張 瑜，高建洲，韓 韶

(邯鄲市第一醫(yī)院 東院區(qū) 神經(jīng)外科，河北 邯鄲 056000)

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是因腦血管破裂而引起的一種腦血管疾病，造成的腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能造成嚴(yán)重?fù)p害，ICH發(fā)病急、進(jìn)展快，致殘率、病亡率極高，且預(yù)后不佳，給患者身心健康造成極大威脅[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在ICH后繼發(fā)腦損傷的病理過程中起到重要作用，可造成腦水腫和神經(jīng)元凋亡，引發(fā)神經(jīng)功能障礙，另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)炎性反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步加重腦損傷，因而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可提高神經(jīng)元存活率，減輕腦損傷[2]。RNA 依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase RNA-like ER kinase，PERK)/真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)/轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白的同源蛋白(CCAAT enhan-cer binding protein-homologous protein，CHOP)通路是調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的主要信號(hào)通路，在缺血/再灌注損傷、炎性反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等病理機(jī)制中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，下調(diào)該通路蛋白表達(dá)可減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制炎性反應(yīng)，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，減輕腦組織損傷[3-4]，因而抑制PERK/eIF2α/CHOP信號(hào)通路激活可作為ICH的潛在治療手段。呋塞米(furosemide,FUR)是臨床常用的一種高效利尿藥，可抑制腎小管對(duì)鈉鉀離子重吸收，促進(jìn)水分排泄，起到強(qiáng)效利尿作用，還可阻止鈉離子進(jìn)入腦組織，減少腦脊液生成，降低顱內(nèi)壓，減輕腦水腫，對(duì)ICH療效顯著，廣泛用于臨床[5]，但其對(duì)ICH大鼠PERK/eIF2α/CHOP通路及繼發(fā)性腦損傷的影響，目前還未有明確闡述，本文通過構(gòu)建ICH大鼠模型，對(duì)此進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物: SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量200～240 g，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(魯) 2019 0003，參照《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》飼養(yǎng)在本院動(dòng)物房，溫度為22 ℃～25 ℃，濕度為45%～55%，噪音≤50 dB，大鼠自由進(jìn)食及飲水，光照晝夜循環(huán)(12 h/12 h)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑: Ⅳ型膠原酶(上海一研生物科技有限公司)；呋塞米(furosemide，F(xiàn)UR)注射液(遂成藥業(yè)股份有限公司)；單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液(齊魯制藥有限公司)；Evans藍(lán)(上海鈺博生物科技有限公司)；HE染色試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；大鼠γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、兔源PERK、CHOP及p-eIF2α一抗、羊抗兔二抗(Abcam公司)；兔源p-PERK及β-tubulin一抗、鼠源eIF2α一抗(Santa Cruz公司)；羊抗鼠二抗(Cell Signaling Technology公司)；RIPA裂解液(上海吉至生化科技有限公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理: 參照文獻(xiàn)[6]，將大鼠分為假手術(shù)組、模型組(腦定位注射Ⅳ型膠原酶,建立ICH模型)、FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經(jīng)節(jié)苷脂干預(yù)組，每組18只。分別配制為1、2、4 mg/mL的FUR[8]溶液和5 mg/mL單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉[9]溶液，藥物處理組大鼠均經(jīng)尾靜脈注射給藥，劑量為1 mL/kg，假手術(shù)組與模型組大鼠均尾靜脈注射1 mL/kg的0.9%氯化鈉溶液，每天1次，持續(xù)14 d。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能缺損的檢測(cè): 第14天給藥后24 h，根據(jù)各組大鼠行為活動(dòng)情況檢測(cè)其神經(jīng)功能，并參照Longa評(píng)分[7]法進(jìn)行評(píng)分，從行為活動(dòng)正常到死亡共分為5級(jí)，得分從0到5分。

1.2.3 大鼠血腦屏障損傷的檢測(cè)：神經(jīng)功能缺損檢測(cè)結(jié)束后，進(jìn)行Evans藍(lán)外滲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠血腦屏障損傷：各組大鼠均隨機(jī)選取6只，以5 mL/kg的劑量股靜脈注射2% Evans藍(lán)染料，1 h后以乙醚麻醉，切下鼠頭，解剖分離大腦，稱量濕質(zhì)量，以60 ℃甲酰胺對(duì)其浸泡，24 h后運(yùn)用分光光度計(jì)測(cè)量浸出液中Evans藍(lán)含量。

1.2.4 標(biāo)本收集及大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況的檢測(cè)：各組大鼠再次隨機(jī)選取6只，自尾靜脈取血3 mL后麻醉處死，取出大腦，稱量濕質(zhì)量，將其置于烤箱中烤干，稱量干質(zhì)量，計(jì)算大腦含水量，公式：大腦含水量=(大腦濕質(zhì)量-大腦干質(zhì)量)/大腦濕質(zhì)量×100%。將上述血液放入4 ℃，3 000 r/min離心15 min，吸取上清儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆谩８鹘M最后剩余的6只大鼠，經(jīng)麻醉后處死，解剖獲得大腦，取下相同部位腦組織約0.5 g儲(chǔ)存在液氮中備用；剩余腦組織經(jīng)0.9%氯化鈉溶液漂洗后，置于特制小盒中，以O(shè)CT(optimal cutting temperature compound)包埋劑浸沒組織，放入液氮中速凍成塊，采用冰凍切片機(jī)做常規(guī)病理切片，置于室溫30 min后，以4 ℃丙酮固定10 min，參照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行HE染色，經(jīng)75%、90%、100%乙醇依次脫水、二甲苯透明后，轉(zhuǎn)移至載玻片上封片，以顯微鏡采集任意5個(gè)視野圖像。

1.2.5 ELISA檢測(cè)大鼠血清IFN-γ、IL-6水平：參照ELISA試劑盒說明書的操作步驟，檢測(cè)血清其中各炎性因子IFN-γ、IL-6水平。

1.2.6 免疫印跡法檢測(cè)大鼠腦組織PERK/eIF2α/CHOP通路相關(guān)蛋白表達(dá)：取出1.2.4中各組大鼠腦組織，加入1.5 mL RIPA裂解液，勻漿后4 ℃，3 000 r/min離心20 min，以BCA法測(cè)量上清中總蛋白濃度，然后將各樣本濃度根據(jù)結(jié)果調(diào)至相同，加入上樣緩沖液，煮沸6 min變性，各取20 L樣品液上樣，電泳后濕轉(zhuǎn)，均于恒壓110 V下進(jìn)行，將所得硝酸纖維素膜根據(jù)分子質(zhì)量剪下目的蛋白條帶，以5%脫脂奶粉溶液于室溫下孵育2 h，封閉膜上蛋白非特異性位點(diǎn)，然后分別加入兔源PERK、CHOP、p-eIF2α、p-PERK、β-tubulin一抗和鼠源eIF2α一抗，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗，加入對(duì)應(yīng)的羊抗兔及羊抗鼠二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液漂洗，通過化學(xué)發(fā)光法對(duì)蛋白條帶顯影，然后放入凝膠成像儀中拍照，運(yùn)用Image-J軟件得到蛋白條帶灰度值，并對(duì)各蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 呋塞米(FUR)對(duì)大鼠神經(jīng)功能損傷的影響

模型組大鼠Longa評(píng)分相比假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經(jīng)節(jié)苷脂組大鼠Longa評(píng)分相比模型組均降低(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group圖1 大鼠Longa評(píng)分Fig 1 Neurological function Longa Score of rats

2.2 呋塞米(FUR)對(duì)大鼠腦水腫的影響

模型組大鼠大腦含水量相比假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經(jīng)節(jié)苷脂組大鼠大腦含水量相比模型組均降低(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group圖2 大鼠大腦含水量Fig 2 Water content of rat brain

2.3 呋塞米(FUR)對(duì)大鼠血腦屏障損傷的影響

模型組大鼠Evans藍(lán)滲出量相比假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經(jīng)節(jié)苷脂組大鼠Evans藍(lán)滲出量相比模型組均呈劑量依賴性降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group圖3 大鼠Evans藍(lán)滲出量Fig 3 Evans blue exudation in rats

2.4 呋塞米(FUR)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響

假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元無損傷；模型組大鼠海馬神經(jīng)元變性壞死，皺縮變小，數(shù)目明顯減少，呈現(xiàn)嚴(yán)重病理?yè)p傷；相比模型組，F(xiàn)UR-L、FUR-M、FUR-H組及神經(jīng)節(jié)苷脂組大鼠腦海馬神經(jīng)元病理?yè)p傷均減輕，且FUR各組隨劑量升高，海馬神經(jīng)元病理?yè)p傷減輕程度增強(qiáng)，相比經(jīng)節(jié)苷脂組，F(xiàn)UR-H組大鼠海馬神經(jīng)元病理?yè)p傷減輕程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

2.5 呋塞米(FUR)對(duì)大鼠血清IL-6及IFN-γ水平的影響

模型組大鼠血清IL-6及IFN-γ水平相比假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經(jīng)節(jié)苷脂組大鼠血清IL-6及IFN-γ水平相比模型組均降低(P<0.05)(圖5)。

2.6 呋塞米(FUR)對(duì)大鼠腦組織PERK/eIF2α/CHOP通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

模型組大鼠腦組織PERK/eIF2α/CHOP通路相關(guān)蛋白p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表達(dá)水平相比假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經(jīng)節(jié)苷脂組大鼠腦組織PERK/eIF2α/CHOP通路相關(guān)蛋白p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表達(dá)水平相比模型組均降低(P<0.05)(圖6)。

3 討論

ICH易發(fā)于中老年群體，發(fā)病迅速，病情危重，易引發(fā)偏癱、神經(jīng)功能缺損等后遺癥，如今仍是一個(gè)尚未解決的醫(yī)學(xué)難題[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種膜性細(xì)胞器，腦實(shí)質(zhì)出血后，形成的血腫可刺激神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)炎性反應(yīng)，造成神經(jīng)功能缺損及腦水腫，最終引發(fā)繼發(fā)性腦損傷[11]。本文采用腦定位注射Ⅳ型膠原酶的方法建立ICH大鼠模型，結(jié)果表明Ⅳ型膠原酶可造成腦實(shí)質(zhì)出血，誘發(fā)神經(jīng)炎性反應(yīng)，引起腦水腫，神經(jīng)元凋亡，血腦屏障受損，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙。

研究顯示，減輕腦水腫，對(duì)減輕ICH腦損傷具有重要意義，因而利尿脫水是ICH的有效治療方法，F(xiàn)UR作為一種強(qiáng)效利尿劑，可對(duì)腎小管髓袢升支粗段發(fā)揮作用， 在ICH的臨床治療中得到了廣泛應(yīng)用[12]，但其藥理機(jī)制目前還未有詳細(xì)的闡釋。PERK/eIF2α/CHOP通路是主要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到氧化應(yīng)激、缺血/再灌注、鈣離子代謝紊亂及糖基化反應(yīng)異常等病理因素刺激時(shí)，會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)， 此時(shí)PERK/eIF2α/CHOP信號(hào)通路激活，引發(fā)細(xì)胞凋亡和組織損傷，下調(diào)PERK及eIF2α磷酸化水平，可抑制CHOP蛋白表達(dá)，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，改善腦血管及腎組織損傷[13-14]，因而推測(cè)，F(xiàn)UR可能下調(diào)PERK/eIF2α/CHOP通路，抑制ICH后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而緩解其繼發(fā)性腦損傷。本文結(jié)果顯示，ICH大鼠經(jīng)FUR處理后，其海馬神經(jīng)元病理?yè)p傷有不同程度減輕，另外大鼠Longa評(píng)分、Evans藍(lán)滲出量、大腦含水量、血清IFN-γ及IL-6水平、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表達(dá)水平均降低，且呈劑量依賴性，表明FUR可下調(diào)PERK/eIF2α/CHOP通路蛋白表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及炎性反應(yīng)，減少海馬神經(jīng)元凋亡，緩解腦水腫，改善ICH大鼠神經(jīng)功能障礙。

A.sham operation group；B.model group；C.FUR-L group；D.FUR-M group；E.FUR-H group；F.ganglioside group圖4 HE染色檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況Fig 4 HE staining was used to detect the damage of hippocampal neurons (scale bar=50 μm)

*P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group圖5 ELISA檢測(cè)大鼠血清IL-6及IFN-γ水平Fig 5 ELISA was used to detect the serum levels of IFN-γ and IL-6 in rats(pg/mL)

綜上所述，F(xiàn)UR可降低PERK、eIF2α磷酸化水平，下調(diào)CHOP蛋白表達(dá)，減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及炎性反應(yīng)，緩解腦水腫和神經(jīng)元損傷，減輕ICH引發(fā)的繼發(fā)性腦損傷，促使神經(jīng)功能修復(fù)，抑制PERK/eIF2α/CHOP信號(hào)通路激活可能是其藥理機(jī)制之一，但本文只做了初步探究，還存在一定不足，后續(xù)還應(yīng)使用該信號(hào)通路激活劑及抑制劑進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證。

A.sham operation group；B.model group；C.FUR-L group；D.FUR-M group；E.FUR-H group；F.ganglioside group; *P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group