賴 婷 聶子盈 張小雨 孫存鑫 徐驍?shù)?蔣 青 劉明陽 劉 波, 王愛民

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院, 無錫 214081; 2. 中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室, 無錫 214081; 3. 西南科技大學生命科學與工程學院, 綿陽 621010;4. 鹽城工學院海洋與生物工程學院, 鹽城 224051)

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)又稱淡水小龍蝦, 屬節(jié)肢動物門, 甲殼綱, 十足目, 鰲蝦科, 為美國中南部和墨西哥北部的土著物種, 經(jīng)由日本傳入我國, 是一種淡水經(jīng)濟甲殼動物[1,2]。近年來, 以克氏原螯蝦為主導的產(chǎn)業(yè), 經(jīng)濟效益好, 產(chǎn)業(yè)鏈長, 已經(jīng)成為江淮地區(qū)的特色產(chǎn)業(yè)[3]。隨著克氏原螯蝦這一消費熱點的持續(xù)增長, 克氏原螯蝦養(yǎng)殖的相關(guān)研究變得尤為重要。目前我國的克氏原螯蝦養(yǎng)殖主要以池塘精養(yǎng)和稻田綜合種養(yǎng)等模式為主, 在養(yǎng)殖過程中存在苗種退化, 養(yǎng)殖密度難以估算, 存在越冬饑餓、投喂不及時、不充分的現(xiàn)象。因此饑餓已經(jīng)成為克氏原螯蝦養(yǎng)殖過程中最易受到的生理脅迫之一[4]。

在過去的幾十年里, 科研人員針對饑餓對魚類生理、內(nèi)分泌和消化系統(tǒng)影響展開了大量的分析[5],許多結(jié)果表明年齡、基因型、飲食結(jié)構(gòu)及棲息環(huán)境可以改變魚體腸道微生物結(jié)構(gòu)組成, 進而對機體的生長發(fā)育和免疫調(diào)控等產(chǎn)生影響[6,7]。劉波等[8]發(fā)現(xiàn)長期饑餓會降低吉富羅非魚GIFT(Oreochromis niloticus)機體免疫和抗氧化能力, 影響羅非魚的健康; Sun等[9]在團頭魴(Megalobrama amblycephala)的饑餓實驗中發(fā)現(xiàn)饑餓會損害魚體的腸道結(jié)構(gòu)并改變其微生物群落組成, 從而影響腸道消化并造成炎癥; Semova 等[10]也發(fā)現(xiàn)斑馬魚(Danio rerio)在饑餓脅迫下, 腸道微生物多樣性呈現(xiàn)下降趨勢, 并且其微生物群組組成變化可能會影響脂肪的分解代謝和自噬水平。在饑餓對甲殼類生理的影響方面,王晨赫等[11]發(fā)現(xiàn)河蟹(Eriocheir sinensis)在饑餓初期腸道微生物多樣性會出現(xiàn)短暫上升, 而后期則呈現(xiàn)下降趨勢, 其體內(nèi)存在大量長期穩(wěn)定存在的“優(yōu)勢種群”, 在維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。目前有關(guān)饑餓對克氏原螯蝦生理功能影響的研究還比較匱乏, 饑餓脅迫對克氏原螯蝦生長及腸道健康方面的影響還有待進一步研究。因此本研究旨在通過組織病理學、高通量測序和生物信息學分析技術(shù), 探明不同程度饑餓脅迫對克氏原螯蝦生理生化和腸道健康的影響, 為克氏原螯蝦的養(yǎng)殖和投喂等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗蝦及日糧

克氏原螯蝦來源于江蘇南京浦口區(qū)林濤懷善家庭農(nóng)場, 將規(guī)格基本一致的克氏原螯蝦(20.2±0.15) g隨機分到6個養(yǎng)殖箱, 每個養(yǎng)殖箱10尾。投喂飼料為市售克氏原螯蝦商品日糧。每日以體重的2%—4%投喂顆粒飼料2次(9: 00和18: 00), 每次達飽食, 1h后移除殘餌, 在水族箱中馴化養(yǎng)殖2周后進行饑餓實驗。

1.2 飼養(yǎng)管理

克氏原螯蝦水族箱馴化14d后進行饑餓實驗,實驗過程保持日夜連續(xù)充氣增氧, 監(jiān)測水溫, 吸污以保證水質(zhì)清潔。整個飼養(yǎng)過程水質(zhì)如下: 水溫為(28.0±3)℃, pH為 6.0—8.0, 氨氮低于0.05 mg/L, 硫化氫低于0.05 mg/L, 溶解氧保持在5 mg/L以上。

1.3 樣品采集與分析

在饑餓0d、7d、14d和28d采樣, 每個時間點采集6尾蝦血淋巴測定常規(guī)生理生化指標以評定克氏原螯蝦的生理狀態(tài); 3尾蝦腸道于4%多聚甲醛固定液, 進行腸道HE染色和TUNEL細胞凋亡檢測; 3尾蝦腸道內(nèi)容物進行16SrRNA測序。

血淋巴生化指標測定使用1 mL無菌注射器從克氏原螯蝦的頭胸甲后緣刺入圍心腔, 抽取0.5 mL血淋巴, 放入1.5 mL裝有等量抗凝劑的離心管中。4℃靜置4h, 4000 r/min離心15min, 取上清液用于生理生化指標的測定。尿素(UREA)、血糖(GLU)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白(TP)和甘油三酯(TG)水平均采用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司制造的BS-400全自動生化分析儀測定。

腸道HE染色從多聚甲醛固定液中取出固定好的腸道, 修剪好后放入包埋盒內(nèi)用蒸餾水沖洗0.5h, 染色方法參照Fischer等[12]依次脫水、浸蠟、包埋和切片。HE染色過程為: (1)先用低濃度乙醇溶液處理, 逐漸提高濃度至脫水完成, 隨后將切片放入二甲苯中脫蠟; (2)數(shù)次用濃度梯度依次降低的乙醇溶液逐級復水, 處理后放入蒸餾水; (3)用蘇木素溶液處理3—8min后水洗, 水洗處理完用1%鹽酸-乙醇溶液分色, 分色后水洗; (4)0.6%氨水返藍處理后使用酒精逐級脫水; (5)脫水后用伊紅染液染色1—3min, 用乙醇溶液處理后用二甲苯處理至透明;(6)以中性樹膠使切片密封,顯微鏡觀察拍照。

腸道TUNEL細胞凋亡將多聚甲醛固定液中取出的石蠟切片用酒精固定2h后進行TUNEL檢測, TUNEL檢測方法參照袁永輝等[13]的改進方法:(1)石蠟切片在脫蠟后, 用0.1% Triton X-100和0.1%枸櫞酸三鈉混合液低溫處理5min; (2)切片在滴入TUNEL反應(yīng)混合液前用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)處理20min; (3)3% H2O2-甲醇液浸泡15min后加入山羊血清; (4)吸去多余血清, 加入POD轉(zhuǎn)換劑進行避光孵育; (5)蘇木素復染細胞核; (6)中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察凋亡細胞。

16S rRNA測序?qū)⑽r的腸道內(nèi)容物擠壓出并收集, 提取DNA進行細菌16S rRNA測序分析, 每個時間點取3個重復共12個腸道內(nèi)容物樣本, 方法參照沙玉杰[14]分析內(nèi)容包括OTU聚類、OTU抽平、OTU Venn圖分析、OTU PCAf分析、物種分類和豐度分析、物種熱圖分析、樣品復雜度分析(單個樣品復雜度分析和樣品間復雜度分析)、顯著性差異分析、LDA EffectSize分析、系統(tǒng)進化樹、NMDS分析及功能注釋等。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

在完成16S rRNA 測序后, 使用MOTHUR軟件在0.97相似度下進行聚類劃分分類單元 (Operational taxonomic unit, OTU), 應(yīng)用Ribosomal Database Project測序數(shù)據(jù)進行微生物種類劃分。通過sliva rRNA數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de/)數(shù)據(jù)庫對OTU進行比對, 血淋巴生化指標采用SPSS軟件單因子方差分析(One-way ANOVA)進行處理, 多重比較用Duncan’s進行差異顯著性檢驗, 結(jié)果用平均值±標準誤(mean±SE,n=6)表示。

2 結(jié)果

2.1 饑餓對克氏原螯蝦血淋巴生化指標的影響

由表 1可知, 血糖(GLU)水平隨著饑餓時間延長呈現(xiàn)降低趨勢(P＜0.05); 而尿素(UREA)和甘油三酯(TG)呈現(xiàn)先顯著上升后下降的趨勢, 且都在第7天達到了最大值(P＜0.05); 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)沒有發(fā)生顯著變化; 總蛋白(TP)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)呈先下降后上升的趨勢, 其中總蛋白(TP)在饑餓7d時出現(xiàn)最小值(P＜0.05)。長期處于饑餓狀態(tài)的克氏原螯蝦血淋巴生理發(fā)生紊亂。

2.2 饑餓脅迫對克氏原螯蝦腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

克氏原螯蝦腸道HE染色結(jié)果顯示(圖 1), 對照組上皮細胞與黏膜下層一起向內(nèi)形成腸絨毛, 絨毛排列相對整齊, 隨著饑餓時間的延長28d時, 克氏原螯蝦腸道上皮細胞萎縮, 肌肉層厚度減小, 腸絨毛高度呈現(xiàn)萎縮、凌亂的現(xiàn)象。

2.3 饑餓脅迫對克氏原螯蝦腸道細胞凋亡的影響

克氏原螯蝦腸道組織細胞凋亡結(jié)果, 腸道組織可見大量的TUNEL陽性細胞(圖 2), 整個細胞著色較深, 細胞核內(nèi)有較強的棕色顆粒。小龍蝦腸道組織細胞凋亡平均指數(shù)結(jié)果表明(圖 2), 與饑餓0d組比較, 饑餓7d組無顯著差異, 饑餓14d組和饑餓28d組有顯著差異, 隨饑餓時間的延長, 凋亡平均指數(shù)有上升趨勢。

表 1 饑餓脅迫對克氏原螯蝦血淋巴生化指標的影響Tab. 1 Effects of starvation stress on hemolymph physiology indexes of Procambarus clarkii (n=6)

圖 1 饑餓后克氏原螯蝦的腸道組織學結(jié)構(gòu)Fig. 1 The intestinal histological structure of Procambarus clarkii after starvation (200×)

2.4 克氏原螯蝦在不同饑餓程度下腸道微生物組成多樣性差異分析

OUT venn圖OTU (Operational Taxonomic Units)的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。由圖 3可以看出, 在0.97的相似度下, 得到了每個組的OTU個數(shù), 利用Venn圖可以展示多組別共有和各自特有OTU數(shù)目, 直觀展示樣品間OTU的重疊情況。4個不同饑餓程度12個樣品中共產(chǎn)生2317種OTU, 其中4個不同饑餓程度共同含有671種OTU。D0、D7、D14和D28樣品中獨有的OTU數(shù)量分別為78、259、133和208, 差異較為明顯。綜上可分析出, D7的腸道微生物多樣性最多, D28次之, D0最少。

圖 2 饑餓后克氏原螯蝦腸道組織TUNEL染色及凋亡平均指數(shù)柱狀圖Fig. 2 TUNEL staining (400 ×) and average apoptotic index histogram of intestinal tissue of Procambarus clarkii after starvation (n=6)

不同分類水平中物種組成及其動態(tài)變化使用基于OTU的豐度及注釋信息, 對每個樣品在各分類水平(Phylum, Class, Order, Family)上的序列數(shù)目占總序列數(shù)的比例進行統(tǒng)計, 可以有效地評估樣本的物種注釋分辨率及樣本的物種復雜度。在樣品不同分類水平柱狀圖(圖 4)中, 鑒定出21個細菌門類, 相對豐度較高(豐度大于0.5%)且12個樣品中均有分布的細菌門類有變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)和柔膜菌門(Tenericutes)。隨著饑餓程度的不斷加深, 擬桿菌門(Bacteroidetes)的種群數(shù)量出現(xiàn)顯著變化, 經(jīng)歷了先減少后增加的動態(tài)變化, 且在饑餓的第7天出現(xiàn)最小值, 第28天逐漸回到至第0天水平;厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)的種群數(shù)量則在饑餓脅迫的第7天達到最大值, 此時復雜度最高, 而在饑餓脅迫28天后下降至接近第0天水平, 復雜度也隨之降低。在綱水平上, 種群豐度變化最大的是擬桿菌綱(Bacteroidia), 其變化趨勢與擬桿菌門(Bacteroidetes)保持高度一致, 而芽孢桿菌綱(Bacilli)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和放線菌綱(Actinobacteria)微生物水平則呈現(xiàn)先顯著上升趨勢, 并在后期維持相對高位的動態(tài)平衡。在目水平上, 腸桿菌目(Enterobacteriales)和乳桿菌目(Lactobacillales) 變化較大, 其中隸屬于腸桿菌目(Enterobacteriales)的腸桿菌科(Enterobactertaceae)微生物種群數(shù)量在饑餓開始后急劇下降, 后雖有漲幅, 但仍低于初始水平。

不同門下屬水平分析如圖 5所示, 在不同程度饑餓脅迫下克氏原螯蝦腸道內(nèi)定植最多的是擬桿菌門(Bacteroidetes)下的擬桿菌屬(Bacteroides),其水平在饑餓脅迫后第7天降至最小值, 而后出現(xiàn)大幅攀升; 厚壁菌門(Firmicutes)下的鏈球菌屬(Streptococcus)在饑餓脅迫開始后出現(xiàn)繁殖速度加快, 并在后期保持較高位種群數(shù)量的穩(wěn)定; 變形菌門(Proteobacteria)下的檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)對饑餓變化最為敏感, 脅迫開始后立即降至低水平,并在后期維持低位種群數(shù)量; 同屬變形菌門(Proteobacteria)的奈瑟菌屬(Neisseria)及嗜血桿菌屬(Haemophilus)在饑餓脅迫后的數(shù)量變化上具有一致性, 出現(xiàn)小幅增殖, 隨后保持穩(wěn)定。

圖 3 OTU venn圖Fig. 3 OTU venn diagram

PICRUSt2二級通路注釋為了了解不同饑餓程度小龍蝦腸道菌群功能, 采用PICRUSt軟件對腸道菌群功能進行了預測(圖 6)。饑餓的4個實驗組, 其腸道微生物參與的代謝基本相似, 主要參與了新陳代謝(Metabolism)、環(huán)境信息加工(Environmental information processing)和遺傳信息加工(Genetic information processing)這三大功能。這些微生物為宿主克氏原螯蝦提供了包括糖代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、脂代謝(Lipid metabolism)、能量代謝(Energy metabolism)、膜運輸(Membrane transport)、轉(zhuǎn)錄(Transcription)、翻譯(Translation)、折疊、分類和降解(Folding, sorting and degradation)在內(nèi)的等42個功能。

圖 4 樣品不同分類水平中物種profiling柱狀圖Fig. 4 Species profiling histogram in different classification levels of samples

圖 5 不同門下top20屬水平的氣泡圖Fig. 5 Bubble diagrams of top20 genus levels under different phyla

圖 6 PICRUSt2二級通路注釋結(jié)果Fig. 6 PICRUSt2 secondary path annotation results

3 討論

3.1 饑餓對小龍蝦血淋巴生理的影響

在養(yǎng)殖過程中, 饑餓是一種應(yīng)激因子, 不論是長期饑餓還是短期饑餓, 都會不同程度地干擾機體內(nèi)分泌節(jié)律, 進而影響能源物質(zhì)的利用[15]。本實驗發(fā)現(xiàn), 克氏原螯蝦在長達28d的饑餓脅迫中, GLU水平隨著饑餓時間延長不斷降低, 說明糖類是維持機體生命活動的必要燃料, 在生命代謝過程中具有重要意義, 這與王春忠等[16]在長毛對蝦中的研究結(jié)果一致。此外, 在判斷機體營養(yǎng)狀態(tài)時, 一般以血淋巴總蛋白作為主要參考指標[17], 同時UREA作為其主要代謝產(chǎn)物與機體對能源物質(zhì)的調(diào)控有著密切聯(lián)系[18]。本實驗發(fā)現(xiàn)饑餓脅迫下的克氏原螯蝦TP水平呈下降后上升的趨勢, 在饑餓7d時出現(xiàn)最小值, 而蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物UREA的含量則呈現(xiàn)先上升后下降趨勢, 在饑餓7d時出現(xiàn)最大值, 兩者含量變化完全相對應(yīng)。結(jié)果表明克氏原螯蝦在面臨饑餓脅迫時, 可通過蛋白質(zhì)分解代謝為機體生命活動提供能量, 這與吳旭干等[19]對三疣梭子蟹初孵幼體的整期饑餓研究結(jié)果一致。ALT與AST作為蛋白質(zhì)和氨基酸代謝中的2種重要轉(zhuǎn)氨酶, 在衡量動物機體肝功能是否正常具有重要指示作用[20]。當動物肝細胞受損時, 其體內(nèi)ALT與AST活性會迅速增強, 并被釋放到血液中, 同時作為體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸代謝終產(chǎn)物的UREA減少, 動物肝臟細胞受到損害的程度上升[21,22]。在本實驗中, 隨著饑餓時間的延長, 克氏原螯蝦血淋巴中AST活性變化出現(xiàn)顯著差異, 在饑餓第14天出現(xiàn)最大值; ALT含量變化雖未見顯著差異, 但與AST的變化趨勢具有相似性。這說明饑餓則會導致克氏原螯蝦機體肝細胞一定程度受損, 蛋白質(zhì)和氨基酸代謝出現(xiàn)紊亂, 最終影響機體生長。TG作為機體儲存能量的載體,長期饑餓會導致其水平顯著下降[23], 本實驗隨著饑餓程度的不斷加深, 克氏原螯蝦TG水平呈現(xiàn)先顯著上升后下降的趨勢, 且在第7天達到最大值。聯(lián)系本實驗克氏原螯蝦生化組成數(shù)據(jù), 發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦在面臨饑餓脅迫時, 會通過糖異生作用, 加快蛋白質(zhì)的分解代謝, 合成大量脂類儲能物質(zhì)以應(yīng)對長期的饑餓脅迫, 這一點與朱藝峰等[24]對花鱸的周期性饑餓研究結(jié)果具有相似性。

3.2 饑餓脅迫對克氏原螯蝦腸道組織的影響

腸道是機體重要的消化器官, 各種營養(yǎng)物質(zhì)通過上皮細胞吸收進入血液, 進而供給全身的營養(yǎng)需求[25], 腸腔大小, 腸道黏膜上的褶皺高度, 肌層厚度,上皮組織細胞的數(shù)量都與機體的營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力密切相關(guān)[26]。同時腸道組織還通過腸腔上細胞膜和腸上皮細胞間的緊密連接, 介導著機體的非特異性免疫防御功能[27]。本實驗中隨著饑餓時間的延長, 克氏原螯蝦腸絨毛萎縮、凌亂, 上皮細胞凋亡指數(shù)上升, 說明饑餓脅迫不僅能夠有效誘導腸道發(fā)生顯著的形態(tài)變化以適應(yīng)食物短缺的問題, 同時細胞凋亡作為動物進化過程中保留下來的高度保守機制, 也造成腸道產(chǎn)生炎癥反應(yīng), 腸道的屏障進一步受損。另外, 在該實驗進行過程中, 28d的饑餓并沒有導致大量的克氏原螯蝦死亡, 表明克氏原螯蝦在面臨饑餓脅迫時, 可通過下調(diào)消化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能來節(jié)約能量以滿足其基本能量需求[28]。

3.3 饑餓對克氏原螯蝦腸道微生物的影響

新生動物在沒有攝取食物之前, 腸道內(nèi)沒有任何微生物,當其開口攝食后, 腸道絨毛上皮便成為微生物的集聚地, 分泌各種酶類與宿主相互依存、互惠共生[29]。與魚類等脊椎動物一樣, 克氏原螯蝦腸道微生物菌群在影響機體生長代謝、健康免疫等方面具有重要作用[30], 腸道菌群生態(tài)的失衡, 會導致蝦體內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)紊亂, 從而誘發(fā)疾病[31]。

本實驗基于16S rRNA的高通量測序技術(shù)在門水平發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦腸道是一個由好氧菌和厭氧菌組成的動態(tài)菌群。在飽食情況下變形菌門 (Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)等厭氧占絕對優(yōu)勢(90%以上), 這與李可等[32]對南美白對蝦腸道微生物群落分析結(jié)果相似。在不同程度的饑餓脅迫下, 其微生物結(jié)構(gòu)組成出現(xiàn)顯著差異。其中差異最顯著的檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)在饑餓開始后便驟降至較低水平; 厚壁菌門Firmicutes中的鏈球菌屬(Streptococcus), 其豐度隨著饑餓時間的延長不斷增加; 擬桿菌門(Bacteroidetes)中的擬桿菌屬(Bacteroides), 在饑餓脅迫的初期即第7天出現(xiàn)最小值, 后期雖有上升趨勢, 但增幅較小, 與初始水平仍有較大差距。在菌群功能上, 黃錦等[33]發(fā)現(xiàn)檸檬酸桿菌作為一種條件致病菌大量出現(xiàn)在施用化肥的養(yǎng)殖田塊中, 該菌種極易爆發(fā)大規(guī)模桿菌疾病, 而在本實驗中檸檬酸桿菌驟降至較低水平, 可能是觸發(fā)了某些腸道保護機制[34],使得致病菌數(shù)量顯著減少。另外Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)擬桿菌門(Bacteroidetes)及厚壁菌門(Firmicutes)是動物胃腸道參與食物殘余物代謝的主要細菌, 在本研究當中, 厚壁菌門(Firmicutes)種群數(shù)量出現(xiàn)了一定程度的上升, Mountfort等[36]曾指出厚壁菌門(Firmicutes)可以產(chǎn)生多糖水解酶進而促進胃腸道內(nèi)容物的分解代謝進程, 其分解產(chǎn)生的小分子糖類及脂肪酸是供給腸道組織細胞能量代謝的重要來源[37], 其種群數(shù)量在饑餓脅迫開始后的迅速增長并持續(xù)穩(wěn)定說明厚壁菌門(Firmicutes)在饑餓脅迫下克氏原螯蝦的能量代謝方面發(fā)揮了重要作用。

此外, 腸道微生物在漫長的進化過程中與宿主形成了互惠共生關(guān)系, 其作為一個環(huán)境因素參與宿主眾多營養(yǎng)代謝和免疫調(diào)控進程[38]。腸道菌群的代謝產(chǎn)物作為一種信號分子能作用于機體, 對機體進行宏觀調(diào)控, 同樣的機體營養(yǎng)狀態(tài)的改變也能反作用于腸道菌群, 從而對菌群參與的代謝途徑產(chǎn)生影響[39,40]。因此我們進一步對不同程度饑餓脅迫下的克氏原螯蝦腸道微生物群落進行功能預測分析, KEGG富集結(jié)果顯示不同程度饑餓脅迫下腸道微生物參與的代謝類型并沒有明顯規(guī)律可循, 但是注釋水平較高的糖代謝和脂代謝及氨基酸代謝等通路仍是值得關(guān)注的內(nèi)容?？蒲腥藛T在對卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)幼魚[41]的饑餓研究中發(fā)現(xiàn)短期饑餓會通過提升脂代謝途徑來供能, 氨基酸代謝途徑的增強則出現(xiàn)在長期脅迫后; 太平洋鮭(Oncorhynchusspp.)[42]在饑餓初期首先利用肝臟糖原和部分腸系膜脂肪供能, 后期則主要利用腸系膜脂肪和少量蛋白質(zhì)。有研究指出, 饑餓可以引起腸道微生物的種群數(shù)量的巨大改變以適應(yīng)自身能量需求[43], 通過比對各項指標, 我們發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)上述差異的原因可能是克氏原螯蝦機體面對饑餓做出的應(yīng)激反應(yīng)[44], 通過改變腸道菌群組成結(jié)構(gòu), 緩解機體的生物紊亂, 提高抗氧化應(yīng)激能力, 減少體內(nèi)炎癥,有效改善腸道內(nèi)的微生態(tài)。

總之, 克氏原螯蝦在面臨食物短缺問題時, 可能會通過改變能量物質(zhì)利用途徑適應(yīng)饑餓代謝過程, 同時不同程度饑餓脅迫會產(chǎn)生強烈的腸道應(yīng)激反應(yīng), 其菌群組成結(jié)構(gòu)在不同水平的物種豐度上均發(fā)生顯著變化。長期饑餓會導致腸道絨毛萎縮, 細胞凋亡指數(shù)增加, 影響蝦的健康。目前, 國際上越來越多的研究者發(fā)現(xiàn), 適度的饑餓對提高養(yǎng)殖動物抗氧化應(yīng)激和免疫水平有顯著影響, 這種改善機體健康的效應(yīng)已經(jīng)得到了廣泛關(guān)注。本研究借助高通量測序技術(shù)和生物信息學統(tǒng)計來尋找不同程度饑餓脅迫對克氏原螯蝦血淋巴生理生化及腸道微生物的影響, 有一定的代表性, 為克氏原螯蝦的健康養(yǎng)殖提供了理論參考, 同時也為進一步探明克氏原螯蝦腸道微生物動態(tài)平衡機制奠定了基礎(chǔ)。