諶 芳 仲崇超 陳姝為 張電光 呂武宏 譚肖英

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

目前, 養(yǎng)殖魚類普遍存在脂肪肝、內(nèi)臟脂質(zhì)過多和相關(guān)代謝紊亂的問題, 導(dǎo)致成活率下降、生長性能下降和抗病性下降等[1]。在脂肪分解中除了中性脂肪酶介導(dǎo)的脂解外, 溶酶體酸性脂肪酶(Lysosmal acid lipase, LAL)承擔(dān)著重要脂解功能。lal作為溶酶體中的酸性脂肪酶, 由LIPA基因編碼, 主要作用是將膽固醇酯(Cholesteryl esters, CEs)和甘油三酯(Triglycerides, TGs)水解成游離的膽固醇(Free cholesterols, FCs)和脂肪酸(Free fatty acids,FFAs)[2]。而lal在脂解反應(yīng)中, 除了水解由低密度脂蛋白(Low density lipoprotein, LDL)內(nèi)吞進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)的CEs、TGs和REs (Retinyl esters, REs)以外[3],還通過自噬分解脂滴[4]。人的LAL由372個(gè)氨基酸組成含有27個(gè)殘基的疏水信號(hào)肽[5]、6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)[6], 并且通過與高爾基體中甘露糖-6-磷酸受體結(jié)合, 靶向溶酶體發(fā)揮其生理作用[7]。目前有關(guān)LAL的研究多集中于哺乳動(dòng)物的分子結(jié)構(gòu)[5]、LIPA基因突變或缺失導(dǎo)致脂肪沉積、肝臟病變[8]、免疫機(jī)能下降[9]和冠狀動(dòng)脈疾病[10]等, 而有關(guān)lal在魚類生長發(fā)育和生理營養(yǎng)過程中所起到的作用尚不清楚。

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)肉質(zhì)細(xì)嫩、耐低溫, 是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類, 其養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加[11]。鑒于lal對(duì)脂質(zhì)代謝的重要作用, 為深入解析lal功能, 本實(shí)驗(yàn)首先克隆黃顙魚lal基因全長的cDNA序列, 進(jìn)行生物信息學(xué)分析并探討其組織表達(dá)模式, 然后從啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及活性分析研究黃顙魚lal的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式, 以期為深入解析黃顙魚lal基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚及樣品采集

本實(shí)驗(yàn)的黃顙魚分為2組, 購自武漢市農(nóng)貿(mào)市場。黃顙魚樣品采集參照本實(shí)驗(yàn)室的方法[12]。第一組黃顙魚, 取肝臟和卵巢組織用于lal基因cDNA全長序列的克隆, 取肝臟、脾臟、腎臟、腸道、腸系膜脂肪、肌肉、大腦、心臟和性腺組織用于組織表達(dá)水平的測定。第二組黃顙魚用于lal基因的啟動(dòng)子克隆, 取樣參照本實(shí)驗(yàn)室的方法[13], 隨機(jī)選取黃顙魚3尾, 麻醉后冰浴上迅速剪取尾鰭進(jìn)行總DNA提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

凝膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司; TRIzol總RNA提取試劑盒、胰蛋白酶、DNA提取試劑盒、Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑盒、DMEM培養(yǎng)基和新生胎牛血清(FBS)等購自Invitrogen公司; 其他分子試劑均購自TaKaRa公司; 化學(xué)試劑均為分析純, 購自上海國藥; 胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和氨芐青霉素等購自武漢迪躍創(chuàng)新生物有限公司。HEK293T細(xì)胞株來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.3 黃顙魚lal基因cDNA序列的克隆及測序

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已有的方法[12], 參照Invitrogen的TRIzol說明書進(jìn)行總RNA的提取。1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)檢測總RNA的質(zhì)量和純度。用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的黃顙魚lal基因序列, 用Premier 5.0分別設(shè)計(jì)3′和5′ RACE特異性引物(表 1), 通過巢式PCR反應(yīng)進(jìn)行末端的擴(kuò)增, 第一輪PCR反應(yīng)參數(shù): 95℃ 5min; 然后95℃ 30s, 55℃30s, 72℃ 1min, 25個(gè)循環(huán); 72℃ 5min。第二輪PCR反應(yīng)參數(shù): 95℃ 3min; 95℃ 30s, 57℃ 30s, 72℃1min, 30個(gè)循環(huán); 最后72℃ 5min。

1.4 序列分析

用Seqman軟件將擴(kuò)增得到的核心片段、3′ 和5′ 末端序列拼接, 從而獲得基因cDNA全長。利用NCBI進(jìn)行BLAST, 以確定該序列對(duì)應(yīng)的基因亞型(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。同時(shí), 利用NCBI中ORF finder軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)找出開放閱讀框(ORF)并翻譯成氨基酸序列。信號(hào)肽用Signal 5.0在線軟性預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 通過在線軟件Expasy(https://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測蛋白分子量大小及等電點(diǎn), NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)分析N-糖基化位點(diǎn), 使用Clustal-W軟件進(jìn)行序列比對(duì)和氨基酸同源性分析。用MEGA 5.0軟件采用鄰接法(NJ) 構(gòu)建進(jìn)化樹[14],選擇的最適進(jìn)化模型為JTT+G[15], 每個(gè)節(jié)點(diǎn)的可信值進(jìn)行1000次重復(fù)計(jì)算。

1.5 黃顙魚LAL三維結(jié)構(gòu)模型分析

利用SWISS-MODEL同源蛋白建模構(gòu)建黃顙魚LAL蛋白質(zhì)的三維模型, 選擇狗的胃脂肪酶(PDB code 1k8q.1)[16]作為合適的結(jié)構(gòu)模板, 其中兩者序列一致度達(dá)到56.84%。用VMD 1.9.2(https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/)顯示和分析得到蛋白單體的理論模型。

1.6 黃顙魚lal基因的組織表達(dá)分析

參照文獻(xiàn)[12], 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)方法檢測lal基因在黃顙魚不同組織中的表達(dá)。q-PCR反應(yīng)參數(shù): 95℃ 30s; 95℃ 5s, 57℃ 30s, 72℃30s, 40個(gè)循環(huán)。選用β-actin和ubce作為內(nèi)參基因,相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt方法計(jì)算[17]。熒光定量引物見表 1。

1.7 黃顙魚lal基因啟動(dòng)子的克隆及質(zhì)粒構(gòu)建

利用RNA連接酶介導(dǎo)的5′ cDNA末端快速擴(kuò)增(RLM-5′ RACE)方法鑒定黃顙魚lal的5′ cDNA序列和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcription start sites, TSS)。啟動(dòng)子克隆是基于上一步得到的5′末端的DNA序列及已發(fā)表的黃顙魚[18]的基因組, 實(shí)驗(yàn)過程參照本實(shí)驗(yàn)室已有的方法[13]。利用Omega試劑盒從黃顙魚尾鰭中提取基因組DNA, 并設(shè)計(jì)具有酶切位點(diǎn)的特異性引物(表 2), 將PCR產(chǎn)物和pGL3-Basic質(zhì)粒純化并使用相應(yīng)的內(nèi)切酶(Hind Ⅲ和SacⅠ)消化, 重組連接按照ClonExpressTMⅡ One Step Cloning Kit說明書操作。簡要操作步驟如下: 第一輪進(jìn)行RTPCR反應(yīng): 95℃ 3min; 95℃ 15s, 57℃ 15s, 72℃ 50s,35個(gè)循環(huán); 72℃ 3min。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板,加入含有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行第二輪PCR: 95℃3min; 95℃ 15s, 55℃ 30s, 72℃ 2min, 35個(gè)循環(huán);72℃ 3min, 獲得對(duì)應(yīng)的目的片段。將目的片段與pGL-3載體連接30min后, 轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 氨芐抗性平板篩選出陽性克隆, 送北京擎科生物科技有限公司測序。將測序后返還的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化后, 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和質(zhì)粒抽提。質(zhì)粒抽提方法參照說明書進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)共構(gòu)建4個(gè)黃顙魚lal啟動(dòng)子缺失載體, 分別命名為pGL3-554/+51、pGL3-1016/+51、pGL3-1567/+51和pGL3-2052/+51。

表 1 黃顙魚lal基因cDNA全長序列的克隆及熒光定量所用的引物Tab. 1 Primers used for lal cDNA cloning and PCR

表 2 黃顙魚lal cDNA啟動(dòng)子克隆所用到的引物Tab. 2 Primers used for lal promoter cloning of P. fulvidraco

利用JASPAR數(shù)據(jù)庫(http://jaspar.genereg.net/)預(yù)測黃顙魚lal啟動(dòng)子可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性檢測

HEK293T細(xì)胞在10% FBS-DMEM培養(yǎng)基中生長, 并置于37℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前, 將HEK293T細(xì)胞以1.2×105的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 培養(yǎng)24h, 需達(dá)到70%—80%的密度。使用LipofectamineTM2000將450 ng構(gòu)建好的質(zhì)粒和20 ng pRL-TK(內(nèi)參質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中, 陰性對(duì)照為pGL3-Basic質(zhì)粒。4h后, 更換含有10% FBS-DMEM培養(yǎng)基。24h后收集細(xì)胞,進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測, 檢測步驟參照說明書進(jìn)行。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示結(jié)果。統(tǒng)計(jì)分析之前, 采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性。利用SPSS 19.0軟件采用單因素方差分析和Duncan’s多重比較評(píng)估組織分布數(shù)據(jù),采用Student’sttest評(píng)估雙熒光活性數(shù)據(jù)中相鄰兩組之間的差異。顯著性水平為P＜0.05, 極顯著性水平為P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 黃顙魚lal cDNA的序列特征及進(jìn)化分析

本研究通過RT-PCR和RACE方法獲取lal基因的cDNA全長序列, 長度為1802 bp, 序列分析顯示它們的5′非翻譯區(qū)長度為131 bp, 3′非翻譯區(qū)長度為474 bp, cDNA序列ORF長度為1197 bp, 編碼398個(gè)氨基酸, 理論蛋白分子量為45.42 kD, 等電點(diǎn)為7.70。黃顙魚LAL蛋白序列含有一段具有23個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽、α/β水解酶折疊類結(jié)構(gòu)域, 5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(Asn35-Ile36-Ser37、Asn101-Thr102-Ser103、Asn273-Met274-Thr275、Asn320-Gln321-Ser322和Lys161-Thr162-Thr163)、2個(gè)氧陰離子孔(Leu89和Gln175)、1個(gè)“帽子”結(jié)構(gòu)域(Thr205-Val329)和“蓋子”結(jié)構(gòu)域(Phe233-Leu272), 及催化三元體(Ser174、Asp344和His373)和三個(gè)半胱氨酸殘基(Cys257、Cys265和Cys284)。根據(jù)以上主要位點(diǎn)繪制出黃顙魚LAL的氨基酸結(jié)構(gòu)示意圖(圖 1)。

圖 1 黃顙魚LAL氨基酸結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Structural diagram of LAL amino acids from P. fulvidraco

圖 2 基于NJ法構(gòu)建的脊椎動(dòng)物L(fēng)AL氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 The neighbor-joining phylogenetic tree based on the amino acid sequences from P. fulvidraco (▲) and other vertebrate species,using MEGA 5.0 with 1000 bootstrap replicates

多重序列比顯示, 黃顙魚LAL氨基酸序列與斑點(diǎn)叉尾鮰相應(yīng)氨基酸序列的相似性為85.64%, 與哺乳類的相似性為57.66%—62.77%, 其中與人的相似性為60.83%, 與大鼠的相似性為57.66%。

在進(jìn)化樹中, 哺乳類和兩棲類聚為一支, 硬骨魚獨(dú)立聚為另一支(圖 2)。同時(shí)在硬骨魚類中, 黃顙魚lal多肽與斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)親緣關(guān)系最近, 且這兩2個(gè)物種與水金線鲃(Sinocyclocheilus anshuiensis)、犀角金線魮(Sinocyclocheilus rhinocerous)和金魚(Carassius auratus)聚為一支, 其他硬骨魚類聚為另一支。

2.2 黃顙魚LAL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

LAL的三維結(jié)構(gòu)主要由3個(gè)領(lǐng)域組成, 包括α螺旋、β折疊及轉(zhuǎn)角, 3個(gè)半胱氨酸殘基Cys257、Cys265和Cys284的結(jié)合位點(diǎn)在LAL中相互接近(圖 3)。

2.3 黃顙魚lal mRNA組織表達(dá)分析

黃顙魚lal基因在多個(gè)組織中(心臟、肝臟、腦、脾臟、腎臟、肌肉、腸系膜脂肪、腸道和性腺)均有表達(dá), 其中脾臟、腸道和精巢中表達(dá)最高,表達(dá)量最低的是心臟和大腦(圖 4)。

圖 3 黃顙魚LAL蛋白三級(jí)預(yù)測Fig. 3 The three-dimensional structure prediction of LAL protein from P. fulvidraco

2.4 黃顙魚lal啟動(dòng)子序列及活性分析

本研究克隆得到2103 bp的黃顙魚lal序列, 并將其提交到在線轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(JASPAR)進(jìn)行序列分析。lal的5′ cDNA序列的第一個(gè)堿基為基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn), 其位置定義為+1。利用JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)軟件預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn), 發(fā)現(xiàn)lal啟動(dòng)區(qū)存在Sp1、PPARα、FOXO1、PPARγ、HNF4α和TFEB等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn), 同時(shí)核心啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)含有TATA盒和CCAAT盒。

通過5′缺失載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性測定, 結(jié)果顯示lal的-1507/-1016區(qū)域負(fù)調(diào)控啟動(dòng)子活性, 而-1016 bp/+51 bp區(qū)域正調(diào)控啟動(dòng)子活性(圖 5)。

圖 4 黃顙魚lal mRNA的組織表達(dá)Fig. 4 The relative mRNA levels of P. fulvidraco lal in different tissues

圖 5 黃顙魚5′ lal啟動(dòng)子區(qū)啟動(dòng)子活性Fig. 5 5′ unidirectional deletion analysis of the lal promoter region for P. fulvidraco

3 討論

3.1 lal序列的分子特征及進(jìn)化分析

本研究獲得cDNA全長為1802 bp的黃顙魚lal基因序列, 通過對(duì)其蛋白序列分析發(fā)現(xiàn), LAL蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)擁有保守的α/β水解酶折疊類結(jié)構(gòu)域, 一個(gè)活性位點(diǎn)(Gly172-His173-Ser174-Gln175-Gly176), 1個(gè)“帽子”結(jié)構(gòu)域(Thr205-Val329)和“蓋子”結(jié)構(gòu)域(Phe233-Leu272), 2個(gè)氧陰離子孔(Leu89、Gln175), 催化三元體(Ser174、Asp344、His373)和3個(gè)半胱氨酸殘基(Cys257、Cys265、Cys284), 及5個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Asn35-Ile36-Ser37、Asn101-Thr102-Ser103、Asn273-Met274-Thr275、Asn320-Gln321-Ser322、Lys161-Thr162-Thr163)。除此之外, LAL具有23個(gè)殘基的信號(hào)肽, 能夠?qū)⒃摰鞍纵斔偷絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行信號(hào)肽裂解和N-鍵糖基化[5,19]。在本研究中, 黃顙魚具有5個(gè)N-糖基化位點(diǎn), 其中除第三個(gè)Lys161-Thr162-Thr163糖基化位點(diǎn)以外, 其余4個(gè)在進(jìn)化上都非常保守[20]。蛋白質(zhì)的N-糖基化是一種新生肽鏈的共翻譯或翻譯后修飾方式, 對(duì)膜和分泌蛋白的折疊和穩(wěn)定性調(diào)節(jié)具有重要意義[21]。其中, 由Asn-X-Thr/Ser組成的N-糖基化位點(diǎn)[22], 這3種氨基酸與高爾基體中甘露糖-6-磷酸結(jié)合, 能夠識(shí)別出溶酶體表面的特定甘露糖受體[23]。當(dāng)N-糖基化位點(diǎn)中Asn273發(fā)生突變時(shí), LAL活性完全喪失[19], 這表明糖基化位點(diǎn)對(duì)LAL的功能、定位及活性至關(guān)重要。負(fù)責(zé)酶活性的催化三元體(Ser174、Asp344和His373)有2個(gè)位于蛋白質(zhì)的C-末端區(qū)域, 當(dāng)2個(gè)等位基因都存在時(shí), 幾乎所有的無義突變都會(huì)導(dǎo)致溶酶體酸性脂肪酶缺乏(Lysosomal acid lipase deficiency, LALD)[24]。在人的LAL蛋白質(zhì)序列中, 半胱氨酸殘基有助于提高LAL對(duì)底物的選擇活性[25], 而人與黃顙魚半胱氨酸數(shù)目不同, 可能由于物種的差異性。此外, 我們還發(fā)現(xiàn)黃顙魚LAL氨基酸序列上存在一個(gè)“帽子”結(jié)構(gòu)域和“蓋子”結(jié)構(gòu)域, Rajamohan等[26]認(rèn)為“蓋子”結(jié)構(gòu)域打開, LAL活性被激活, 同時(shí)移動(dòng)“蓋子”, 使底物接近催化三元體Ser174[16]。Holmes等[27]認(rèn)為來自靈長類等近親物種的LAL半胱氨酸殘基顯示出高度的序列一致性,在我們的進(jìn)化樹分析中, 黃顙魚lal與其他硬骨魚類聚為聚為一只, 哺乳動(dòng)物聚為另一大分支。

3.2 LAL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用已知的脂肪酶結(jié)構(gòu)模型來預(yù)測LAL的三級(jí)結(jié)構(gòu), 通過三級(jí)同源模型揭示了LAL結(jié)構(gòu)的保守性[23,28], 我們的研究也顯示LAL和dGL之間具有較高的氨基酸序列相似度(56.84%), 這使得基于dGL結(jié)構(gòu)構(gòu)建LAL的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí), Ataya[23]預(yù)測LAL的三級(jí)結(jié)構(gòu)中帶負(fù)電荷的Asp344與His373和Ser174形成氫鍵網(wǎng)絡(luò), 激活絲氨酸羥基。該結(jié)構(gòu)隱藏在由Gln175和Leu89主鏈的NH基團(tuán)組成的氧陰離子孔中, 它們通過形成2個(gè)短氫鍵為催化反應(yīng)的過渡態(tài)提供了穩(wěn)定的環(huán)境[29]。

3.3 lal序列的組織表達(dá)模式

了解基因的生理功能可以通過組織分布模式分析。本研究發(fā)現(xiàn), 黃顙魚lal基因在各組織中均有表達(dá), 但在脾臟、腸道和精巢中高表達(dá), 心臟和大腦表達(dá)量最低, 這與其他研究報(bào)道相同[30]。另外Ataya認(rèn)為[23]lal在精巢中高表達(dá)的原因, 可能是由于精巢組織分裂活躍, 精子細(xì)胞膜脂雙層的產(chǎn)生和降解需要持續(xù)進(jìn)行。溶酶體酸性脂肪酶能為這一過程提供能量。

3.4 lal啟動(dòng)子序列及活性分析

RNA聚合酶能夠識(shí)別真核生物的核心啟動(dòng)子,并與其結(jié)合后, 可調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄起始和效率, 保證基因轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性和精確性[31]。通?；虻腡ATA盒位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游-50 bp至-100 bp區(qū)域[32], 并且除虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和斑馬魚(Danio rerio)外, 類似TATA的基序(TTTAAA)在所有魚類中都比較保守[33]。因此識(shí)別這些核心啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄起始的一般機(jī)制的第一步[34]。在本研究中,lal核心啟動(dòng)子區(qū)存在CCAAT和TATA盒,分別位于-8 bp至-19 bp, -22 bp至-27 bp。黃顙魚lal的核心啟動(dòng)子區(qū)存在下游核心元件(Downstream core element, DCE)、轉(zhuǎn)錄起始元件(Initiator, INR),從而保證基因轉(zhuǎn)錄的正常啟動(dòng)[31]。

基因的轉(zhuǎn)錄也受轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(Transcription factor binding site, TFBS)的調(diào)控作用[35]。根據(jù)在線軟件預(yù)測, 黃顙魚lal基因的啟動(dòng)子上存在Sp1(-87 bp/-101 bp)、STAT3(-233 bp/-243 bp)和PPARα(-286 bp/-313 bp)結(jié)合位點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示5′缺失突變分析結(jié)果顯示lal的-1016 bp/+51 bp啟動(dòng)子區(qū)域正調(diào)控啟動(dòng)子活性, 這表明Sp1、STAT3和PPARα可能是lal基因啟動(dòng)子可能存在的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。Sp1屬于C2H2型鋅指蛋白家族, 它與富含GC的基序結(jié)合調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[36], Sp1能夠協(xié)同AP-2正調(diào)控lal轉(zhuǎn)錄表達(dá)[37]。STAT3作為一種轉(zhuǎn)錄因子, 正調(diào)控CPT Iα1b啟動(dòng)子活性[38]。PPARα是草魚脂肪組織甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase, ATGL)基因啟動(dòng)子活性的順式作用元件[39]。而LAL作為一種酸性脂肪酶, 將膽固醇酯(CE)和甘油三酯(TG)水解成游離的膽固醇(FC)和脂肪酸(FFA)[2], 我們可以推測STAT3和PPARα也是lal基因啟動(dòng)子活性的順式作用元件。

本研究結(jié)果顯示-1507/-1016區(qū)域負(fù)調(diào)控lal啟動(dòng)子活性。在這個(gè)區(qū)域中, 存在2個(gè)FOXO1結(jié)合位點(diǎn)(-1066 bp/-1076 bp、-1333 bp/-1343 bp)。FOXO1在調(diào)節(jié)代謝、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮中心作用, 研究表明FOXO1正調(diào)控lal的轉(zhuǎn)錄[4]。在本研究中, FOXO1結(jié)合位點(diǎn)處于黃顙魚lal啟動(dòng)子的負(fù)調(diào)控區(qū)域, FOXO1可能是黃顙魚lal基因潛在的負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子, 但需要在往后的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證。另外, 在-2052 bp/-1507 bp區(qū)域存在1個(gè)PPARγ(-1755 bp/1774 bp)和1個(gè)HNF4α(-1758 bp/-1772 bp)位點(diǎn), 值得注意的是P P A R γ結(jié)合位點(diǎn)正包含HNF4α結(jié)合位點(diǎn), 這與You等[36]報(bào)道PPARα啟動(dòng)子上 也 存 在P P A R位 點(diǎn) 包 含H N F 4 α結(jié) 果 相 似。PPARγ作為脂質(zhì)代謝過程中的一種重要轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)儲(chǔ)存具有重要作用[40], 同樣HNF4α是一種核受體轉(zhuǎn)錄因子, 在肝臟特異性基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用[41]。本研究也發(fā)現(xiàn)lal在肝臟的表達(dá)量比較高, 這提示我們PPARγ和HNF4α能夠調(diào)節(jié)lal的轉(zhuǎn)錄表達(dá), 但具體的調(diào)節(jié)方式有待深入探討。

4 結(jié)論

本研究克隆得到了lal基因的cDNA全長和5′上游啟動(dòng)子序列, 為深入了解該基因的功能提供了基礎(chǔ)。組織表達(dá)分析結(jié)果表明,lal在心、肝臟、腦、脾臟、腎臟、肌肉、腸系膜脂肪、腸及性腺等組織中都有表達(dá), 這表明lal基因?qū)S顙魚體內(nèi)的代謝調(diào)控發(fā)揮重要的作用。啟動(dòng)子序列及活性分析, 發(fā)現(xiàn)lal核心啟動(dòng)區(qū)含TATA和CCAAT盒, 存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子, 確定了lal啟動(dòng)子的-1507 bp/-1016 bp區(qū)域負(fù)調(diào)控啟動(dòng)子活性, -1016 bp/+51 bp區(qū)域正調(diào)控啟動(dòng)子活性, 表明不同的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)lal的轉(zhuǎn)錄表達(dá)有不同作用。此研究為日后深入了解魚類lal基因在脂質(zhì)代謝及相關(guān)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機(jī)制等研究提供科學(xué)依據(jù)。