李佳歡，齊素貞，吳黎明，黃少康,*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350000 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093

蜜蜂(Apis)是一種對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)十分重要的授粉昆蟲(chóng)[1-2]，同時(shí)蜜蜂生產(chǎn)的蜂蜜、蜂花粉、蜂王漿和蜂膠等蜂產(chǎn)品均是具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的綠色保健食品[3]。隨著全球污染的日益加重，蜜蜂也遭受著環(huán)境污染帶來(lái)的生存壓力以及多種病蟲(chóng)害的侵襲，由此引發(fā)的蜂群崩潰綜合癥(Colony Collapse Disorder)在全球范圍內(nèi)引起了廣泛關(guān)注[4-6]。在眾多影響蜜蜂健康的因素中，殺蟲(chóng)劑的使用一直具有很大的爭(zhēng)議。殺蟲(chóng)劑是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)物質(zhì)，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不可缺少的重要組成。自19世紀(jì)70年代以來(lái)，有機(jī)合成農(nóng)藥的迅速發(fā)展使得農(nóng)藥的種類和性質(zhì)都發(fā)生了翻天覆地的變化，大量廣泛施用農(nóng)藥造成了環(huán)境殘留的問(wèn)題，且有些藥劑會(huì)污染植物的花粉和花蜜，導(dǎo)致蜜蜂暴露風(fēng)險(xiǎn)的增加[7]。

氟蟲(chóng)腈(fipronil)是苯基吡唑類的代表性殺蟲(chóng)劑，化學(xué)名稱為5-氨基-1-(2,6-二氯-4,4,4-三氟甲基苯基)-4-三氟甲基亞硫?；吝?3-腈。氟蟲(chóng)腈在水體和土壤中降解緩慢，半衰期較長(zhǎng)[8]，極易在環(huán)境及作物中蓄積[9]。鑒于氟蟲(chóng)腈的殘留和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，歐盟規(guī)定氟蟲(chóng)腈不得用于人類食品產(chǎn)業(yè)鏈的畜禽養(yǎng)殖，我國(guó)亦規(guī)定其在蔬菜中的最大殘留限量(MRL)為0.02 mg·kg-1[10]，且自2009年10月1日起，除衛(wèi)生用、玉米等部分旱田種子包衣劑外全面限制使用氟蟲(chóng)腈[11]。雖然氟蟲(chóng)腈的使用量大幅降低，但近幾年我國(guó)多地土壤及蔬菜中氟蟲(chóng)腈檢出率依然較高(違禁農(nóng)藥不合格率中氟蟲(chóng)腈占比14.97%)[12]，如重慶近郊農(nóng)用地的部分普通白菜中氟蟲(chóng)腈的殘留量達(dá)1.312 mg·kg-1[13]，華南某市部分蔬菜基地土壤中氟蟲(chóng)腈的殘留量最高可達(dá)33.09 mg·kg-1[14]。

氟蟲(chóng)腈以昆蟲(chóng)γ-氨基丁酸(GABA)受體為作用靶點(diǎn)，通過(guò)與GABA受體非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，可以干擾受體門控氯離子通道，導(dǎo)致昆蟲(chóng)神經(jīng)和肌肉過(guò)度興奮而死亡[15]。由于這一特殊的作用機(jī)制，氟蟲(chóng)腈對(duì)甲殼類水生生物和蜜蜂具有極高風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道，氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂劇毒，其對(duì)蜜蜂的急性經(jīng)口半數(shù)致死劑量(LD50)為0.00383 μg·蜂-1[16]，這種高致死作用可能是導(dǎo)致法國(guó)20世紀(jì)90年代蜜蜂大量死亡的重要原因[17]。除較高的急性致死毒性外，亞致死劑量的氟蟲(chóng)腈亦可顯著影響蜜蜂的健康。研究發(fā)現(xiàn)8 μg·L-1的氟蟲(chóng)腈會(huì)引起工蜂癲癇、震顫和麻痹，運(yùn)動(dòng)能力下降，雄蜂生育能力下降[18-19]；2.5 μg·L-1的氟蟲(chóng)腈還可影響蜜蜂咽下腺的形態(tài)以及蜜蜂腸道菌群多樣性[20-21]。這些作用劑量低于環(huán)境中氟蟲(chóng)腈的殘留水平，因此，環(huán)境殘留水平上氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。

蜜蜂是一種敏感的生物指示物，其不同發(fā)育階段對(duì)污染物的響應(yīng)可能不同，目前關(guān)于氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)和幼齡工蜂的毒性作用研究還很缺乏。因此，本研究以意大利蜜蜂幼蟲(chóng)和新出房成年工蜂為研究對(duì)象，采用人工飼喂的方法研究了亞致死劑量下氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)及工蜂的慢性毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟蟲(chóng)腈可顯著干擾蜜蜂幼蟲(chóng)的發(fā)育，幼蟲(chóng)化蛹率顯著降低、死亡率顯著增高(P<0.05)；幼齡工蜂對(duì)氟蟲(chóng)腈的耐受濃度相對(duì)較高，暴露7 d時(shí)各處理組中死亡率均較低(<20%)，但當(dāng)暴露時(shí)間延長(zhǎng)至14 d時(shí)，高濃度(10 μg·L-1)處理組中蜜蜂死亡率高達(dá)(65.0±17.7)%，這說(shuō)明氟蟲(chóng)腈對(duì)幼齡工蜂具有一定的時(shí)間累積毒性(time reinforced toxicity, TRT)效應(yīng)。此外，本文還檢測(cè)了整只幼蟲(chóng)及7 d、14 d時(shí)幼齡工蜂的頭腹部組織的氧化應(yīng)激酶超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)、解毒酶谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)及乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的變化，結(jié)果表明在本研究條件下，氟蟲(chóng)腈在低暴露劑量下即可顯著干擾蜜蜂幼蟲(chóng)和成蜂機(jī)體穩(wěn)態(tài)，引發(fā)顯著的氧化損傷和神經(jīng)毒性。本研究一方面補(bǔ)充了亞致死劑量下氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)和成蜂風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估數(shù)據(jù)的不足，另一方面可為未來(lái)指導(dǎo)氟蟲(chóng)腈的安全使用和管理制定提供參考。此外，本研究也揭示了蜜蜂不同發(fā)育階段對(duì)農(nóng)藥的敏感性差異，未來(lái)可為不同作用機(jī)理、不同施用方式的農(nóng)藥或環(huán)境污染物制定特異的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，提高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作的精準(zhǔn)化。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試生物與試劑

意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所蜂場(chǎng)提供。氟蟲(chóng)腈原藥(97%純度)購(gòu)自海利爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，色譜純級(jí)丙酮購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，葡萄糖和果糖購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司，酵母提取物購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，水為娃哈哈純凈水，121 ℃濕熱滅菌后使用；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P006)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；酶活力測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 氟蟲(chóng)腈暴露濃度的設(shè)置

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氟蟲(chóng)腈對(duì)意大利蜜蜂的48 h-LD50為0.00383 μg·蜂-1。結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究中蜜蜂幼蟲(chóng)的氟蟲(chóng)腈暴露濃度為10-3、10-2、0.1、1和10 μg·L-1；成蜂的暴露濃度為1、5和10 μg·L-1。

藥液配制：以丙酮為溶劑，配制濃度為1 000 mg·L-1的氟蟲(chóng)腈儲(chǔ)備液。以蜜蜂幼蟲(chóng)人工配方飼料為稀釋劑，配制含氟蟲(chóng)腈濃度為10-3、10-2、0.1、1和10 μg·L-1的幼蟲(chóng)試驗(yàn)飼料；以50%蔗糖溶液為稀釋溶劑，配制氟蟲(chóng)腈濃度分別為1、5和10 μg·L-1成蜂試驗(yàn)藥液；以不含丙酮和不含氟蟲(chóng)腈的幼蟲(chóng)飼料或50%蔗糖溶液為空白對(duì)照。

1.3 蜜蜂幼蟲(chóng)的暴露與培養(yǎng)

幼蟲(chóng)暴露處理參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)頒布的OECD 237準(zhǔn)則、中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 3085—2017)和本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的方法進(jìn)行[22-23]。簡(jiǎn)言之試驗(yàn)開(kāi)始3 d前，將隔王板放入實(shí)驗(yàn)蜂群，并在隔王板間放入一張空蜂脾，隨后將蜂王移入并限制其在空脾上產(chǎn)卵12 h；控王產(chǎn)卵結(jié)束后，將蜂王移出，隔王板和卵脾保持在蜂箱內(nèi)待卵孵化。3 d后，蜂卵孵化為1日齡(d)幼蟲(chóng)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始。將1 d幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至預(yù)先準(zhǔn)備好的每孔含20 μL人工飼料的48孔板中，并在人工培養(yǎng)箱中(35 ℃±1 ℃，相對(duì)濕度95%)培養(yǎng)，2 d時(shí)不飼喂，3 d時(shí)剔除死亡幼蟲(chóng)，將同批次備用健康幼蟲(chóng)補(bǔ)入并飼喂20 μL含氟蟲(chóng)腈的飼料；隨后在第4、5和6天時(shí)分別飼喂每只幼蟲(chóng)30、40和50 μL含氟蟲(chóng)腈的幼蟲(chóng)飼料。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)蜂群，每16只幼蟲(chóng)來(lái)自一個(gè)蜂群，設(shè)為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)暴露濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共計(jì)48只幼蟲(chóng)。

在飼喂期間每天記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)，以移蟲(chóng)針輕觸幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)不動(dòng)則認(rèn)為死亡。試驗(yàn)開(kāi)始后的第7天，停止飼喂，第8天時(shí)將其轉(zhuǎn)移至24孔板中化蛹，每天檢查蛹的死亡和發(fā)育情況，更換無(wú)菌紙，保證潔凈化蛹環(huán)境，統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)最終的化蛹率和羽化率。重復(fù)此實(shí)驗(yàn)，在第8天時(shí)收集幼蟲(chóng)樣本，經(jīng)pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液潤(rùn)洗擦干后，-80 ℃冷凍保存待后續(xù)生化指標(biāo)分析。

1.4 新出房工蜂的暴露與培養(yǎng)

暴露開(kāi)始前，將蜂群中待出房的封蓋子脾轉(zhuǎn)移至人工培養(yǎng)箱中(35 ℃±1 ℃，相對(duì)濕度50%)羽化。工蜂出房后24 h內(nèi)，將其轉(zhuǎn)移至貯蜂籠內(nèi)。每籠20只幼齡工蜂，饑餓2 h后飼喂50%蔗糖溶液(空白對(duì)照)或含不同濃度的氟蟲(chóng)腈試驗(yàn)藥液(處理組)。飼喂劑量為1 mL·籠-1·天-1，每天更換試驗(yàn)藥液并觀察記錄蜜蜂死亡情況。每籠為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。新出房工蜂設(shè)置2個(gè)時(shí)間處理，一組飼喂7 d后收集每籠中的蜜蜂頭部(整只頭)和腹部(整只腹部)組織，一組飼喂14 d后收集，樣品-80 ℃冷凍保存待后續(xù)分析。

1.5 酶活力的檢測(cè)

蜜蜂組織粗酶液的制備和生化指標(biāo)檢測(cè)參照各試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。首先準(zhǔn)確稱取蜜蜂組織樣品質(zhì)量，按試劑盒要求加入與質(zhì)量相對(duì)應(yīng)體積的樣品提取液或生理鹽水，然后置于冰上研磨，破碎勻漿后4500 r·min-1離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。采用Bradford蛋白測(cè)定試劑盒制備蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，酶標(biāo)儀(Spectra Max i3，美谷分子儀器(上海)有限公司，中國(guó))測(cè)定蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品吸收值，繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品蛋白濃度；隨后根據(jù)各試劑盒方法測(cè)定目標(biāo)酶活力或產(chǎn)物的含量變化。具體方法可參考本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的文章[24]。每個(gè)濃度組3個(gè)樣品處理，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.6 數(shù)據(jù)處理

各檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用Graphpad prism 7.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，結(jié)合Tukey’s HSD檢驗(yàn)比較處理組與對(duì)照組之間的顯著性差異，各處理組間生存曲線的顯著性差異分析采用Graphpad prism 7.0軟件中l(wèi)og-rank(Mantel-Cox)test模型進(jìn)行。文中*表示P<0.05，**表示P<0.01，差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)發(fā)育的影響

氟蟲(chóng)腈可顯著影響蜜蜂幼蟲(chóng)的發(fā)育和死亡。空白對(duì)照組中幼蟲(chóng)的平均死亡率為(22.92±2.95)%，略高于OECD 237準(zhǔn)則的要求，但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)觀測(cè)化合物效應(yīng)濃度范圍時(shí)，蜜蜂幼蟲(chóng)人工飼養(yǎng)對(duì)照死亡率可適當(dāng)放寬至20%～25%，故本研究中的幼蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)仍在可接受范圍內(nèi)[25-26]。由圖1(a)可知，氟蟲(chóng)腈可顯著增加幼蟲(chóng)的死亡率，在設(shè)定的10-3、10-2、0.1、1和10 μg·L-1處理組中，幼蟲(chóng)的死亡率比對(duì)照組顯著增加22.92%～47.92%(P<0.05)，但在蛹期階段氟蟲(chóng)腈處理組中的死亡率與對(duì)照組無(wú)顯著差異。幼蟲(chóng)死亡率的增高導(dǎo)致其化蛹率和羽化率顯著降低，且與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)(圖1(b))。

圖1 氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)死亡(a)和發(fā)育(b)的影響注：(a)圖中灰色部分為幼蟲(chóng)死亡率，白色部分為蛹期死亡率，每個(gè)柱形圖代表幼蟲(chóng)和蛹期的死亡率累積之和，其中*代表對(duì)照組 與處理組之間幼蟲(chóng)死亡率差異顯著；字母a、b代表對(duì)照組與處理組之間幼蟲(chóng)和蛹的總死亡率之和差異顯著； 對(duì)照組與處理組之間蛹期死亡率差異不顯著，未標(biāo)記。Fig. 1 Effect of fipronil on death (a) and development (b) of honeybee larvaeNote: In Figure (a), the gray part is the larvae mortality rate, while the white part is the pupal mortality rate; each column represents the cumulative sum of the larvae and pupal mortality rates, in which *represents the significant difference in the larvae mortality rate between the control group and the treatment group; the letters a and b represent the significant difference in the sum of the total mortality of larvae and pupae between the control group and the treatment groups; there was no significant difference in pupa stage mortality between the control group and the treatment groups.

2.2 氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)酶活力的影響

亞致死劑量的氟蟲(chóng)腈可顯著誘導(dǎo)蜜蜂幼蟲(chóng)體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。由圖2可知，氟蟲(chóng)腈各處理組中的SOD酶活力與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，而CAT酶活力則顯著高于對(duì)照組(202.49±8.95) U·g-1protein (P<0.05)，且隨氟蟲(chóng)腈暴露濃度增加而增加(圖2(b))。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終端產(chǎn)物，在空白對(duì)照組中其含量為(0.47±0.08) nmol·mg-1protein，在10-3μg·L-1氟蟲(chóng)腈暴露組中，MDA含量顯著下降至0.1 nmol·mg-1protein(P<0.0001)，而在0.1 μg·L-1和1 μg·L-1處理組中其含量顯著升高至0.79 nmol·mg-1protein和0.95 nmol·mg-1protein，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01) (圖2(c))。

GSH含量變化(圖2(d))與CAT變化相似，在低濃度10-3μg·L-1和10-2μg·L-1處理組中，GSH含量與對(duì)照組(84.97±2.83) μmol·g-1protein相比無(wú)顯著差異，但在0.1 μg·L-1和1 μg·L-1組中GSH含量顯著升高，最高含量為(150.00±6.75) μmol·g-1protein(P<0.0001)。GST酶活力變化與其他指標(biāo)變化不同，所有氟蟲(chóng)腈處理組中的GST酶活力均顯著低于對(duì)照組(69.95±1.82) U·mg-1protein (P<0.01)，但各個(gè)處理組間的GST酶活力維持在相近水平(圖2(e))。

圖2 氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)酶活力的影響注：SOD表示超氧化物歧化酶，CAT表示過(guò)氧化氫酶，MDA表示丙二醛，GSH表示谷胱甘肽，GST表示谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶， AChE表示乙酰膽堿酯酶；*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對(duì)照組相比。Fig. 2 Effects of fipronil on enzyme activities in bee larvaeNote: SOD means superoxide dismutase; CAT means catalase; MDA means malondialdehyde; GSH means glutathione; GST means glutathione transferase; AChE means acetylcholinesterase; *indicates P<0.05, **indicates P<0.05, compared with the control.

對(duì)照組中蜜蜂幼蟲(chóng)的AChE活力為(0.09±0.01) U·mg-1protein，經(jīng)氟蟲(chóng)腈暴露8 d后，AChE活力在10-3μg·L-1和1 μg·L-1組中顯著下降61.4%和58.7% (P<0.01)，在10-2μg·L-1組中變化不顯著，但在0.1 μg·L-1處理組中比對(duì)照組升高1.6倍(P=0.0122)。

2.3 氟蟲(chóng)腈對(duì)幼齡工蜂的影響

氟蟲(chóng)腈對(duì)幼齡工蜂生存的影響結(jié)果如圖3所示。在暴露期間，對(duì)照組蜜蜂在7 d和14 d時(shí)的累積死亡率均<10%，滿足化合物對(duì)蜜蜂毒性測(cè)定的要求。氟蟲(chóng)腈處理組中，暴露7 d時(shí)，1 μg·L-1和5 μg·L-1處理組中的死亡率<10%，10 μg·L-1處理組中的死亡率<20%；1 μg·L-1和5 μg·L-1處理組中幼齡工蜂的死亡率有所增加，但仍<20%，而10 μg·L-1處理組中幼齡工蜂的死亡率顯著增至(65.0±17.7)%，與處理組相比差異顯著(P<0.0001)。

圖3 氟蟲(chóng)腈對(duì)幼齡工蜂存活率的影響注：**表示P<0.01,與對(duì)照組相比。Fig. 3 Effect of fipronil on the survival rate of young adult beesNote:**indicates P<0.01, compared with the control.

與幼蟲(chóng)相似，SOD對(duì)氟蟲(chóng)腈反應(yīng)不敏感，氟蟲(chóng)腈暴露7 d和14 d后，幼齡工蜂腹部SOD活力與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化(圖4(a))。CAT酶活力(圖4(b))在暴露7 d時(shí)變化趨勢(shì)不固定，相比于對(duì)照組(110.13±8.96) U·g-1protein，在1 μg·L-1處理組中CAT活力顯著上升至(132.80±4.27) U·g-1protein(P=0.0125)，但在5 μg·L-1處理組中CAT酶活力顯著下降至(85.37±8.42) U·g-1protein(P=0.0077)，而10 μg·L-1處理組中的CAT活力為(118.80±6.28) U·g-1protein，與對(duì)照組相比差異不顯著。當(dāng)暴露時(shí)間持續(xù)到14 d時(shí)，對(duì)照組中CAT酶活力為(93.00±6.40) U·g-1protein，而氟蟲(chóng)腈各處理組中的CAT酶活力則隨暴露濃度的增加顯著下降了17.6%、12.2%和87.2%(P<0.05)。

GST活力在7 d和14 d的對(duì)照組中分別為(76.68±1.78) U·mg-1protein和(92.09±8.29) U·mg-1protein，在氟蟲(chóng)腈暴露期間，各處理組中的GST酶活力均低于對(duì)照水平(圖4(c))。GSH含量在暴露7 d時(shí)無(wú)顯著變化；在暴露14 d時(shí)則呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)，1 μg·L-1與10 μg·L-1處理組中GSH含量分別為(47.41±4.66) μmol·g-1protein、(41.73±3.42) μmol·g-1protein，與對(duì)照組相比(62.82±2.69) μmol·g-1protein分別顯著降低了32.5%、50.5%(P<0.05)(圖4(d))。

氟蟲(chóng)腈暴露7 d和14 d時(shí)，成蜂腹部MDA含量在低濃度處理組(1 μg·L-1和5 μg·L-1)中變化均不顯著。在高濃度10 μg·L-1處理組中，MDA含量在7 d時(shí)為(1.33±0.17) nmol·mg-1protein，顯著低于對(duì)照組(1.91±0.15) nmol·mg-1protein，降低了30.4%(P=0.0073)；14 d時(shí)，MDA含量為(2.87±0.30) nmol·mg-1protein，相比對(duì)照組MDA含量(2.07±0.22) nmol·mg-1protein，顯著升高了38.4%(P=0.0113)(圖4(e))。

3 討論(Discussion)

蜜蜂是非常重要的授粉昆蟲(chóng)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境安全中發(fā)揮著重要作用，蜜蜂的減少會(huì)嚴(yán)重影響各種作物的產(chǎn)量和生態(tài)多樣性，因此對(duì)包含農(nóng)藥在內(nèi)的多種環(huán)境污染物進(jìn)行全面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)不僅可以預(yù)防其對(duì)蜜蜂造成較大的損害，更可以為農(nóng)藥的使用、污染物的治理等提供參考和依據(jù)[27]。

3.1 亞致死劑量氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂存在生存風(fēng)險(xiǎn)

氟蟲(chóng)腈與新煙堿類殺蟲(chóng)劑具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制和毒性作用，在2015年時(shí)，二者銷售份額占全球殺蟲(chóng)劑市場(chǎng)的1/3[28]。氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂的生存風(fēng)險(xiǎn)已多有報(bào)道，Holder等[17]通過(guò)室內(nèi)生物測(cè)定結(jié)合蜂群模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氟蟲(chóng)腈可以導(dǎo)致蜜蜂大量死亡，且具有TRT效應(yīng)，相比于吡蟲(chóng)啉等新煙堿類殺蟲(chóng)劑，氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)更高，導(dǎo)致蜂群死亡的可能性更大。本研究中發(fā)現(xiàn)在10 μg·L-1劑量下，氟蟲(chóng)腈暴露7 d不會(huì)引發(fā)顯著的蜜蜂死亡，但當(dāng)暴露時(shí)間延長(zhǎng)至14 d時(shí)，蜜蜂死亡率顯著增加，這也在一定程度上證明了氟蟲(chóng)腈的TRT效應(yīng)。氟蟲(chóng)腈所引發(fā)的蜜蜂高死亡率與其作用機(jī)理密切相關(guān)。氟蟲(chóng)腈作用于GABA受體，可影響昆蟲(chóng)大腦的重要結(jié)構(gòu)，Jacob等[29]利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察了不同劑量氟蟲(chóng)腈對(duì)無(wú)刺蜂(Scaptotrigonapostica)原腦蘑菇體肯氏細(xì)胞(Kenyon cells)形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)口攝入劑量低至0.24 ng a.i.·μL-1、局部接觸劑量低至0.27 ng a.i.·bee-1時(shí)均可觀察到固縮肯氏細(xì)胞(細(xì)胞凋亡)數(shù)量的增加，說(shuō)明氟蟲(chóng)腈可激發(fā)顯著的神經(jīng)細(xì)胞損傷。氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂繁殖和行為的影響是導(dǎo)致蜜蜂死亡的另一重要因素。El Hassani等[30]在室內(nèi)條件下評(píng)估了亞致死劑量氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂行為的影響，發(fā)現(xiàn)1 ng·蜂-1的劑量處理1 h后即可顯著降低蜜蜂的蔗糖敏感性，0.5 ng·蜂-1的劑量則可干擾蜜蜂的嗅覺(jué)記憶。Kairo等[31]研究發(fā)現(xiàn)0.1 μg·L-1氟蟲(chóng)腈可以影響蜜蜂雄蜂的生育能力，降低蜂王的繁殖力，影響下一代蜂卵的質(zhì)量和發(fā)育。Zaluski等[18]發(fā)現(xiàn)致死或亞致死劑量的氟蟲(chóng)腈可導(dǎo)致蜜蜂運(yùn)動(dòng)行為顯著減少，且當(dāng)蜂群暴露于氟蟲(chóng)腈時(shí)，孵化卵的數(shù)量、工蜂卵所占的面積以及發(fā)育的幼蟲(chóng)和蛹的數(shù)量都有降低，這也證明了氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)的高風(fēng)險(xiǎn)性。Silva Cruz等[32]觀察了氟蟲(chóng)腈處理下蜜蜂幼蟲(chóng)腸道形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)氟蟲(chóng)腈處理組中大多數(shù)的幼蟲(chóng)會(huì)出現(xiàn)中腸細(xì)胞質(zhì)中的空泡消失，染色質(zhì)壓實(shí)的現(xiàn)象。目前關(guān)于氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)的直接毒性評(píng)價(jià)還很少，本研究發(fā)現(xiàn)亞致死劑量的氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)存在較高的生存風(fēng)險(xiǎn)，其可顯著降低幼蟲(chóng)化蛹率和羽化率，導(dǎo)致發(fā)育失敗。

圖4 氟蟲(chóng)腈暴露后幼齡工蜂腹部組織酶活力變化注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對(duì)照組相比。Fig. 4 Enzyme activity changes in abdomen of the young adult bees after exposure to fipronilNote:*indicates P<0.05, **indicates P<0.01, compared with the control.

綜合文獻(xiàn)報(bào)道和本研究中的結(jié)果可知，氟蟲(chóng)腈在μg或ng水平即可引發(fā)顯著的蜜蜂生存風(fēng)險(xiǎn)，而據(jù)報(bào)道，氟蟲(chóng)腈在水稻田地表水中的檢出濃度不低于9 μg·L-1，在居民區(qū)地表水中的檢出濃度則高達(dá)12.6 μg·L-1[33-34]。在巴西，農(nóng)藥的使用量和蜂群損失量一直居高不下，Castilhos等[35]隨機(jī)采集并測(cè)定了中毒非洲化蜜蜂體內(nèi)的氟蟲(chóng)腈和新煙堿類殺蟲(chóng)劑的殘留情況，發(fā)現(xiàn)氟蟲(chóng)腈的檢出率高達(dá)為55.3%，檢出劑量為0.7～23 ng·g-1蜜蜂，最高可達(dá)539.7 ng·g-1蜜蜂。這些都說(shuō)明環(huán)境中殘留氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂仍存在很高風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)合文獻(xiàn)和本文中的研究結(jié)果，氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂的安全性低，在亞致死劑量下即可顯著干擾蜜蜂幼蟲(chóng)發(fā)育和成蜂生存，因此在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)都不應(yīng)忽視氟蟲(chóng)腈殘留對(duì)蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 亞致死量氟蟲(chóng)腈誘導(dǎo)蜜蜂氧化脅迫

氧化脅迫是生物體對(duì)抗外源脅迫時(shí)產(chǎn)生的一種常見(jiàn)反應(yīng)，在維持生物體體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[36]。Wang等[37]對(duì)氟蟲(chóng)腈引起的氧化損傷和代謝機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，整理發(fā)現(xiàn)氟蟲(chóng)腈在多種生物體內(nèi)/體外均可引起的顯著的氧化壓力，增加活性氧自由基(ROS)或活性氮自由基(RNS)的生成、引發(fā)線粒體損傷，干擾ERK、JNK和AKT等代謝通路，導(dǎo)致更嚴(yán)重的DNA、脂質(zhì)和蛋白等大分子的過(guò)氧化和損傷。本研究中，蜜蜂幼蟲(chóng)和幼齡工蜂體內(nèi)SOD和CAT酶活力、MDA含量發(fā)生顯著變化，說(shuō)明亞致死劑量氟蟲(chóng)腈可誘導(dǎo)蜜蜂氧化應(yīng)激反應(yīng)。但是SOD在蜜蜂幼蟲(chóng)和成蜂中的變化均不顯著，這說(shuō)明SOD對(duì)氟蟲(chóng)腈引發(fā)的氧化壓力不敏感，可能不是監(jiān)測(cè)氟蟲(chóng)腈氧化脅迫的靈敏指標(biāo)。

值得注意的是，蜜蜂幼蟲(chóng)或成蜂體內(nèi)各酶活力或產(chǎn)物含量變化與氟蟲(chóng)腈暴露時(shí)間/劑量的效應(yīng)關(guān)系并不十分明確，如在成蜂暴露體系中，CAT酶活力在暴露7 d時(shí)整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)而14 d則呈下降趨勢(shì)；MDA含量在低濃度時(shí)無(wú)顯著變化，但在高濃度10 μg·L-1處理組中，暴露7 d時(shí)MDA含量顯著低于對(duì)照組，而14 d時(shí)顯著高于對(duì)照組。這可能與蜜蜂對(duì)外界脅迫的時(shí)間適應(yīng)機(jī)制相關(guān)。Chakrabarti等[38]發(fā)現(xiàn)氟吡呋喃酮可顯著增加蜜蜂體內(nèi)ROS/RNS的濃度，但蜜蜂暴露10 d時(shí)體內(nèi)ROS/RNS濃度顯著低于暴露6 h時(shí)的濃度水平，說(shuō)明蜜蜂在長(zhǎng)期接觸外源毒性物質(zhì)時(shí)可自發(fā)調(diào)節(jié)自身生理反應(yīng)，緩解其帶來(lái)的危害，但對(duì)于毒性較高的化合物或當(dāng)暴露時(shí)間足夠長(zhǎng)時(shí)，蜜蜂的這種適應(yīng)機(jī)制仍然不能達(dá)到保護(hù)自身的目的。Mulvey和Cresswell[39]研究了吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)嗪和氟蟲(chóng)腈對(duì)熊蜂的時(shí)間依賴毒性，發(fā)現(xiàn)氟蟲(chóng)腈不易被降解、排出體外，對(duì)熊峰的生存具有顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系和很強(qiáng)的TRT效應(yīng)，噻蟲(chóng)嗪與氟蟲(chóng)腈作用相似但TRT效應(yīng)中等，而吡蟲(chóng)啉僅在最高濃度處理組中出現(xiàn)死亡和TRT效應(yīng)。Simon-Delso等[40]亦發(fā)現(xiàn)了啶酰菌胺對(duì)蜜蜂的TRT效應(yīng)，推測(cè)這可能是由于蜜蜂長(zhǎng)期接觸毒性物質(zhì)，導(dǎo)致體質(zhì)變?nèi)?，降低了處理有毒物質(zhì)的能力。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)氟氯苯氰菊酯暴露對(duì)蜜蜂也具有相似的時(shí)間效應(yīng)[41]，因此建議未來(lái)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)環(huán)境濃度下農(nóng)藥或其他環(huán)境污染物對(duì)蜜蜂在個(gè)體及群體上的時(shí)間-依賴風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，尤其是低劑量的長(zhǎng)期暴露風(fēng)險(xiǎn)，建立相應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)閾值，降低化合物對(duì)蜜蜂等授粉昆蟲(chóng)的影響。

3.3 亞致死劑量氟蟲(chóng)腈激活蜜蜂解毒反應(yīng)

蜜蜂對(duì)外源物的解毒方式主要包括細(xì)胞色素P450s、羧酸酯酶(carboxylesterases)、GST和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4個(gè)途徑[42]，其中GST是昆蟲(chóng)體內(nèi)常見(jiàn)的解毒酶，通過(guò)催化GSH與環(huán)氧化合物結(jié)合，可以促進(jìn)大量被細(xì)胞色素P450家族氧化的化合物的二次代謝，轉(zhuǎn)化多種內(nèi)源性和外源性化合物，包括除草劑和殺蟲(chóng)劑等[43]。本研究中，氟蟲(chóng)腈暴露處理的幼蟲(chóng)體內(nèi)GST酶活力均顯著低于對(duì)照組，與此相對(duì)應(yīng)的，GSH在幼蟲(chóng)體內(nèi)的含量隨氟蟲(chóng)腈暴露濃度的上升而逐漸上升；成蜂體內(nèi)GST酶活力在氟蟲(chóng)腈處理組中亦顯著低于對(duì)照組，但GSH含量變化在暴露7 d時(shí)不顯著，在暴露14 d后GSH的含量開(kāi)始隨氟蟲(chóng)腈濃度的增加而逐漸下降；由此推測(cè)GST介導(dǎo)了氟蟲(chóng)腈在蜜蜂體內(nèi)的降解代謝。本研究結(jié)果與Nielsen等[44]的報(bào)道相似，Nielsen等[44]測(cè)定了氟氯苯氰菊酯對(duì)不同階段蜜蜂解毒酶的影響，發(fā)現(xiàn)氟氯苯氰菊酯暴露可顯著增加蜜蜂幼蟲(chóng)和蛹期的GST活力，但在采集蜂內(nèi)GST活力顯著降低。此外，Smirle[45]早在1993年就發(fā)現(xiàn)幼齡工蜂所具有的解毒酶特異性低，導(dǎo)致了幼齡工蜂對(duì)各種環(huán)境氧化物更敏感。值得注意的是，與其他昆蟲(chóng)相比，西方蜜蜂基因組中解毒和免疫基因數(shù)量相對(duì)較少[42,46]，以GST為例，西方蜜蜂體內(nèi)僅含有10個(gè)GST相關(guān)功能基因，且主要為σ類型，解毒能力的不足也是導(dǎo)致蜜蜂對(duì)外源物敏感的一個(gè)重要原因。氟蟲(chóng)腈誘導(dǎo)的GST和GSH變化也證明了二者在蜜蜂應(yīng)對(duì)外界脅迫時(shí)發(fā)揮著積極的保護(hù)作用。

3.4 亞致死量氟蟲(chóng)腈影響蜜蜂AChE活力

AChE是評(píng)價(jià)神經(jīng)毒性化合物的常用指標(biāo)[47]。本研究中蜜蜂幼蟲(chóng)和成蜂頭部AChE活力顯著降低，再次證明了氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂的神經(jīng)毒性。Roat等[48]以10 pg氟蟲(chóng)腈·蜂-1的劑量飼喂非洲化蜜蜂5 d，發(fā)現(xiàn)氟蟲(chóng)腈會(huì)導(dǎo)致幼齡工蜂腦部某些蛋白質(zhì)表達(dá)模式的改變，造成神經(jīng)化學(xué)壓力，神經(jīng)元蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊，細(xì)胞凋亡率升高，損害突觸形成，大腦發(fā)生退化，導(dǎo)致記憶和學(xué)習(xí)功能障礙。但Carvalho等[49]發(fā)現(xiàn)氟蟲(chóng)腈暴露48 h后不會(huì)影響蜜蜂頭部的AChE活力，造成這種差異的原因可能是由于氟蟲(chóng)腈的作用靶標(biāo)是GABA受體，短時(shí)間暴露時(shí)可能不會(huì)誘導(dǎo)AChE活力變化，而當(dāng)暴露時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，蜜蜂受到的神經(jīng)損傷較重，可通過(guò)AChE活力變化表現(xiàn)出來(lái)。據(jù)報(bào)道，多種農(nóng)藥可影響蜜蜂AChE活力，如吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)胺和高滅磷等，進(jìn)而影響蜜蜂正常的生理功能，導(dǎo)致蜂群崩潰死亡[50-52]。

昆蟲(chóng)AChE是殺蟲(chóng)劑的重要靶標(biāo)之一，其突變及表達(dá)量的變化均是導(dǎo)致昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性的主要原因[53-54]。昆蟲(chóng)具有2個(gè)AChE基因，其在不同季節(jié)、昆蟲(chóng)不同組織內(nèi)表達(dá)不同，且功能不同，在頭部AChE主要承擔(dān)水解神經(jīng)遞質(zhì)等催化功能，而在其他組織內(nèi)可能具有與催化作用無(wú)關(guān)的生理功能[55]。Kim等[56]對(duì)蜜蜂AChE基因表達(dá)量和表達(dá)部位測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，AChE1主要在蜜蜂頭部和腹部表達(dá)且表達(dá)量高于AChE2，最高表達(dá)量出現(xiàn)在春冬季節(jié)，AChE2表達(dá)量隨季節(jié)變化不明顯，在一年各月份中均可表達(dá)。此外，不同分工蜜蜂體內(nèi)的AChE分布不同，Shapira等[57]研究發(fā)現(xiàn)采集蜂頭部AChE活力顯著低于內(nèi)勤蜂，這也可能是采集蜂對(duì)農(nóng)藥敏感性較高的原因之一。本研究中僅針對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)和幼齡工蜂頭部AChE的活力進(jìn)行了測(cè)定，未來(lái)可針對(duì)不同季節(jié)、不同日齡、不同級(jí)型和不同蜜蜂組織AChE進(jìn)行監(jiān)測(cè)，探索其在蜜蜂中毒預(yù)警中應(yīng)用的可能。

綜合本研究的發(fā)現(xiàn)可知，亞致死劑量的氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)和幼齡工蜂均可產(chǎn)生顯著的影響，且這種影響會(huì)隨著暴露濃度和時(shí)間的延長(zhǎng)而加劇，對(duì)蜜蜂健康造成的更大的風(fēng)險(xiǎn)。為避免蜂群接觸到高殘留劑量的氟蟲(chóng)腈，應(yīng)嚴(yán)格遵守用藥規(guī)定和蜂群管理措施，盡可能的保證蜂群中各個(gè)級(jí)型蜜蜂的健康。除農(nóng)業(yè)生產(chǎn)外，氟蟲(chóng)腈亦是一種重要的衛(wèi)生殺蟲(chóng)劑，可以殺滅跳蚤、螨和虱等衛(wèi)生害蟲(chóng)，氟蟲(chóng)腈被世界衛(wèi)生組織列為“對(duì)人類有中等毒性”的化合物，在環(huán)境或生物體內(nèi)代謝產(chǎn)生氟甲腈、氟蟲(chóng)腈硫醚和氟蟲(chóng)腈砜3種代謝物，而這3種代謝物的毒性要高于氟蟲(chóng)腈原藥[58]。鑒于氟蟲(chóng)腈的使用特點(diǎn)和對(duì)蜜蜂的高風(fēng)險(xiǎn)性，未來(lái)的研究一方面可以圍繞環(huán)境中氟蟲(chóng)腈代謝產(chǎn)物是否對(duì)蜜蜂存在暴露風(fēng)險(xiǎn)開(kāi)展，另一方面可以通過(guò)新型生理指標(biāo)(腸道菌群、基因表達(dá)和代謝組學(xué)變化等)的應(yīng)用進(jìn)一步評(píng)價(jià)氟蟲(chóng)腈單一或與其他藥物協(xié)同作用時(shí)對(duì)蜜蜂的毒性作用。