費(fèi)樹站 巫麗云 郭 偉2 劉昊昆 韓 冬 金俊琰 楊云霞 朱曉鳴 解綬啟

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

脂肪作為一種重要的宏量營(yíng)養(yǎng)素, 維持魚類生命活動(dòng)和提供必需脂肪酸, 為某些維生素和激素的合成提供前體物質(zhì)及在維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能方面起著重要作用[1,2]。在飼料中適宜的脂肪水平可促進(jìn)魚類生長(zhǎng), 降低餌料系數(shù), 提高蛋白質(zhì)效率,減少氮的排放, 改善魚類的健康狀況[3—5]。當(dāng)脂肪水平過(guò)高會(huì)引起蛋白質(zhì)和消化能比例失衡, 造成脂肪在肝臟和腸道的積累, 從而導(dǎo)致攝食減少, 生長(zhǎng)減緩, 危害魚體健康[6—8]。同樣, 脂肪缺乏或者過(guò)低也會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢、抗病能力減弱和對(duì)免疫造成直接影響[9,10]。隨著魚類生長(zhǎng)發(fā)育, 魚體組織器官功能不斷完善, 對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求也不斷變化, 多種魚類被報(bào)道其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中食性發(fā)生改變[11,12]。目前, 對(duì)于長(zhǎng)養(yǎng)殖周期中異育銀鯽不同生長(zhǎng)階段飼料脂肪水平的需求還未做系統(tǒng)評(píng)估, 因此對(duì)其正常生長(zhǎng)及生理代謝需求的研究意義重大。

不同魚對(duì)脂肪的需求不一致, 同種魚的不同規(guī)格對(duì)脂肪需求水平亦有差異。研究結(jié)果表明, 體重為17 g的異育銀鯽脂肪需求為4.08%—6.92%[13];小規(guī)格(約3.5 g)、中規(guī)格(約54 g)和大規(guī)格(約189 g)的異育銀鯽飼料脂肪最適水平分別為74.1、124.6和121.2 g/kg[14]。本實(shí)驗(yàn)以異育銀鯽“中科3號(hào)”為研究對(duì)象, 設(shè)計(jì)脂肪水平為4%、8%、12%、16%和20%五個(gè)梯度的飼料, 進(jìn)行為期340d的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn),比較探究異育銀鯽長(zhǎng)養(yǎng)殖周期不同階段對(duì)脂肪需求、消化酶和脂代謝的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料與制作

本實(shí)驗(yàn)制備了5種等氮飼料(蛋白質(zhì)含量34%),以秘魯魚粉、豆粕和菜粕為主要蛋白源, 以次粉和玉米淀粉為碳水化合物, 魚油和豆油等量混合作為主要脂肪源, 分別配制脂肪水平為4.22%(L4)、8.11%(L8)、12.11%(L12)、16.23%(L16)和20.30%(L20)5組飼料。所有原料進(jìn)行粉碎, 按配方比例充分混勻, 將混合后的原料過(guò)40目篩, 加水?dāng)嚢枵{(diào)制后用制粒機(jī)(SLP系列制粒機(jī), 型號(hào): SLP-45, 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械設(shè)備研究所, 上海)分批制備成不同粒徑的飼料顆粒(幼魚期飼料粒徑1.5 mm,養(yǎng)成前期和越冬后期飼料粒徑2.0 mm, 養(yǎng)成中后期飼料粒徑2.5 mm)。于60℃恒溫烘箱烘干至水分接近10%后于4℃冰箱中密封保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)飼料配方如表 1所示。

表 1 飼料配方及化學(xué)組成（%干物質(zhì)）Tab. 1 Formulation and chemical composition of the experimental diets (% dry matter)

1.2 實(shí)驗(yàn)魚及飼養(yǎng)管理

本實(shí)驗(yàn)采用的異育銀鯽“中科3號(hào)” 雌幼魚來(lái)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所官橋養(yǎng)殖基地(湖北武漢)。在湖北省石首市老河漁場(chǎng)長(zhǎng)江故道江段網(wǎng)箱進(jìn)行, 在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開始前, 將魚放置在江段網(wǎng)箱實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(網(wǎng)箱規(guī)格: 2 m×2 m×2 m)中暫養(yǎng)2周進(jìn)行馴化以適應(yīng)環(huán)境, 暫養(yǎng)飼料為5種實(shí)驗(yàn)飼料的等量混合飼料。實(shí)驗(yàn)開始前使其饑餓24h, 隨機(jī)挑選體格均勻、體質(zhì)健壯的異育銀鯽“中科3號(hào)”幼魚(初重11.33±0.03) g稱重后隨機(jī)放入20個(gè)網(wǎng)箱(60尾/箱),每個(gè)處理組4個(gè)重復(fù)。共分5個(gè)連續(xù)養(yǎng)殖階段: 第一階段為幼魚期(2016.8.7—2016.10.9, 63d取樣,D63)、第二階段為養(yǎng)成前期(2016.10.10—2016.11.28,110d取樣, D110)、第三階段越冬期(2016.11.29—2017.3.23, 223d取樣, D223)、第四階段越冬后(2017.3.24—2017.5.16, 275d取樣, D275)及第五階段養(yǎng)成中后期(2017.5.17—2017.7.20, 340d取樣,D340)。越冬期間停止投喂, 整個(gè)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)持續(xù)340d(2016.8.7—2017.7.20), 每天飽食投喂3次(08:00、13:00和18:00)。在實(shí)驗(yàn)期間每天測(cè)水溫,D63階段水溫為21.5—30.5℃, D110為17.0—21.5℃,D223為3.8—17.3℃, D275為17.3—23.5℃, D340為18.3—28.8℃。養(yǎng)殖期間溶氧維持在5.01—6.88 mg/L,氨氮小于0.43 mg/L。

1.3 樣品采集

在每一階段養(yǎng)殖結(jié)束后, 將魚饑餓24h, 撈出后用麻醉劑MS-222 (50 mg/L, Sigma, 美國(guó))麻醉, 抹干稱總重。每個(gè)網(wǎng)箱2尾魚抹干稱重, 保存在-20℃冰箱中用于體組分分析。每網(wǎng)箱挑選3尾魚, 用0.2%肝素鈉抗凝劑浸潤(rùn)過(guò)的注射器進(jìn)行尾部取血,在4℃下以轉(zhuǎn)速3000×g離心15min(Eppendorf 5417R,Germany)得到血漿, 保存于-80℃用于后期分析。隨后在冰盤上將肝臟和腸道解剖分離, 并迅速置于液氮中速凍后再轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存。

1.4 樣品分析

實(shí)驗(yàn)飼料和全魚基本組分的測(cè)定遵循AOAC(2003) 標(biāo)準(zhǔn)方法[15]。采用失重法測(cè)定干物質(zhì)含量,置于烘箱(電熱恒溫干燥箱, 精宏, 中國(guó)上海)中105℃烘干至恒重; 粗脂肪測(cè)定采用索氏抽提儀(Soxtec System HT6, Tecator, Hoganas, Sweden)進(jìn)行抽提; 粗蛋白采用凱氏定氮儀(Soxtec System HT6 Tecator, Haganas, Sweden)測(cè)定; 灰分使用馬弗爐(湖北英山縣建力電爐制造廠, 湖北英山)于550℃焚燒至恒重進(jìn)行測(cè)定, 使用氧彈測(cè)熱儀(Philipson microbomb calorimeter, Gentry Instruments Ins,Aiken, USA)測(cè)定能量值。

血漿葡萄糖和甘油三酯含量均采用全自動(dòng)生化分析儀(邁瑞B(yǎng)S-460, 中國(guó)深圳)及其標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(氧化酶法)測(cè)定, 具體方法參考儀器使用說(shuō)明。后腸淀粉酶(C016-1)測(cè)定采用南京建成商品試劑盒檢測(cè)(南京建成生物工程研究所, 中國(guó)南京)。脂肪酶活性根據(jù)南京建成生物工程研究所的試劑盒(A054-1-1)說(shuō)明書進(jìn)行, 原理是膠束中的甘油三酯在脂肪酶的作用下發(fā)生水解, 使膠束分裂, 散射光或濁度會(huì)因此降低, 速率降低和脂肪酶活性密切相關(guān)。胰蛋白酶活性測(cè)定方法參照Erlanger等[16]進(jìn)行,將1min內(nèi)吸光值下降0.01表示為1 U來(lái)表示定義胰蛋白酶活性。每個(gè)樣品測(cè)定2個(gè)重復(fù)。

所有目標(biāo)基因引物序列均見于表 2。用TRIzol試劑 (Invitrogen, USA)提取肝臟總RNA。以肝臟的總RNA為模板, 使用Invitrogen公司M-MLVFrist-Stand Synthesis System推薦的方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 反應(yīng)條件參考試劑盒的說(shuō)明書。用Light Cycle 480 Ⅱ(Roche, Basel, Switzerlad)系統(tǒng)及Light Cycle?480 SYBR?GreenⅠ Master(Roche, Basel,Switzerlad)試劑進(jìn)行RT-PCR實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。選擇β-actin為內(nèi)參基因, 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定擴(kuò)增效率及使用內(nèi)參和目的基因做標(biāo)曲?；蚨繀⒖俭w系：2 μL的cDNA稀釋液(稀釋60倍), 3 μL Light Cycle?480 SYBR?GreenⅠ Master, 0.24 μL 上下游引物及0.52 μL ddH2O, 反應(yīng)總體積為6 μL。相對(duì)mRNA表達(dá)量參考文獻(xiàn)[17], 各階段基因的相對(duì)表達(dá)量以L4為對(duì)照組。

表 2 RT-qPCR所用引物Tab. 2 Primers used in RT-qPCR

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式(mean±SE)表示, 進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 以P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著, 當(dāng)差異顯著時(shí)則進(jìn)行Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果

2.1 飼料脂肪水平對(duì)長(zhǎng)養(yǎng)殖周期異育銀鯽“中科3號(hào)”生長(zhǎng)性能和魚體成分的影響

由表 3可知, 在幼魚期(D63), 飼料脂肪水平對(duì)異育銀鯽的生長(zhǎng)性能有顯著影響, 其增重率、特定生長(zhǎng)率和飼料效率均隨著脂水平的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì), 且在水平脂肪為8%時(shí)顯著高于其他各處理組(P＜0.05), 攝食率在該養(yǎng)殖階段無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。在養(yǎng)成前期(D110), 隨著飼料脂肪水平的升高, 增重率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),且在脂肪水平為12%時(shí)達(dá)到最大, 而特定生長(zhǎng)率、攝食率和飼料效率在該階段無(wú)顯著差異(P＞0.05)。在越冬期(D223), 異育銀鯽的生長(zhǎng)性能在各處理組中無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。在越冬后期(D275)和養(yǎng)成中后期(D340), 不同脂肪水平飼料對(duì)魚體生長(zhǎng)性能和飼料利用均無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

由表 4可知, 在幼魚期(D63), 飼料脂肪水平對(duì)異育銀鯽的粗蛋白、粗脂肪、灰分和水分含量均無(wú)顯著影響(P＞0.05)。在養(yǎng)成前期(D110), 魚體粗蛋白、粗脂肪和灰分含量受到飼料脂肪水平的顯著影響, 其中粗蛋白含量在L8和L16組顯著低于其他各組, 魚體粗脂肪含量隨著飼料脂肪水平的提高呈升高的趨勢(shì), 且在L16組顯著高于其他各處理組,水分含量隨著脂肪水平的升高而下降, 且低脂肪水平L4組異育銀鯽的水分含量顯著高于其他各處理組(P＜0.05)。在越冬期(D223), 各處理組魚體組分均無(wú)顯著差異。在養(yǎng)成中后期(D340), 飼料脂肪水平對(duì)各處理組異育銀鯽魚體粗蛋白、水分和灰分含量均無(wú)顯著影響(P＞0.05), 但隨著飼料脂肪水平的提高, 魚體粗脂肪含量顯著升高(P＜0.05)。

表 3 飼料脂肪水平對(duì)異育銀鯽“中科3號(hào)”生長(zhǎng)性能的影響Tab. 3 Effects of dietary lipid on growth performance of gibel carp

表 4 飼料脂肪水平對(duì)異育銀鯽魚體基本組分的影響(% 濕重)Tab. 4 Effects of dietary lipid on body composition (% wet weight) of gibel carp

2.2 飼料脂肪水平對(duì)長(zhǎng)養(yǎng)殖周期異育銀鯽“中科3號(hào)”血漿生化指標(biāo)的影響

如圖 1所示, 在幼魚期(D63), 異育銀鯽血漿葡萄糖水平隨著飼料脂肪水平的升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì),并在脂肪水平為20%時(shí)最低(P＜0.05), 甘油三酯含量隨飼料脂肪水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì),在脂肪水平為12%時(shí)甘油三酯含量最高。在養(yǎng)成前期(D110), 異育銀鯽血糖水平隨飼料脂肪水平的升高呈現(xiàn)先上升后下降, 在L20組顯著降低(P＜0.05),異育銀鯽血漿甘油三酯含量在各組間均無(wú)顯著差異。在越冬期(D223), 不同飼料脂肪水平對(duì)越冬期異育銀鯽血糖和甘油三酯含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。在越冬后(D275), 異育銀鯽血糖水平隨飼料脂肪水平的升高而升高, 且在L20組顯著升高(P＜0.05), 甘油三酯呈相同趨勢(shì), 但差異不顯著(P＞0.05)。在養(yǎng)成后期(D340), 異育銀鯽血糖水平隨飼料脂肪水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì), 并在L16組中達(dá)到最高(P＜0.05), 而各處理組甘油三酯含量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.3 飼料脂肪水平對(duì)長(zhǎng)養(yǎng)殖周期異育銀鯽“中科3號(hào)”腸道消化酶活性的影響

如圖 2所示, 在幼魚期(D63), 異育銀鯽腸道胰蛋白酶和脂肪酶活性隨飼料脂肪水平的升高呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì), 而淀粉酶活性隨脂肪水平的升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì), 且三者酶活性均在L20組最高(P＜0.05)。在越冬期(D223), 異育銀鯽腸道胰蛋白酶活性隨飼料脂肪水平的上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì), 且在L16組顯著高于其他處理組(P＜0.05)。在養(yǎng)成中后期(D340), 異育銀鯽腸道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性在各個(gè)處理組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.4 飼料脂肪水平對(duì)長(zhǎng)養(yǎng)殖周期異育銀鯽“中科3號(hào)”脂代謝相關(guān)基因的影響

如圖 3所示, 脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因：在幼魚期(D63)和越冬后期(D275), 異育銀鯽肝fatpmRNA相對(duì)表達(dá)量隨飼料脂肪水平的升高呈現(xiàn)先上升后下降, 且均在L8組達(dá)到最高(P＜0.05)。

圖 1 飼喂不同脂肪水平飼料異育銀鯽血糖濃度和血漿甘油三酯水平Fig. 1 Plasma glucose and triglycerides of gibel carp fed with different lipid diets

圖 2 不同生長(zhǎng)階段異育銀鯽腸道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性Fig. 2 The activities of trypsin, lipase and amylase in intestinal tract of gibal carp at different growth stages, respectively (n=8)

圖 3 飼料脂肪水平對(duì)異育銀鯽肝臟脂代謝相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 3 Effect of dietary lipid levels on hepatic lipid metabolism related genes expression of gibel carp

脂肪合成相關(guān)基因：在幼魚期(D63), 異育銀鯽肝臟轉(zhuǎn)錄因子pparγ和脂肪酸合成酶fasmRNA相對(duì)表達(dá)量隨著飼料脂肪水平的上升呈先上升后下降的趨勢(shì), 且均在L8組達(dá)到最大(P＜0.05)。越冬后期(D275), 異育銀鯽肝臟轉(zhuǎn)錄因子pparγmRNA相對(duì)表達(dá)量隨著脂肪水平的上升呈先升高后下降的趨勢(shì), 且在L8組達(dá)到最大, 脂肪酸合成酶fasmRNA相對(duì)表達(dá)量隨脂肪水平增加而下降, 且在L20組最低(P＜0.05)。

脂肪分解相關(guān)基因：在幼魚期(D63), L4組異育銀鯽肝臟cpt1a和lplmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于其他各處理組(P＜0.05), 而脂肪水平為8%、12%、16%和20%處理組之間無(wú)顯著差異。越冬后期(D275), 異育銀鯽cpt1amRNA相對(duì)表達(dá)量隨著飼料脂肪水平的升高呈先升高后下降的趨勢(shì), 且L8和L12組顯著高于其他各處理組(P＜0.05), 異育銀鯽肝臟lplmRNA相對(duì)表達(dá)量在各處理組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

3.1 長(zhǎng)養(yǎng)殖周期異育銀鯽“中科3號(hào)”的脂肪需求

本研究表明, 飼料脂肪水平對(duì)異育銀鯽幼魚期和養(yǎng)成前期生長(zhǎng)性能有顯著影響, 分別在飼料脂肪水平為8%和12%時(shí)的增重率達(dá)到最優(yōu), 而飼料脂肪水平對(duì)越冬期、越冬后期和養(yǎng)成后期異育銀鯽的生長(zhǎng)性能和飼料利用均無(wú)顯著影響, 表明異育銀鯽不同生長(zhǎng)階段對(duì)脂需求有差異, 且飼料脂肪水平的變化對(duì)大規(guī)格異育銀鯽的生長(zhǎng)和飼料利用影響較小。本實(shí)驗(yàn)在自然水域條件下養(yǎng)殖, 在D110—D223階段, 由于水溫逐漸降低, 異育銀鯽的攝食率降低,故其生長(zhǎng)減緩, 在長(zhǎng)達(dá)113d的D275越冬階段, 停止投喂異育銀鯽, 其生長(zhǎng)幾乎停滯, 而后在越冬后期,水溫逐漸回暖, 攝食率又逐漸上升。有研究表明,“越冬綜合征”是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)面臨的潛在威脅, 越冬魚類面臨低溫和饑餓的雙重脅迫, 使機(jī)體免疫力降低從而導(dǎo)致大量死亡[18]。在本實(shí)驗(yàn)中, 飼料脂肪水平的變化對(duì)魚體水分和灰分的影響較小, 除越冬期外, 飼料脂肪水平的提高導(dǎo)致魚體脂肪含量的沉積增多。膳食脂肪是重要的能量來(lái)源, 為機(jī)體提供必需脂肪酸和磷脂, 在魚類營(yíng)養(yǎng)中發(fā)揮重要作用[19]。適宜的脂肪添加量對(duì)維持魚類生命活動(dòng)十分關(guān)鍵,過(guò)高或者過(guò)低的添加量都會(huì)對(duì)魚體造成負(fù)面影響[20]。大量的研究表明, 魚類攝入過(guò)量的飼料脂肪會(huì)導(dǎo)致脂肪在內(nèi)臟、肝臟和肌肉大量沉積, 從而引發(fā)機(jī)體代謝負(fù)擔(dān)和氧化損傷, 故抑制生長(zhǎng)[1,5,21,22]?；诒狙芯坎煌L(zhǎng)階段異育銀鯽的生長(zhǎng)性能和飼料利用, 根據(jù)異育銀鯽不同生長(zhǎng)階段對(duì)飼料脂肪的添加水平應(yīng)做適當(dāng)調(diào)整, 且最適脂肪添加水平在8%—12%。

3.2 飼料脂肪對(duì)長(zhǎng)養(yǎng)殖周期異育銀鯽“中科3號(hào)”血漿生化活性的影響

魚類血漿生化指標(biāo)反映了其生理代謝的變化,并與魚的種類、營(yíng)養(yǎng)狀況和生長(zhǎng)環(huán)境相關(guān)。脂類在魚類血液中以甘油三酯的形式存在和運(yùn)輸, 其含量代表脂肪在體內(nèi)的代謝狀況; 血漿葡萄糖水平的變化反映魚體對(duì)糖的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝情況, 其含量是機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的重要指標(biāo)之一[23]。在本研究中, 在幼魚期, 魚體血漿葡萄糖水平隨著飼料脂肪水平的升高而顯著降低, 甘油三酯含量隨飼料脂肪水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì), 表明過(guò)高的飼料脂肪水平, 葡萄糖代謝和脂質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)的反應(yīng)受到抑制。其原因可能是消化脂肪的膽汁分泌異常或者肝功能受損, 阻礙了甘油三酯從肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)到血液,導(dǎo)致血液甘油三酯含量降低。這說(shuō)明高水平的飼料可能造成肝功能受損, 致使魚體代謝抑制, 這與葉坤等[24]和甘輝等[25]的研究結(jié)果相似。而飼料脂肪水平對(duì)養(yǎng)成前期、越冬期、越冬后期和養(yǎng)成后期異育銀鯽的血漿甘油三酯均無(wú)顯著影響, 但是對(duì)血漿葡萄糖水平在高脂肪水平飼料中有顯著上升的趨勢(shì), 表明不同生長(zhǎng)階段的異育銀鯽對(duì)脂肪的利用能力有差異。

3.3 飼料脂肪對(duì)長(zhǎng)養(yǎng)殖周期異育銀鯽“中科3號(hào)”消化酶活性的影響

腸道是魚類消化吸收的主要場(chǎng)所, 魚類腸道消化酶的活性高低直接決定了魚類對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力, 不同食性魚類研究中發(fā)現(xiàn)飼料脂肪水平對(duì)魚類腸道脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性均有一定程度的影響, 且各研究結(jié)果差異較大[26,27]。在本研究中, 幼魚期魚體腸道脂肪酶受到飼料脂肪水平的顯著影響, 隨脂肪水平的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。有研究表明, 消化酶活力與魚類攝食狀態(tài)、消化道結(jié)構(gòu)和餌料中底物的量有關(guān)[28]。本實(shí)驗(yàn)中幼魚期的異育銀鯽脂肪酶在最高飼料脂肪水平組其活力最大, 這可能與飼料中脂肪含量較高有關(guān), 魚體需要合成更多的脂肪酶以消化吸收高脂。而在越冬后和養(yǎng)成中后期, 脂肪水平對(duì)腸道脂肪酶活性的影響不顯著, 且脂肪酶活性要高于幼魚期脂肪酶的活性, 表明幼魚期異育銀鯽對(duì)脂肪的需求量較低, 本實(shí)驗(yàn)幼魚期的生長(zhǎng)性能也證實(shí)了該觀點(diǎn)。周建成[14]的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似, 異育銀鯽通過(guò)提高自身消化酶活性以響應(yīng)飼料脂肪水平的提高。在本實(shí)驗(yàn)中, 幼魚期異育銀鯽腸道胰蛋白酶和淀粉酶活性要高于越冬期和養(yǎng)成中后期的異育銀鯽, 表明幼魚期的異育銀鯽對(duì)蛋白和能量依賴性更強(qiáng), 這可能與該階段處于生長(zhǎng)旺盛期有關(guān)。

3.4 飼料脂肪對(duì)長(zhǎng)養(yǎng)殖周期異育銀鯽“中科3號(hào)”脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

肝臟是魚類脂質(zhì)代謝最為活躍的器官, 且肝臟的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程, 包括脂質(zhì)的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等[29]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)D63和D275兩個(gè)生長(zhǎng)階段的異育銀鯽肝臟脂肪代謝相關(guān)基因進(jìn)行定量分析, 通過(guò)比較幼魚期和恢復(fù)攝食后越冬后期的異育銀鯽生理代謝差異, 比較研究異育銀鯽生長(zhǎng)過(guò)程中較長(zhǎng)時(shí)間跨度里對(duì)脂肪利用的差異。血漿生化參數(shù)的變化可作為機(jī)體代謝和生理狀態(tài)的指標(biāo), 其變化與魚類的營(yíng)養(yǎng)狀況和新陳代謝密切相關(guān)[30]。在本實(shí)驗(yàn)中, 幼魚期的異育銀鯽血漿甘油三酯含量也隨著飼料脂肪水平的升高呈先升高后下降的趨勢(shì), 表明適宜的脂肪水平能夠增強(qiáng)幼魚期異育銀鯽的脂代謝水平, 而過(guò)高或過(guò)低均導(dǎo)致脂肪代謝減弱,除幼魚期外, 異育銀鯽在其他生長(zhǎng)階段對(duì)脂肪水平的變化不敏感。幼魚期的異育銀鯽血糖水平隨著飼料脂肪的提高而顯著降低, 這可能與飼料淀粉含量降低有關(guān); 而養(yǎng)成前期、越冬后期及養(yǎng)成中后期的異育銀鯽血糖水平在較高脂肪水平組有顯著提高, 這可能與較大規(guī)格的異育銀鯽對(duì)脂肪的耐受性較高有關(guān), 過(guò)多的脂肪攝入導(dǎo)致脂肪的在體內(nèi)沉積,多余的脂向糖轉(zhuǎn)化, 導(dǎo)致血糖升高, 本實(shí)驗(yàn)的全魚脂肪含量結(jié)果證實(shí)了該觀點(diǎn)。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(fatp1) 是整合的跨膜蛋白, 通過(guò)調(diào)控脂肪酸的攝入和酯化, 促進(jìn)脂肪酸跨膜運(yùn)輸, 參與脂質(zhì)分布與沉積, 且受過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(ppar)、激素和細(xì)胞因子等物質(zhì)的調(diào)控[31]。在本研究中, 幼魚期和越冬后期的異育銀鯽肝臟fatp1的轉(zhuǎn)錄水平隨脂肪水平的上升呈現(xiàn)先上升后下降, 且均在L8組mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。pparγ是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子, 對(duì)調(diào)節(jié)脂肪生成和促進(jìn)脂質(zhì)儲(chǔ)存至關(guān)重要, 在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮中介作用[32]。fas作為脂肪合成的關(guān)鍵酶, 在幼魚期和越冬后期異育銀鯽肝臟的轉(zhuǎn)錄水平均隨著飼料脂肪水平的升高呈先升高后下降, 且在脂肪水平為8%時(shí)顯著上調(diào), 表明異育銀鯽攝入過(guò)低或者過(guò)高的飼料脂肪均會(huì)顯著抑制脂肪合成。脂蛋白酯酶(lpl)是脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶, 在脂肪分解代謝中起關(guān)鍵作用, 直接調(diào)控機(jī)體脂代謝和脂質(zhì)的沉積[33]。在本研究中,lpl的轉(zhuǎn)錄水平在幼魚期顯著受到飼料脂肪水平的影響, 且在L4組其表達(dá)水平最低, 與本研究結(jié)果相似, 在黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)和大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)的研究中發(fā)現(xiàn), 脂肪水平的升高會(huì)顯著提高肝臟lpl的表達(dá)量[30,34,35], 表明幼魚期異育銀鯽通過(guò)抑制脂肪分解來(lái)響應(yīng)脂肪攝入不足以滿足生理需求。cpt1是調(diào)控線粒體脂肪酸氧化的關(guān)鍵基因, 其異構(gòu)體之一cpt1a主要在肝臟中表達(dá)[36,37]。在本實(shí)驗(yàn)中, 幼魚期的異育銀鯽肝臟cpt1a的轉(zhuǎn)錄水平在L4組顯著低于其他各組, 而在越冬后期隨飼料脂肪水平的升高其轉(zhuǎn)錄水平先升高后下降。有研究表明, 草魚幼魚對(duì)低脂攝入的適應(yīng)策略是通過(guò)誘導(dǎo)糖酵解來(lái)提供乙酰輔酶A, 增加脂質(zhì)合成(pparγ和fas)和抑制脂質(zhì)分解(cpt1a和lpl)來(lái)維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[38]。

綜上所述, 不同生長(zhǎng)階段的異育銀鯽對(duì)脂肪的需求量略有差異, 幼魚期的需求水平較低, 而養(yǎng)成前期其需求量較高, 最適脂肪水平在8%—12%。幼魚期異育銀鯽對(duì)脂肪的變化更為敏感, 脂肪攝入過(guò)低或過(guò)高均會(huì)導(dǎo)致脂代謝紊亂, 而較大規(guī)格的異育銀鯽對(duì)應(yīng)脂肪的攝入有更完善的適應(yīng)策略。