張瓊宇 唐甲卉 彭 娟 唐鵬程 孫遠東

(1. 永州職業(yè)技術(shù)學院公共基礎(chǔ)學部, 永州 425100; 2. 湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院, 長沙 410006;3. 湖南科技大學生命科學學院, 湘潭 411201)

單倍體是指體細胞染色體組數(shù)等于該物種配子染色體組數(shù)的個體。由于只含有一套染色體, 理論上任何隱性突變基因的遺傳效應(yīng)都會由于缺乏等位基因而在單倍體表型中體現(xiàn)出來。因此, 單倍體在遺傳篩選、基因功能研究和轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)中具有獨特價值[1]。

脊椎動物單倍體細胞可以體外培養(yǎng)并持續(xù)分裂增殖[2—4], 但人工誘導的魚類和兩棲類單倍體胚胎都呈現(xiàn)出致死的“單倍體綜合癥”[5—10]。傳統(tǒng)的理論認為核質(zhì)不平衡、有害的隱性基因和單倍體細胞分化能力缺陷是單倍體綜合癥產(chǎn)生的原因[11,12]。近年來, 一些學者利用新的技術(shù)手段探討了魚類單倍體綜合癥形成的分子機制。在青鳉(Oryzias latipes)中, 有研究表明單倍體索前板發(fā)育不良導致其體軸短小[7]; 在金魚(Carassius auratus)中, 蛋白質(zhì)組分析表明自交二倍體和雌核發(fā)育單倍體胚胎在發(fā)育過程中的蛋白表達存在顯著差異[13]; 表觀遺傳學研究顯示ntl(no tail)基因在精子和卵子存在甲基化差異, 雌核發(fā)育單倍體胚胎中因僅含ntl母本等位基因使其表達模式異常導致胚胎發(fā)育缺陷[14]。在牙鲆(Paralichthys olivaceus)中, 轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)在單倍體中Notch和Wnt信號通路的相關(guān)基因表達下調(diào)[15]。這些研究各自探討了單倍體胚胎發(fā)育異常的原因, 提出了一些與傳統(tǒng)理論不同的看法, 但對于單倍體胚胎綜合癥的產(chǎn)生機制至今仍然沒有定論。

血液循環(huán)障礙是魚類單倍體的共有特征[7,8],然而對其形成原因尚未進行系統(tǒng)研究。金魚(Carassius auratus)是我國傳統(tǒng)的觀賞養(yǎng)殖魚類, 距今有1700多年馴養(yǎng)歷史[16]。經(jīng)過長時間人工近交選育, 金魚各品系群體內(nèi)遺傳相似度很高[17], 其全基因組序列已經(jīng)被測定[18], 是研究脊椎動物發(fā)育和進化的良好模型[19,20]。本研究首先觀察了金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎血液循環(huán)的形態(tài)特征, 然后從分子水平比較分析了單倍體與自交二倍體胚胎循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育過程之間的差異, 初步探討了導致單倍體胚胎血液循環(huán)障礙的原因, 為進一步研究單倍體綜合癥的發(fā)生機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

金魚紅帽品系(Red cap oranda)和雄性湘江野生鯉(Cyprinus carpioL.)由湖南省水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐教學示范中心提供。

1.2 金魚雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體的獲得

在繁殖季節(jié), 用紫外線照射后的鯉精液激活金魚成熟卵子發(fā)育獲得雌核發(fā)育單倍體胚胎, 通過干法人工授精獲得自交二倍體胚胎, 具體方法參照先前的報道進行[21]。雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體來自同一條雌魚。卵子受精后3—5min用0.25%的胰蛋白酶(Sangon Biotech)去膜, 胚胎置(20±0.5)℃孵育。金魚胚胎的發(fā)育時期參考文獻[22]報道確定。

由于父本鯉具有單尾的顯性性狀, 而母本金魚具有雙尾隱性性狀, 因此, 人工誘導雌核發(fā)育單倍體胚胎都是雙尾。借助這種明顯可分辨的遺傳學標記, 在體節(jié)形成期即可通過觀察尾柄的性狀準確鑒別得到可靠的單倍體[6]。

1.3 不同表型單倍體胚胎的鑒定、分類和統(tǒng)計分析

金魚早期出現(xiàn)血液循環(huán)時胚胎透明, 可用體式顯微鏡直接觀察循環(huán)細胞的數(shù)量和形態(tài)。在金魚單倍體胚胎囊胚早期挑去未受精卵, 將已發(fā)生卵裂的受精卵數(shù)作為統(tǒng)計基數(shù)。當胚胎發(fā)育至65%耳囊閉合 (Otic vesicle closure, OVC) 期, 一部分單倍體胚胎死亡, 其余單倍體胚胎根據(jù)血液循環(huán)表型可分為3類, A類為血液循環(huán)基本正常的胚胎, B類為血液循環(huán)不良的胚胎, C類為無血液循環(huán)胚胎。統(tǒng)計3類不同表型胚胎和死亡胚胎的數(shù)目, 實驗重復3次。每一批統(tǒng)計的雌核發(fā)育單倍體胚胎來自同一條雌魚。采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析, 多組間兩兩比較采用Tukey’s多重比較檢驗,P＜0.05表示存在顯著性差異。

1.4 流式細胞儀檢測染色體倍性

取25% OVC期金魚胚胎, 于體式顯微鏡(Olympus SZ61)下用尖頭鑷子挑去卵黃囊。將自交二倍體和雌核發(fā)育單倍體胚胎分別置于ACD抗凝劑(0.48 g檸檬酸+1.32 g檸檬酸鈉+1.47 g葡萄糖+100 mL H2O)中剪碎制備成細胞懸液, 取細胞懸液與DAPI染液(Sangon Biotech)1∶1混合后避光染色15min, 樣品經(jīng)過20 μL尼龍過濾器過濾后進行流式細胞儀(CyFlow?Ploidy Analyser, Sysmex Partec)檢測。

1.5 鄰聯(lián)茴香胺染色

鄰聯(lián)茴香胺能與亞鐵離子耦合特異性標記血紅蛋白, 從而可以指示紅細胞分布的情況。稱取20 mg鄰聯(lián)茴香胺(Sigma)溶于14 mL無水乙醇中,4℃避光儲備, 然后以此儲備液配制染色工作液(0.6 mg/mL鄰聯(lián)茴香胺、0.01 mol/L醋酸鈉、0.65%過氧化氫和40%乙醇)。對去膜的金魚胚胎進行避光染色15min, 然后利用體式顯微鏡(Nikon C-DSS230)和數(shù)碼攝像系統(tǒng)(Nikon DXM1200)觀察、拍照。

1.6 金魚造血與血管發(fā)生相關(guān)基因的部分cDNA序列獲得

使用總RNA抽提試劑盒(SV Total RNA Isolation System, Promega)提取14體節(jié)期的金魚胚胎總RNA。利用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計測定RNA完整性和濃度。以500 ng總RNA為模板, 利用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)合成cDNA第一條鏈。根據(jù)斑馬魚基因scl(AF045432)、gata-1(DRU18311)、flk-1(AF180354)、N-cadherin(NM_131081)的編碼區(qū)保守序列和金魚gsc(XM_026285620)編碼區(qū)序列設(shè)計引物(表 1), 以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增, 各目的片段回收純化后, 利用pEGM-T載體(Promega)進行亞克隆和序列測定。所得測序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中Blast功能分析后,分別確認為金魚scl、gata-1、flk-1、N-cadherin和gsc基因的部分cDNA序列。所得金魚scl、gata-1、flk-1和N-cadherin的部分cDNA序列已遞交至NCBIGenBank中。

表 1 本研究擴增的金魚基因Tab. 1 Goldfish genes amplified in this study

1.7 整胚原位雜交

將上述分別插入了scl、gata-1、flk-1、N-cadherin和gsc基因部分cDNA片段并已經(jīng)測定序列的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NotⅠ (TaKaRa)線性化處理, 然后以此為模板利用T7 RNA多聚酶(Roche)合成地高辛標記的反義RNA探針。在不同的發(fā)育時期, 包括95%外包期、5體節(jié)期、14體節(jié)期、20體節(jié)期和25% OVC期等, 隨機選取雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體胚胎各40—50枚胚胎經(jīng)4%的多聚甲醛(Sangon Biotech)固定過夜, 用于整胚原位雜交分析, 具體步驟參照文獻[23] 。

2 結(jié)果

2.1 金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎呈現(xiàn)不同程度的循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育缺陷

金魚卵子經(jīng)遺傳失活的鯉精子激活后可以獲得高比例的雌核發(fā)育單倍體胚胎(圖1 b—e), 在體節(jié)形成期根據(jù)金魚的雙尾隱性遺傳性狀可將其準確鑒定, 流式細胞儀檢測也進一步確定了其倍性(圖 1f)。體式顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 25% OVC期金魚自交二倍體胚胎開始出現(xiàn)心跳, 然后逐漸可見血液循環(huán); 65% OVC期二倍體胚胎心跳有力、卵黃囊雙側(cè)的總主靜脈(Common cardinal vein, CCV)中均可見明顯的血液流動, 血量充沛、血液循環(huán)順暢(圖 1a)。雌核發(fā)育單倍體胚胎心跳開始的時間相較于自交二倍體胚胎晚約4—6h, 但不同的單倍體胚胎血液循環(huán)出現(xiàn)的時間先后不一, 差異較大,部分單倍體胚胎直至死亡也未出現(xiàn)明顯的血液循環(huán)。在65% OVC期, 單倍體胚胎循環(huán)系統(tǒng)明顯呈現(xiàn)不同程度的發(fā)育缺陷, 我們可依據(jù)觀察到的血液循環(huán)表型將單倍體胚胎大致分為3類: A類胚胎,血液循環(huán)基本正常, 心血管系統(tǒng)發(fā)育良好, 心跳明顯(圖 1b); B類胚胎, 血液循環(huán)不良, 胚體局部有血液淤積, 往往僅在卵黃囊一側(cè)的CCV中可見明顯的血液流動, 心跳明顯, 心包腔有輕度水腫(圖 1c和圖 1d); C類胚胎, 無明顯可見的血液循環(huán), 心臟有微弱跳動, 心包腔嚴重水腫, 胚體背部可見少量血細胞堆積(圖 1e)。其中B類胚胎所占比例明顯高于A類和C類(圖1g)。對金魚胚胎血紅蛋白進行鄰聯(lián)茴香胺染色, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)60% OVC期的金魚自交二倍體胚胎全身各處均有被染色的區(qū)域(圖1h箭頭所示), 包括卵黃囊兩側(cè)、軀干及尾部血島(Posterior blood island, PBI); 雌核發(fā)育單倍體A類胚胎中染色情況與同期自交二倍體胚胎類似, 但染色面積較少, 強度較弱(圖 1i箭頭所示); B類胚胎的染色區(qū)域主要位于卵黃囊的某一側(cè)及PBI (圖 1j和圖 1k箭頭所示); C類胚胎的染色區(qū)域僅位于胚體背部 (圖 1l箭頭所示)。這些觀察結(jié)果說明金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎中具有不同程度的血液循環(huán)不良及原始紅細胞生成缺陷。

圖 1 金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎具有循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育缺陷Fig. 1 Circulatory developmental defects of goldfish gynogenetic haploid embryos

2.2 金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎存在原始造血缺陷

魚類胚胎早期血液循環(huán)中的血細胞主要是原始造血產(chǎn)生的紅細胞[24]。我們首先利用反義RNA整胚原位雜交技術(shù)檢測了原始紅系細胞發(fā)育關(guān)鍵基因scl和gata-1在金魚自交二倍體和雌核發(fā)育單倍體胚胎中的表達。結(jié)果顯示, 在正常自交二倍體胚胎中,scl基因在體節(jié)形成早期即開始特異性表達于前側(cè)板中胚層(Anterior lateral-plate mesoderm, ALM)和后側(cè)板中胚層(Posterior lateral-plate mesoderm, PLM)中(數(shù)據(jù)未顯示); 隨著胚胎發(fā)育的進行,scl的表達沿頭端和尾端擴展, 在14體節(jié)期, 可以觀察到體節(jié)外側(cè)表達scl的PLM細胞已經(jīng)開始向胚體中線遷移(圖 2a箭頭所示); 20體節(jié)期至25%OVC期, PLM逐漸在脊索腹側(cè)軀干區(qū)域融合形成ICM (圖 2i箭頭和圖 2m星號所示)。在雌核發(fā)育單倍體胚胎中,scl基因也在體節(jié)形成后即開始表達(數(shù)據(jù)未顯示), 但其表達模式在后期的發(fā)育過程中呈現(xiàn)出多種異常。在14體節(jié)期, 表達scl的PLM細胞向胚體中線遷移受阻(圖 2b—d), 并且PLM區(qū)域scl的表達沿前后軸方向縮短(圖 2f—h短箭頭所示,78%,n=50); 在20體節(jié)期, 單倍體胚胎背部的scl表達減弱, 并保持胚體兩側(cè)定位(圖 2j—l, 62%,n=50),有的胚胎兩側(cè)的scl表達強度也有所不同(圖 2k和2l); 在25% OVC期, 單倍體胚胎軀干區(qū)域的scl表達進一步減弱, ICM結(jié)構(gòu)模糊, 呈彌散狀(圖 2n—p,72%,n=50)。

整胚原位雜交檢測gata-1基因表達的結(jié)果顯示, 在正常自交二倍體胚胎中,gata-1基因從5體節(jié)期開始特異性表達于胚體兩側(cè)的PLM區(qū)域內(nèi)(數(shù)據(jù)未顯示); 14體節(jié)期到25% OVC期, 兩條條紋狀gata-1基因的表達信號從前端靠近 (圖 3a), 然后進一步向胚體中線遷移匯聚融合(圖 3i箭頭所示), 最后形成一條信號, 定位于ICM區(qū)域內(nèi)(圖 3m星號所示)。在雌核發(fā)育單倍體胚胎中,gata-1開始表達的時間與自交二倍體相似; 但隨著胚胎發(fā)育的進行, 其表達模式呈現(xiàn)出多種異常。14體節(jié)期, 單倍體胚胎中g(shù)ata-1的表達沿前后軸方向縮短(圖 3f—h短箭頭所示, 68%,n=50); 20體節(jié)期, 單倍體胚胎中g(shù)ata-1的表達減弱,gata-1+細胞向胚胎背中線遷移受阻(圖 3j—l, 82%,n=50); 25% OVC期,gata-1表達信號進一步減弱并仍然定位于胚體兩側(cè), 未能遷移至胚胎背部中線(圖 3n—p, 74%,n=50)。在各發(fā)育階段還可見一些單倍體胚胎只在胚體一側(cè)有明顯的gata-1表達信號(圖 3d和3l)。這些結(jié)果說明scl和gata-1在金魚雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體胚胎中的表達模式存在明顯差異, 原始造血關(guān)鍵部位ICM發(fā)育缺陷,原始造血干細胞和紅細胞數(shù)量減少。

2.3 金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎存在血管發(fā)育缺陷

已有研究表明SCL在造血干細胞和血管的發(fā)育中都發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用[25],scl在單倍體胚胎中表達異常, 說明其血管系統(tǒng)發(fā)育也有缺陷。進一步對成血管細胞和血管內(nèi)皮細胞的重要標記基因flk-1進行表達分析以了解金魚單倍體胚胎中血管的發(fā)育情況。整胚原位雜交結(jié)果顯示, 25% OVC期的自交二倍體胚胎中flk-1在整個血管系統(tǒng)均有表達, 在背主動脈、后主靜脈、頭面部血管、節(jié)間血管和尾部血管中均可見表達信號(圖 4a和圖 4f), 且原始體軸血管背主動脈(圖 4g黑色六角星所示)和后主靜脈(圖 4g白色六角星所示)發(fā)育良好, 節(jié)間血管清晰完整, 上下排之間夾角固定(圖 4g箭頭所示); 而同時期的單倍體胚胎中flk-1在軀干處表達減弱(圖 4b—e, 72.5%,n=40), 背主動脈和后主靜脈結(jié)構(gòu)紊亂、模糊不清, 節(jié)間血管與體軸血管呈垂直排列(圖 4h和圖 4i), 并且數(shù)量減少, 在體軸一側(cè)缺失(圖 4c)或在軀干背部完全缺失(圖 4d和圖 4e)。這些結(jié)果說明金魚雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體胚胎中的flk-1表達具有明顯差異, 雌核發(fā)育單倍體胚胎中成血管細胞和血管內(nèi)皮細胞減少, 原始體軸血管發(fā)育受到干擾, 節(jié)間血管發(fā)育不全, 存在嚴重的血管發(fā)育缺陷。

2.4 金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎原腸胚期存在細胞運動缺陷

觀察金魚胚胎原腸期發(fā)育過程發(fā)現(xiàn), 與自交二倍體胚胎相比, 單倍體胚胎外包運動受阻, 到達尾芽期要延遲30min至1h(67.5%,n=40); 并且單倍體胚胎的前后體軸(圖 5b—d中箭頭和三角形所示間距)明顯縮短。原位雜交檢測發(fā)現(xiàn), 與自交二倍體胚胎相比, 95%外包期, 脊索前板標記基因gsc在單倍體胚胎中的表達區(qū)域更加靠近植物極(圖 5f—h, 77.5%,n=40), 說明其具有延伸障礙;2體節(jié)期, 神經(jīng)板標記基因N-cadherin在單倍體胚胎中的表達區(qū)域明顯增寬(圖 5j—l白色雙箭頭指示, 77.8%,n=36), 說明胚胎背部未能正常匯聚。這些結(jié)果都證明雌核發(fā)育單倍體胚胎存在原腸運動缺陷。

圖 2 金魚自交二倍體與雌核發(fā)育單倍體胚胎中scl的差異表達Fig. 2 Differential expression of scl in gynogenetic haploid and inbred diploid goldfish embryos

圖 3 金魚自交二倍體與雌核發(fā)育單倍體胚胎中g(shù)ata-1的差異表達Fig. 3 Differential expression of gata-1 in gynogenetic haploid and inbred diploid goldfish embryos

3 討論

3.1 金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎細胞的發(fā)育潛能

本研究發(fā)現(xiàn)金魚雌核發(fā)育單倍體活體胚胎循環(huán)系統(tǒng)存在不同程度的發(fā)育缺陷(圖 1), 這與其他魚類單倍體胚胎中的觀察結(jié)果相似[7,8,26]。有研究認為單倍體胚胎細胞雖具備分裂增殖的能力但缺乏發(fā)育和分化的能力[27]; 對金魚單倍體胚胎眼睛的表型差異進行統(tǒng)計分析, 推測某些發(fā)育關(guān)鍵基因在單套染色體組中只有 50% 的表達概率[6]。然而, 我們檢測到scl、gata-1、etv2[28]和flk-1等調(diào)控原始造血和血管發(fā)生的關(guān)鍵基因在金魚雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體胚胎中的起始表達時間沒有明顯的區(qū)別, 并在胚胎各個發(fā)育階段均有表達。同時, 即使在無血液循環(huán)的單倍體胚胎中仍可觀察到血細胞堆積于其背部(圖 1e), 鄰聯(lián)茴香胺染色結(jié)果也證明這些血細胞能夠表達血紅蛋白(圖 1l)。這些結(jié)果說明單倍體胚胎能夠產(chǎn)生成血管母細胞、造血干細胞、成血管細胞、紅細胞和血管內(nèi)皮細胞等。對金魚單倍體胚胎眼睛進行組織切片也發(fā)現(xiàn)其中具有各類已分化的細胞[6]。這提示單倍體胚胎細胞本身具有完全的發(fā)育潛能, 能夠產(chǎn)生終末分化的體細胞。

圖 4 金魚自交二倍體與雌核發(fā)育單倍體胚胎中flk-1的差異表達Fig. 4 Differential expression of flk-1 in gynogenetic haploid and inbred diploid goldfish embryos

3.2 金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎血液循環(huán)障礙的產(chǎn)生原因

原位雜交檢測發(fā)現(xiàn), 體節(jié)形成早期, 單倍體胚胎中scl和gata-1都能在PLM區(qū)域表達, 與二倍體胚胎相似; 但14體節(jié)期以后, 單倍體胚胎scl和gata-1的表達十分紊亂, 呈現(xiàn)出各種異常(圖 2和圖 3), 其共同特點是沒有像自交二倍體胚胎那樣逐漸表達于胚體中線, 而仍然表達于胚體的兩側(cè); 這說明金魚雌核發(fā)育單倍體胚體兩側(cè)的PLM不能正常遷移至胚體中線形成ICM。20體節(jié)期至25% OVC時期, 單倍體胚胎中scl和gata-1的表達在軀干部位逐漸減弱, 說明其原始造血干細胞和紅細胞數(shù)量減少。單倍體胚胎中的成血管細胞標記基因etv2的表達模式與scl類似, 在胚體中線表達缺失并在軀干部表達減弱[28]; 結(jié)合血管內(nèi)皮標記基因flk-1的表達情況(圖 4),可以說明單倍體胚胎中成血管細胞數(shù)量減少, 向中線遷移存在障礙, 原始體軸血管的發(fā)育受到干擾,并且血管內(nèi)皮細胞分化減少, 節(jié)間血管發(fā)育不良。綜上所述, ICM和體軸血管發(fā)育缺陷, 紅細胞數(shù)量減少及外周血管發(fā)育不全可能是導致單倍體胚胎出現(xiàn)血液循環(huán)障礙的重要原因。

圖 5 金魚自交二倍體和雌核發(fā)育單倍體胚胎匯聚延伸運動比較Fig. 5 Comparison of convergence and extension movement between gynogenetic haploid and inbred diploid goldfish embryos

3.3 廣泛的細胞運動遷移異常可能是金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎發(fā)育畸形的重要原因

脊椎動物原腸胚期, 胚胎細胞歷經(jīng)包括外包、內(nèi)卷和匯聚延伸等大規(guī)模的形態(tài)發(fā)生運動, 形成3個胚層, 為胚胎體軸建立和器官發(fā)育奠定了基礎(chǔ)[29]。外包運動在原腸末期完成, 而匯聚延伸運動在體節(jié)期仍在進行。在原腸胚期, 可以觀察到金魚單倍體胚胎外包運動受阻 (圖 5a—d), 這與其他魚類中報道的情況相似[7,8]。在原腸運動過程中, 從胚盾處最先內(nèi)卷的胚胎細胞是脊索前板前體細胞, 它們進入胚胎內(nèi)部后持續(xù)地向動物極遷移, 位于延伸最前端[30]。原位雜交檢測顯示, 脊索前板標記基因gsc在95%外包期單倍體胚胎中的表達部位較自交二倍體胚胎更加靠近植物極(圖 5e—h), 說明單倍體胚胎延伸運動受阻。N-cadherin主要表達于胚胎背部的神經(jīng)外胚層和中胚層, 是細胞匯聚到背中線所必需的關(guān)鍵基因[31]。因此, 在原腸運動完成后,可以通過N-cadherin表達區(qū)域的寬度來評估背部細胞是否正常匯聚。原位雜交檢測顯示, 2體節(jié)期單倍體胚胎中N-cadherin的表達區(qū)域明顯比自交二倍體胚胎增寬(圖 5i—l), 說明單倍體胚胎匯聚運動異常。同時, 原位雜交檢測顯示單倍體胚胎的PLM細胞在體節(jié)期不能正常遷移至胚體中線 (圖 2和圖 3)。這些結(jié)果提示金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎在進入原腸胚期后出現(xiàn)了廣泛的細胞運動遷移異常從而導致其發(fā)育畸形。由于細胞運動遷移和有序地重新組織對于包括循環(huán)系統(tǒng)在內(nèi)的各個系統(tǒng)器官形成都有重要作用, 因此可以推測單倍體胚胎中各器官的畸形嚴重程度是密切相關(guān)的。在金魚單倍體胚胎中也的確可以觀察到, 如果某個胚胎眼睛發(fā)育嚴重畸形時, 往往大腦結(jié)構(gòu)也不正常[21], 同時其軀體十分短小扭曲, 圍心腔異常膨大并不具有血液循環(huán)(圖 1e)。

造成單倍體胚胎細胞運動遷移異常的原因可能非常復雜。首先, 由于只含有單倍遺傳物質(zhì), 單倍體中與細胞運動遷移相關(guān)功能基因的表達產(chǎn)物可能不足[15]; 其次, 父母本基因組存在表觀遺傳修飾差異, 這也可能改變單倍體中與細胞運動遷移相關(guān)功能基因的時空表達模式[14]; 再次, 單倍體胚盤內(nèi)存在廣泛的非特異性細胞死亡可能影響了原腸期的細胞運動遷移[7]; 此外, 最近的研究證明只有大小合適的細胞才能在特定發(fā)育時期以最佳方式自主地遷移至合適的部位參與形態(tài)發(fā)生, 而單倍體胚胎中細胞小于同時期的二倍體細胞, 所以無法以最佳方式進行運動遷移[32]。然而, 要確定單倍體胚胎細胞運動遷移異常的具體原因仍有賴于今后深入和系統(tǒng)的研究。

另外, 在一些單倍體胚胎中可以發(fā)現(xiàn)scl+和gata-1+細胞的遷移路徑十分紊亂(圖 2j和圖 3j), 表明其成血管細胞和造血干細胞遷移過程具有隨機性, 它們的遷移路徑和最終遷移部位沒有受到精確控制, 這可能是導致單倍體胚胎群體中循環(huán)系統(tǒng)表型呈現(xiàn)多樣性的重要原因。

總之, 在本研究中我們觀察了金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育的形態(tài)學特征, 證明了原始造血和血管發(fā)生關(guān)鍵基因scl、gata-1和flk-1的表達模式在雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體胚胎中存在明顯差異, 同時發(fā)現(xiàn)單倍體胚胎在發(fā)育過程中存在廣泛的細胞遷移運動異常。這些事件可能是導致金魚單倍體胚胎循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育缺陷和血液循環(huán)障礙的重要原因, 為進一步揭示單倍體綜合癥的發(fā)生機制奠定了基礎(chǔ)。