-18],但在其抑菌機(jī)制和菌劑開發(fā)等方面還屬于空白,需要開展大量的研究[19]。除了利用拮抗細(xì)菌外,有研究發(fā)現(xiàn)木霉菌[20]和青霉菌[21]同樣對煙草黑脛病具有較好的抑制效果。本課題組前期從1種鱗翅目昆蟲的幼蟲腸道內(nèi)分離并篩選出1株對煙草黑脛病菌有較好拮抗效果的銅綠假單胞菌HZ15菌株。本試驗以HZ15菌株發(fā)酵后的細(xì)菌濃度為指標(biāo),采用單因素試驗和正交試驗的方法,對HZ15菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件等進(jìn)行了優(yōu)化,以期為HZ15菌株菌懸液的大量發(fā)酵培養(yǎng)、銅綠假單胞菌生防菌劑的開發(fā)與應(yīng)用,以及煙草黑脛病的生物防治提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 HZ15菌株為本課題組從1種鱗翅目幼蟲腸道分離篩選所得,經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa),保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實驗室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA):牛肉膏0.60 g、蛋白胨2.00 g、NaCl 1.00 g、蒸餾水200 mL，在121 ℃下滅菌20 min(下同)。蛋白胨酵母培養(yǎng)基(LB):蛋白胨2.0 g、酵母浸粉1.00 g、NaCl 2.00 g、蒸餾水200 mL。細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CM):葡萄糖1.00 g、(NH4)2SO40.40 g、檸檬酸鈉0.20 g、MgSO4·7H2O 0.04 g、K2HPO40.80 g、KH2PO41.20 g、蒸餾水200 mL。蛋白胨酵母蔗糖培養(yǎng)基(YSP):蛋白胨2.00 g、酵母浸粉1.00 g、蔗糖4.00 g,蒸餾水200 mL。牛肉膏酵母葡萄糖培養(yǎng)基(NYBD):牛肉浸膏1.60 g、酵母浸粉1.00 g、葡萄糖2.00 g、蒸餾水200 mL。燕麥培養(yǎng)基(OA):燕麥30.0 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌抑菌活性的檢測 采用平板對峙法,用無菌打孔器(5 mm)在病原菌平板上打孔,將菌塊接入新配制的OA平板中央；再用無菌接菌環(huán)挑取拮抗菌，分別在距OA平板中央3 cm的四周等距接種拮抗菌4次,設(shè)置3個重復(fù)；在28 ℃下培養(yǎng)3 d，然后觀察并測量處理平板上煙草疫霉菌的菌落直徑,并取平均值計算其抑菌率。以不接種拮抗菌作為對照。抑菌率的計算公式為：抑菌率=(對照平板菌落直徑-處理平板菌落直徑)/對照平板菌落直徑×100%。

1.2.2 種子液的制備 挑取固體培養(yǎng)基上的HZ15單菌落于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.3 培養(yǎng)基對細(xì)菌生長的影響 向NA、LB、CM、YSP、NYBD五種100 mL液體培養(yǎng)基中各加入50 μL種子液,在28 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h,采用分光光度法測定菌液在波長600 nm處的OD值,從而確定細(xì)菌濃度。每組設(shè)置3個重復(fù)，下同。

1.2.4 碳源對細(xì)菌生長的影響 以上述試驗篩選出的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別加入葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉作碳源,配制不同碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行HZ15的發(fā)酵培養(yǎng)。在培養(yǎng)24 h后分別測定菌液在波長600 nm處的OD值,以確定最佳碳源。

1.2.5 氮源對細(xì)菌生長的影響 以上述試驗篩選出的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別加入NH4Cl、NH4NO3、酪氨酸、谷氨酸、蛋白胨作氮源,配制不同氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。在培養(yǎng)24 h后分別測定菌液在波長600 nm處的OD值,以確定最佳氮源。

1.2.6 初始pH值對細(xì)菌生長的影響 在上述優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至4、5、6、7、8、9、10,再在不同pH值培養(yǎng)基中各接種50 μL種子液,在28 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h,測定不同初始pH值下菌液在波長600 nm處的OD值。

1.2.7 初始接菌量對細(xì)菌生長的影響 分別接種0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、2.5%種子液于上述優(yōu)化培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)24 h,測定不同初始接菌量下菌液在波長600 nm處的OD值。

1.2.8 裝液量對細(xì)菌生長的影響 在250 mL三角瓶中分別配制20、40、80、100、120、160 mL的優(yōu)化培養(yǎng)基,再各接種50 μL種子液,于28 ℃、180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24 h,測定不同裝液量下菌液在波長600 nm處的OD值。

1.2.9 溫度對細(xì)菌生長的影響 在上述優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別設(shè)置溫度至20、24、28、32、36、40 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)24 h,測定不同溫度下菌液在波長600 nm處的OD值。

1.2.10 轉(zhuǎn)速對細(xì)菌生長的影響 在上述優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速至140、160、180、200、220、240 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)24 h,測定不同轉(zhuǎn)速下菌液在波長600 nm處的OD值。

1.2.11 光照時間對細(xì)菌生長的影響 采用優(yōu)化培養(yǎng)基,分別設(shè)定光照時間為0、4、8、12、16、20、24 h/d,在發(fā)酵培養(yǎng)24 h后測定不同光照時間下菌液在波長600 nm處的OD值。

1.2.12 發(fā)酵時間對細(xì)菌生長的影響 采用上述優(yōu)化的培養(yǎng)基配方、初始pH值、溫度和轉(zhuǎn)速,分別發(fā)酵培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、96、108、120、132、144 h,測定不同發(fā)酵時間對細(xì)菌生長的影響,并繪制HZ15的生長曲線。

1.2.13 發(fā)酵條件的正交試驗 根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果,采用最優(yōu)培養(yǎng)基配方,選擇初始接菌量、裝液量和轉(zhuǎn)速這3個因素，設(shè)置3因素3水平的正交試驗(表1),以篩選出最佳的發(fā)酵條件。

表1 正交試驗設(shè)計因素

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 26.0和Microsoft Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析和圖表制作;采用Duncan’s新復(fù)極差法檢驗不同處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 HZ15菌株對煙草疫霉的抑制效果

拮抗菌HZ15菌株與煙草疫霉的平板對峙試驗結(jié)果如圖1所示,HZ15菌株對煙草疫霉的抑菌效果顯著且穩(wěn)定,處理平板上煙草疫霉菌落的直徑約為2.01 cm,抑制率約為77.1%，表明HZ15是1株對煙草黑脛病病原菌具有較好拮抗作用的生防菌。

a：對照。b：平板對峙。

2.2 培養(yǎng)基對細(xì)菌生長的影響

由圖2可以看出,不同培養(yǎng)基對HZ15菌株生長的影響存在顯著差異。HZ15菌株在NA、YSP、LB這3種培養(yǎng)基上生長較好且在三者間差異不明顯,但HZ15菌株在YSP上生長最快,菌液濃度最高,OD值為2.700;HZ15菌株在CM培養(yǎng)基上生長速度最慢,OD值只有1.966。因此,以YSP培養(yǎng)基作為HZ15菌株生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

圖中標(biāo)注不同小寫字母代表處理間差異顯著(P<0.05),下同。

2.3 碳源對細(xì)菌生長的影響

由圖3可以看出,5種不同碳源對HZ15菌株生長的影響存在顯著差異。HZ15菌株在葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和淀粉等碳源培養(yǎng)基上都能生長,其中以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基最適合HZ15菌株的生長,在振蕩培養(yǎng)24 h后OD值為2.551；其次為乳糖、麥芽糖、葡萄糖。相比之下,以淀粉為碳源的培養(yǎng)基不適合細(xì)菌生長,OD值僅為0.643。因此,選用蔗糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖3 碳源對細(xì)菌生長的影響

2.4 氮源對細(xì)菌生長的影響

由圖4可知,5種氮源對HZ15菌株生長的影響具有顯著性差異。HZ15菌株在氯化銨、硝酸銨和蛋白胨等氮源培養(yǎng)基上都能生長,當(dāng)以蛋白胨為氮源時HZ15菌株生長最快,在振蕩培養(yǎng)24 h后OD值為2.647;其次為氯化銨和硝酸銨,表明HZ15菌株可以較好地利用NH4+和NO3-;當(dāng)以酪氨酸和谷氨酸為氮源時OD值分別僅為0.023和0.036,這表明HZ15菌株對這兩種氨基酸的利用率較低。因此,選用蛋白胨作為培養(yǎng)基的最佳氮源。

圖4 氮源對細(xì)菌生長的影響

2.5 初始pH值對細(xì)菌生長的影響

由圖5可知,不同初始pH值對HZ15菌株生長的影響具有顯著性差異。HZ15菌株在pH 5～9條件下均可以生長,生長最適的pH值范圍為5～7,這表明HZ15菌株的生長喜歡微酸至中性環(huán)境；當(dāng)pH值為7時細(xì)菌的濃度最高,OD值為2.674；當(dāng)pH值為4和10時HZ15基本上沒有生長,這表明過酸或過堿都對HZ15菌株的生長有抑制作用。

圖5 初始pH值對細(xì)菌生長的影響

2.6 初始接菌量對細(xì)菌生長的影響

由圖6可知,不同初始接菌量對HZ15菌株生長的影響具有顯著差異。當(dāng)初始接菌量為1%、2%、2.5%時細(xì)菌的生長速度差異不明顯；當(dāng)初始接菌量為2.5%時HZ15菌株的生長速度最快,培養(yǎng)24 h后菌液濃度最高,OD值為2.620;當(dāng)初始接菌量為0.05%時,HZ15菌液的濃度最低,OD值只有2.495。

圖6 初始接菌量對細(xì)菌生長的影響

2.7 裝液量對細(xì)菌生長的影響

由圖7可以看出,在250 mL三角瓶內(nèi)用不同裝液量培養(yǎng)HZ15菌株的情況下,不同的處理對其生長的影響存在顯著差異。當(dāng)裝液量為20 mL時,HZ15菌液的濃度最高,OD值為3.123；其次為裝液量40 mL;當(dāng)裝液量為160 mL時,HZ15菌液的濃度最低,OD值僅有2.211；隨著裝液量由20 mL向160 mL遞增,OD值逐漸下降,這也表明HZ15菌株的生長需要氧氣,且氧氣含量越高,生長越旺盛。

圖7 裝液量對細(xì)菌生長的影響

2.8 溫度對細(xì)菌生長的影響

由圖8可知,不同溫度對HZ15菌株生長的影響具有顯著差異。HZ15菌株在20～40 ℃下均可以生長,當(dāng)發(fā)酵溫度為36 ℃時HZ15菌株生長最快,OD值為2.688；其次為40、28和32 ℃；在發(fā)酵溫度為20和24 ℃的條件下，HZ15菌液的濃度較低,OD值分別為2.416和2.410。這表明HZ15菌株在溫度較高的環(huán)境下生長較好,最適溫度范圍為28～40 ℃。

圖8 溫度對細(xì)菌生長的影響

2.9 轉(zhuǎn)速對細(xì)菌生長的影響

從圖9可以看出,不同轉(zhuǎn)速對HZ15菌株生長的影響存在顯著差異。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為240 r/min時,HZ15菌株生長最快,菌液濃度最高,OD值為2.777；其次為轉(zhuǎn)速220 r/min；在轉(zhuǎn)速140、160、180、200 r/min間HZ15菌株的生長速度差異不明顯,且菌液濃度都較低。

圖9 轉(zhuǎn)速對細(xì)菌生長的影響

2.10 光照時間對細(xì)菌生長的影響

由圖10可以看出,HZ15菌株在有無光照的情況下均能生長。在光照時間為0、4、8、12、16、20 h/d的處理之間，HZ15菌株的生長速度差異不顯著；但當(dāng)光照時間為12 h/d時HZ15的菌液濃度最高,OD值為2.075；其次為光照時間16和20 h/d。由此可見,12 h/d光照對HZ15菌株的生長有促進(jìn)作用,且效果最好。

圖10 光照時間對細(xì)菌生長的影響

2.11 發(fā)酵時間對細(xì)菌生長的影響

從圖11可以看出,HZ15菌株的生長曲線基本上呈現(xiàn)“S”型。在發(fā)酵時間0～4 h期間,HZ15菌液的濃度較低,細(xì)菌數(shù)量呈緩慢增長趨勢,該時段為細(xì)菌生長的遲緩期；從4 h開始,菌液濃度開始隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大,到20 h時菌液濃度增大逐漸變緩,該時段為細(xì)菌生長的對數(shù)期；在20～72 h期間,菌液濃度總體上呈先緩慢上升后緩慢下降的趨勢，在48 h時HZ15菌液的濃度最大,OD值為2.900，該時段為細(xì)菌生長的穩(wěn)定期；72 h后,隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長，HZ15菌液的濃度快速下降,該時段為細(xì)菌生長的衰亡期。

圖11 HZ15菌株的生長曲線

2.12 發(fā)酵條件的正交試驗結(jié)果

根據(jù)初始接菌量、裝液量和轉(zhuǎn)速的單因素試驗結(jié)果,采用L9(33)正交表,設(shè)計3因素3水平的正交試驗:初始接菌量選取1.0%、2.0%、2.5%;裝液量選取20、40、80 mL;轉(zhuǎn)速選取200、220、240 r/min。由表2數(shù)據(jù)可以看出,3個因素的極差R值從大到小依次為裝液量、轉(zhuǎn)速和初始接菌量,表明三者對HZ15發(fā)酵影響的強(qiáng)弱順序為裝液量>轉(zhuǎn)速>初始接菌量。根據(jù)K值大小,可以得出3個因素的最佳組合為轉(zhuǎn)速220 r/mim、裝液量40 mL、初始接菌量2.5%,其OD600為3.052。

表2 發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)是一種常見的植物根際促生菌,其不僅能促進(jìn)植物生長,還能夠抑制諸多病原微生物的生長[22],其代謝產(chǎn)物例如嗜鐵素類、吩嗪類、鼠李糖脂和胞外多糖類素等物質(zhì)對卵菌和真菌等具有顯著的抑制作用[23]。有研究發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌不僅是一種優(yōu)良的植物病原生防細(xì)菌,還可以與生物肥料混合使用,某些銅綠假單胞菌株還同時具有除草的活性[22,24-26]。隨著微生物發(fā)酵工程技術(shù)的不斷提高,對有益微生物進(jìn)行發(fā)酵,收集其代謝產(chǎn)物和菌體用于生物防治和提高作物產(chǎn)量的相關(guān)研究也越來越多,對有益微生物的發(fā)酵條件進(jìn)行研究也變得越來越重要[27]。銅綠假單胞菌能夠產(chǎn)生豐富且抑菌的代謝產(chǎn)物[23],因此對銅綠假單胞菌的發(fā)酵條件進(jìn)行研究顯得尤為重要。已有的研究表明,來源于土壤和植物的煙草黑脛病拮抗菌居多[15],其它來源的拮抗細(xì)菌幾乎是空白。銅綠假單胞菌HZ15來自昆蟲腸道內(nèi),具有一定新穎性,HZ15菌株的應(yīng)用同時也豐富了昆蟲腸道細(xì)菌方面的研究。

目前國內(nèi)對銅綠假單胞菌發(fā)酵條件的研究主要集中在對其產(chǎn)生鼠李糖脂和蛋白酶等代謝產(chǎn)物發(fā)酵上[28,29]。本試驗從細(xì)菌生長的角度出發(fā),對銅綠假單胞菌HZ15的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,更加豐富了銅綠假單胞菌作為植物病害拮抗菌的發(fā)酵條件研究。本試驗結(jié)果表明:HZ15菌株對碳源的選擇較廣泛,容易分解利用蔗糖、葡萄糖、麥芽糖，但是對淀粉的利用率較低,這可能與銅綠假單胞菌對淀粉的水解能力較弱有關(guān)；HZ15對NH4Cl、NH4NO3和蛋白胨的利用較好,但對酪氨酸和谷氨酸的利用極低,這表明HZ15菌株可能對氨基酸的利用效果不佳,該結(jié)果與王波等[30]和吳志美等[31]關(guān)于細(xì)菌對氮源選擇的研究結(jié)果類似。在最佳裝液量和搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化方面,可以發(fā)現(xiàn)HZ15菌株在氧氣充足的情況下能夠很好地生長,這證明HZ15菌株為好氧型細(xì)菌;在光照時間的優(yōu)化方面,可以發(fā)現(xiàn)HZ15在12 h/d的光照情況下生長較好,這表明HZ15菌株可能為感光型細(xì)菌,但還需進(jìn)一步的探究。

影響微生物生長和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的因素有很多,比如發(fā)酵培養(yǎng)基的組成、pH值、溫度、裝液量等。不同的微生物因為其不同的代謝方式和生活環(huán)境等,對培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的要求也有所不同[31]。本試驗獲得的HZ15菌株的最佳發(fā)酵條件與已報道的其他銅綠假單胞菌菌株的發(fā)酵條件[28,32,33]存在差異。這表明由于遺傳特性、生活環(huán)境、生理生化和菌株來源等諸多因素不同,同種微生物的不同株系對發(fā)酵條件亦具有不同的要求。當(dāng)然,不同銅綠假單胞菌株系之間也有相似的選擇性,例如發(fā)酵初始pH值都為微酸偏中性[19,29]。

本試驗對煙草黑脛病菌拮抗菌HZ15菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明:HZ15菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為蛋白胨酵母蔗糖培養(yǎng)基(YSP),其組分為蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、蔗糖20 g/L、蒸餾水1 L;最佳發(fā)酵條件為pH 7、溫度36 ℃、光照時間12 h/d、發(fā)酵時間48 h、裝液量40 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速220 r/min、接菌量2.5%。經(jīng)優(yōu)化后的發(fā)酵條件方案提升了HZ15菌株的培養(yǎng)效率,節(jié)約了發(fā)酵成本,可以為HZ15菌株菌懸液的大量發(fā)酵培養(yǎng)、生防菌劑的開發(fā)與應(yīng)用，以及煙草黑脛病的綠色防控提供科學(xué)依據(jù)。對銅綠假單胞菌產(chǎn)生的如鼠李糖脂、蛋白酶和吩嗪類物質(zhì)等代謝產(chǎn)物的分離、鑒定和發(fā)酵等今后擬開展進(jìn)一步的試驗研究。