黨江雨 高擘為 徐 禛 楊 航 李小勤 冷向軍

(1. 上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級教學示范中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心,上海 201306; 3. 水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心, 上海 201306)

糖類, 即碳水化合物, 是食物中最廉價的能量來源, 在很多糧食作物中含量豐富[1]。水生動物為變溫動物, 相較于陸生動物, 體內(nèi)代謝用于維持體溫的比例低, 并不需要太多碳水化合物, 故其需求量較低。研究表明魚類飼料中添加一定量的碳水化合物, 不僅可以減少飼料中蛋白質和脂肪的添加量, 節(jié)省飼料成本, 還可以提高魚類的生長性能[2,3]。淀粉因其來源廣泛, 黏合性好[4], 是水產(chǎn)飼料中使用最多的糖源。但不同來源的淀粉, 分子結構不同,其支鏈和直鏈淀粉的比例存在差異[5], 對利用率產(chǎn)生較大影響[6—8], 進而影響水產(chǎn)動物的生長性能。關于魚類對不同來源淀粉利用的相關研究在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[9,10]、大西洋鮭(Salmo salar)[11]、大口黑鱸(Micropterus salmoides)[12]和達氏鱘(Acipenser dabryanus)[13]等魚類中已有報道。由于魚類對糖的耐受能力有限, 飼料中過多的糖會對魚類造成生長減緩[14]、肝臟損傷[15]、血糖升高[16]和免疫損傷[17]等負面影響。

亞東鮭, 與褐鱒(Salmo trutta)同物異名, 屬于鮭形目(Salmoniformes)鮭科(Salmonidae)鮭亞科(Salmoninae), 原產(chǎn)自歐洲、非洲北部和西亞一些地區(qū)[18]?，F(xiàn)已分布于30多個國家和地區(qū)[19], 國內(nèi)僅天然分布于西藏海拔3000 m的亞東河中[20], 為外來引進物種。因為其在亞東河已形成自然種群, 故命名為亞東鮭, 是一種肉質鮮美, 營養(yǎng)豐富的特色養(yǎng)殖魚類。目前, 國外關于褐鱒糖類營養(yǎng)研究的報道較少,Viaplana-Marín等[21]發(fā)現(xiàn), 低蛋白質/高碳水化合物飼料組較高蛋白質/低碳水化合物飼料組褐鱒的蛋白質合成速率沒有顯著差異, 但蛋白質降解速率增加, 使得蛋白質沉積率降低; 另外, 也有一些關于褐鱒飼料脂肪來源[22—24]及脂肪替代[25,26]對其造成的影響報道。國內(nèi)關于褐鱒的營養(yǎng)需求研究僅見褐鱒幼魚[27]和成魚[28]的蛋白質和脂肪需求的報道, 尚未見到有關碳水化合物需求的報道。

本實驗以亞東鮭為研究對象, 分別以玉米淀粉和木薯淀粉為糖源, 設置不同的添加水平, 考察對生長、體組成、消化酶活性及肝臟生化指標和肝臟組織學的影響, 確定適宜淀粉種類與水平, 為開發(fā)高效亞東鮭飼料提供理論依據(jù), 推動西藏當?shù)貋問|鮭養(yǎng)殖業(yè)的進一步發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗設計與實驗飼料

實驗采用2×3雙因素設計, 分別以玉米淀粉和木薯淀粉為糖源, 設置3種淀粉水平(5%、10%和15%), 共6種等氮等脂飼料。實驗飼料配方含量見表 1。使用膨潤土和纖維素來平衡各組飼料組成。飼料原料購于浙江粵海飼料有限公司。各主要飼料原料被粉碎過60目篩后, 按配方比例稱取進行混合, 用單螺桿擠壓機(SLP-45,中國水產(chǎn)科學研究院漁業(yè)機械儀器研究所)制成粒徑2 mm的沉性顆粒飼料, 自然風干, 密封儲藏于陰涼干燥處備用。

表 1 實驗飼料配方組成及營養(yǎng)成分含量Tab. 1 Ingredients and proximate composition of experimental diets (%)

1.2 實驗魚和飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖實驗在西藏亞東縣春丕村亞東鮭繁育基地進行, 實驗魚由繁育基地提供。實驗魚用商品飼料(INICIO Plus, 粗蛋白58%, 粗脂肪15%)暫養(yǎng)馴化2周后, 選取720尾體格健壯、規(guī)格均一的亞東鮭(0.50±0.03) g, 隨機分配到18個塑料框中(長0.55 m,寬0.30 m, 高0.20 m, 水體體積0.0165 m3), 每個實驗組3個重復, 每個重復40尾魚。養(yǎng)殖模式為流水養(yǎng)殖, 水流量為12 L/min。養(yǎng)殖期間, 每天在(10:00、14:00和18.00)3個時間點進行投喂, 每天投喂量約為魚體重的2.0%—3.0%, 同時隨著水溫和攝食情況適當調(diào)整, 各框保持一致的投飼量, 每次投喂以亞東鮭不浮上水面攝食和水面下不搶食為宜。養(yǎng)殖期間每天檢測流水水質, 其基本指標如下: 溶氧＞6 mg/L, 水溫7.5—12.5℃, pH 7.5—8.0, 氨氮＜0.1 mg/L,亞硝酸鹽＜0.1 mg/L, 并每周采用虹吸法吸污2次。養(yǎng)殖實驗持續(xù)84d。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖實驗結束后, 將亞東鮭饑餓24h, 統(tǒng)計每框亞東鮭尾數(shù)并稱重, 計算增重率(WGR)、飼料系數(shù)(FCR)和成活率。每框隨機取3尾亞東鮭幼魚, 測量其體重和體長, 然后解剖取內(nèi)臟稱重, 計算肥滿度(CF)和臟體指數(shù)(HSI)。另取肝臟和腸道(全腸),-20℃冷凍保存, 用于肝臟生化指標和胃、腸消化酶活性測定。同時從每個框中隨機取6尾, 用于全魚體成分分析, 并計算蛋白質和脂肪沉積率。另取6尾魚的肝臟, 測定肝糖原含量。再取3尾魚肝臟置于波恩固定液中固定, 用于肝臟組織學觀察。

1.4 測定指標與方法

生長性能與形體指標成活率(%)=100×終尾數(shù)(尾)/初尾數(shù)(尾);

增重率(%)=100×[末體重(g)-初體重(g)]/初體重(g);

飼料系數(shù)=采食量(g)/[末體重(g)-初體重(g)];

臟體比=100×內(nèi)臟重(g)/體重(g);

肥滿度(g/cm3)=100×體重(g)/體長(cm)3;

蛋白質沉積率(%)=100×魚體蛋白質貯積量/攝入飼料的蛋白質總量;

脂肪沉積率(%)=100×魚體脂肪貯積量/攝入飼料的脂肪總量。

全魚與飼料組成全魚與飼料的水分、粗蛋白含量測定分別采用105℃常壓干燥法和凱氏定氮法(2300自動凱氏定氮儀, FOSS, 瑞典), 粗脂肪含量測定采用氯仿-甲醇抽提法, 粗灰分測定采用550℃高溫灼燒法。

胃腸道消化酶測定取胃、腸道(全腸)樣本于4℃解凍, 稀釋勻漿, 4℃離心(3000 r/min, 10min), 保留上清液, 采用試劑盒測定消化酶活性。胃蛋白酶和淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定。腸道蛋白酶活性采用福林酚法測定。

肝臟生化指標及肝糖原含量測定取肝臟樣本于4℃解凍, 稀釋勻漿, 4℃離心(3000 r/min,10min), 保留上清液, 采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定肝臟谷草轉氨酶(GOT)、谷丙轉氨酶(GPT)、總膽固醇(TCHO)和甘油三酯(TG)活性。

將肝臟樣本于4℃解凍后, 稱重, 將肝臟與堿液以1∶3的體積混合, 在沸水浴中加熱20 min, 得到水解液, 采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定肝糖原含量。

肝臟組織切片石蠟切片HE染色: 將亞東鮭肝臟樣品從固定液中取出, 用不同濃度的酒精、酒精和二甲苯混合液、二甲苯逐級脫水, 之后進行浸蠟、包埋、切片、染色等工作。染色后裝片, 待干燥后在電子顯微鏡下觀察其組織形態(tài)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS25.0軟件進行單因子方差分析和雙因素方差分析, 結果用“平均值±標準誤”表示, 其中差異顯著者進行Duncan多重比較, 差異顯著水平為P＜0.05。

2 結果

2.1 生長性能和形體指標

在養(yǎng)殖過程中, 各組存活率都在96%以上(表 2)。隨著飼料中玉米淀粉和木薯淀粉水平的提高, 增重率先上升后下降, 飼料系數(shù)則先下降后上升(P＜0.05),并在10%水平組達到最值, 其中10%木薯淀粉組增重率最高(518.81%), 飼料系數(shù)最低(1.32), 15%淀粉組的增重率顯著低于10%和5%組(P＜0.05)。在同一淀粉水平下, 2種淀粉組的增重率和飼料系數(shù)沒有顯著差異(P＞0.05)。飼料淀粉水平對增重率、飼料系數(shù)存在顯著影響(P＜0.05), 淀粉種類及其交互作用沒有顯著影響(P＞0.05), 而飼料淀粉種類和水平對成活率、臟體比和肥滿度均無顯著影響(P＞0.05)。

2.2 全魚組成和營養(yǎng)物質沉積率

各組在全魚水分、粗蛋白質、粗脂肪和粗灰分含量上均無顯著差異(P＞0.05)。飼料淀粉水平對蛋白質沉積率存在顯著影響(P＜0.05), 淀粉種類和水平對脂肪沉積率存在顯著影響(P＜0.05), 但其二者交互作用對其影響不顯著(P＞0.05)。15%水平組蛋白質沉積率顯著低于其他水平(P＜0.05); 而脂肪沉積率則隨著淀粉水平的升高先上升后下降, 10%木薯淀粉組顯著高于玉米淀粉組(P＜0.05; 表 3)。

2.3 胃腸道消化酶

在表 4中, 淀粉種類和水平及其交互作用對胃蛋白酶和胃淀粉酶活性沒有顯著影響(P＞0.05), 但淀粉水平顯著影響腸淀粉酶和腸蛋白酶活性(P＜0.05)。隨著飼料中淀粉水平的提高, 腸淀粉酶和腸蛋白酶呈現(xiàn)上升趨勢, 5%淀粉水平組的腸淀粉酶和腸蛋白酶均顯著低于其他水平(P＜0.05)。

2.4 肝臟生化指標及肝糖原

由表 5可見, 淀粉種類和水平及其交互作用對肝臟GPT、GOT活性和TCHO、TG含量均沒有顯著影響(P＞0.05)。淀粉水平對肝糖原含量存在顯著影響(P＜0.05), 隨著飼料中淀粉水平的提高, 肝糖原含量呈上升趨勢, 15%淀粉水平組顯著高于其他水平(P＜0.05)。

表 2 飼料淀粉種類和水平對亞東鮭幼魚生長性能和形體指標的影響Tab. 2 Effects of dietary starch on growth and morphological indices of brown trout juvenile

表 3 飼料淀粉種類和水平對亞東鮭幼魚全魚組成和營養(yǎng)物質沉積率的影響Tab. 3 Effects of dietary starch on body composition and nutrient retention of brown trout juvenile (%)

2.5 肝臟組織學

如圖 1所示, 隨著木薯淀粉和玉米淀粉水平的提高, 肝細胞開始腫脹, 出現(xiàn)細胞核位移和空泡化現(xiàn)象, 其中以15%淀粉組較為明顯。

圖 1 亞東鮭幼魚肝臟組織切片F(xiàn)ig. 1 Tissue slices of brown trout juvenile liver (200×)

3 討論

3.1 飼料淀粉種類和水平對亞東鮭幼魚生長性能的影響

盡管魚類對碳水化合物沒有特別的需求, 但一定量的碳水化合物當做能量被添加進魚類飼料中時, 可以減少蛋白質和脂肪作為能量物質的分解,從而使更多的蛋白質和脂肪用于魚體的生長, 提高飼料利用的效率[1,29]。在大西洋鮭(Salmo salar)[30]和鱸(Lateolabrax japonicus)[31]中的研究表明, 飼料中淀粉水平為9%和12%時, 魚體生長性能得到了顯著提升。在本實驗中, 適量的淀粉添加水平也改善了亞東鮭幼魚的生長性能, 根據(jù)增重率和飼料系數(shù),亞東鮭幼魚飼料中淀粉的適宜水平為10%, 與虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[32]對碳水化合物的需要量(12%)基本一致。而尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus×O. aureus)[33]和草魚(Ctenopharyngodon idellus)[34]飼料中碳水化合物的最適添加量可達到22%和30%以上, 遠遠高于亞東鮭, 這是因為亞東鮭屬于肉食性冷水魚類, 較雜食性和草食性魚類利用糖的能力差[2], 對碳水化合物的需要量相對較低。

此外, 淀粉的來源也會對魚類生長產(chǎn)生影響。淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種結構淀粉組成, 支鏈淀粉比直鏈淀粉更容易被酶水解, 所以兩者的比例會影響淀粉的消化利用, 從而影響水產(chǎn)動物生長[11]。Li等[35]和劉子科等[12]的研究表明, 在大口黑鱸攝入直鏈淀粉比例高的淀粉源后, 其直鏈淀粉在加工過程中形成難以被消化的抗性淀粉, 使實驗魚的餐后血糖水平較低, 從而表現(xiàn)出對直鏈淀粉比例高的淀粉源有較好的利用效果, 而虹鱒對支鏈淀粉比例高的淀粉源的利用程度更高[36]。所以, 不同魚種對不同比例的直鏈淀粉和支鏈淀粉的淀粉源利用程度不同。本實驗中10%木薯淀粉組的增重率高于玉米淀粉, 但差異不顯著, 表明亞東鮭可能對支鏈淀粉比例高的淀粉源的利用程度高, 這有待進一步研究。

表 4 飼料淀粉種類和水平對亞東鮭幼魚胃腸道消化酶的影響Tab. 4 Effects of dietary starch on digestive enzyme activities of brown trout juvenile

表 5 飼料淀粉種類和水平對亞東鮭幼魚肝臟生化指標及肝糖原的影響Tab. 5 Effects of dietary starch on liver biochemical indices and liver glycogen of brown trout juvenile

3.2 飼料淀粉種類和水平對亞東鮭幼魚全魚組成的影響

在大黃魚[37]中的研究顯示, 隨著淀粉水平的提高, 全魚脂肪含量上升。但在赤點石斑魚(Epinephelus akaara)[38]和黃鰭鯛 (Sparus latus)[39]的研究中,隨著碳水化合物水平的提高, 魚體粗脂肪含量下降。本實驗中亞東鮭全魚組成不受淀粉種類與水平的影響, 與在大菱鲆(Scophthalmus maximusLinnaeus)[40]上的報道類似。這可能是因為不同種魚類對淀粉利用能力的不同導致的。

雖然本實驗中全魚組成沒有顯著差異, 但淀粉水平顯著影響著蛋白質沉積率和脂肪沉積率: 15%淀粉組的蛋白質沉積率顯著低于其他兩個水平組,10%淀粉水平組的脂肪沉積率顯著高于其他2個水平, 這主要是由增重的差異所決定的。此外, 木薯淀粉10%組的脂肪沉積率顯著高于玉米淀粉10%組, 可能亞東鮭幼魚能更好地利用支鏈淀粉。

3.3 飼料淀粉種類和水平對亞東鮭幼魚胃腸道消化酶的影響

消化酶的活性可在一定程度上衡量魚類對飼料營養(yǎng)成分消化、吸收和利用程度。在本實驗飼料中, 淀粉種類和水平對亞東鮭胃蛋白酶及胃淀粉酶活性無顯著影響, 而腸蛋白酶及腸淀粉酶隨著淀粉水平的提高而增加。在軍曹魚(Rachycentron canadum)[4]、黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)[41]和洛氏鱥(Rhynchocypris lagowskiiDybowski)[42]中也有過類似的報道。淀粉酶活性增加, 可能是魚類為了適應高碳水化合物而做出的適應性調(diào)整[43]。

3.4 飼料淀粉種類和水平對亞東鮭幼魚肝臟生化指標影響

GOT和GPT是反映肝臟功能的重要指標, 甘油三酯和膽固醇則反映魚類機體脂肪代謝情況。在大口黑鱸[44]的研究中, 21.74%碳水化合物水平組血清GOT和GPT活性顯著高于5.93%、8.71%和11.96%碳水化合物水平組, 在翹嘴紅鲌(Erythroculter ilishaeformisBleeker)[45]中也有類似報道; 高水平的碳水化合物也導致了翹嘴紅鲌[46]和鯉(Cyprinuscarpio)[47]血清甘油三酯和膽固醇含量顯著提高。在本實驗中, 由于魚體規(guī)格小, 無法采血測定血液生理生化指標, 故只測了肝臟部分生化指標,結果表明, 淀粉種類及水平對甘油三酯和膽固醇含量及轉氨酶活性并無顯著影響, 說明亞東鮭轉化糖類為脂肪的能力較弱, 并沒有導致脂肪在肝臟的積累; 肝臟GOT和GPT活性在各組沒有顯著差異, 但由于沒有檢測其在血液中的變化, 尚不足以據(jù)此評判肝臟的健康狀況, 需結合肝臟組織學等加以綜合評判。

3.5 飼料淀粉種類和水平對亞東鮭幼魚肝臟組織學影響

在魚類攝入淀粉后, 首先會被α-淀粉酶水解為麥芽糖, 進一步水解釋放出葡萄糖, 葡萄糖在生糖作用下合成糖原儲存起來。所以攝入含高水平糖類的飼料會造成肉食性魚類肝臟糖原升高, 不利于魚類的正常代謝, 并導致生長的下降[48]。在本實驗中, 肝糖原含量隨著淀粉水平的增加顯著提高, 與Lygren等[49]、劉浩等[50]和Moreira等[51]在大西洋鮭、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)和歐洲狼鱸(Dicentrarchus labrax)中的報道一致。

Pereira等[52]在虹鱒上的研究表明, 肝細胞同時存在糖原合成和糖原分解的過程, 魚類長期攝入高糖飼料, 導致肝糖原的積累, 會使魚類產(chǎn)生營養(yǎng)脅迫。異育銀鯽(Carassiusauratus gibelio)[53]和吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)[54]在攝入高糖飼料后,肝臟細胞脂滴和糖原顆粒大量出現(xiàn), 說明魚類無法及時將糖分解代謝, 對肝臟細胞造成了一定程度損傷。在本實驗中, 隨著飼料淀粉水平增加, 肝臟細胞空泡化現(xiàn)象逐漸加重, 并且存在細胞核移位等現(xiàn)象, 這在松浦鏡鯉(Cyprinus carpio specularis)[55]、大口黑鱸[56]和南方鲇(Silurus meridionalis)[57]的研究結果中也有類似現(xiàn)象出現(xiàn), 這可能是由于肝臟負擔過重, 魚類對糖代謝負擔過大所致。

4 結論

在本實驗條件下, 以生長性能、飼料利用、胃腸道消化酶、肝臟生化指標和組織學等指標為依據(jù), 亞東鮭幼魚飼料中淀粉的適宜添加水平為10%,且木薯淀粉優(yōu)于玉米淀粉。