徐蓉蓉，高靜，魏思敏，關(guān)思靜，葛甜甜，王楠,*，唐志書，宋忠興

1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，咸陽(yáng) 712083 2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽(yáng) 712046

隨著納米技術(shù)的進(jìn)步，納米顆粒被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活中，并不可避免地被釋放到環(huán)境中[1]。進(jìn)入水中或土壤后，納米顆粒的吸收、遺傳毒性和細(xì)胞毒性等特性會(huì)發(fā)生一定的變化[2-3]。比如納米銀(AgNPs)釋放到環(huán)境中，團(tuán)聚狀態(tài)、表面化學(xué)性質(zhì)和電荷，以及釋放Ag+的能力由于被氧化和硫化而發(fā)生改變，最后使得其持續(xù)性和毒性受到影響[4-5]。釋放到環(huán)境中的納米顆?？杀恢参镂?，并運(yùn)輸?shù)街参锏母?、莖、葉，甚至花和果實(shí)等部位，對(duì)植物各生長(zhǎng)階段造成影響。此外，一定數(shù)量的納米顆?？稍斐扇梭w暴露。因此，在考慮進(jìn)一步開(kāi)發(fā)納米技術(shù)的應(yīng)用時(shí)必須確定納米顆粒的安全性[6]。AgNPs因其廣譜殺菌且無(wú)耐藥性的特點(diǎn)使其應(yīng)用廣泛并成為研究的熱點(diǎn)，關(guān)于其在植物方面的研究多集中于消極影響[7-9]，但也不乏一些積極效應(yīng)的研究存在。例如，對(duì)AgNPs在擬南芥中的積累和運(yùn)輸進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AgNPs對(duì)根的毒性作用是受其大小和濃度影響[2]。而Hojjat和Kamyab[10]探究AgNPs在不同濃度的鹽溶液對(duì)胡蘆巴種子發(fā)芽和生長(zhǎng)的作用，發(fā)現(xiàn)AgNPs的使用可以提高胡蘆巴幼苗的耐鹽性，其應(yīng)用可能會(huì)刺激植物抵御鹽毒的不同防御機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)AgNPs濃度為0.06～0.5 mg·L-1時(shí)在農(nóng)業(yè)上具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可作為一種替代性的生態(tài)友好型小麥肥料[11]。

黃芪作為一味常用的補(bǔ)益藥，目前主要依賴人工栽培。而作為中藥材黃芪來(lái)源之一的蒙古黃芪為主流商品[12]。天氣和土壤條件等外在環(huán)境因素都會(huì)嚴(yán)重影響黃芪藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。納米顆粒會(huì)通過(guò)各種途徑被釋放到土壤中，其中一部分可能由黃芪根部吸收，然后在體內(nèi)遷移、轉(zhuǎn)運(yùn)或者蓄積，這可能會(huì)對(duì)黃芪的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定影響。如果人們直接或間接食用了含有納米顆粒的黃芪，可能會(huì)對(duì)人類健康造成潛在威脅。因此為模擬實(shí)際栽培種植中可能存在的問(wèn)題和隱患，本實(shí)驗(yàn)以豆科黃芪屬植物蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao，簡(jiǎn)寫為Astragalusmongholicus)為研究對(duì)象，研究不同濃度的AgNPs溶液對(duì)蒙古黃芪種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的毒害作用，并基于數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。大數(shù)據(jù)分析涉及的領(lǐng)域越來(lái)越廣泛，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。為探討單一植物蒙古黃芪對(duì)AgNPs的響應(yīng)是否符合大數(shù)據(jù)分析形成的趨勢(shì)，本研究使用冗余分析和meta分析進(jìn)行驗(yàn)證，比較二者預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異，驗(yàn)證大數(shù)據(jù)分析的可靠性，旨在正確使用數(shù)學(xué)模型評(píng)價(jià)AgNPs的植物毒性，并為其實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)選用大小均一、顆粒成熟飽滿的蒙古黃芪種子。將供試種子用體積比為1∶3的過(guò)氧化氫∶純凈水消毒40 min，純凈水沖洗干凈，備用。實(shí)驗(yàn)所用AgNPs粒徑為40 nm，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心提供。以不同濃度AgNPs溶液處理為實(shí)驗(yàn)組，純凈水處理為對(duì)照組，相同的處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每日更換培養(yǎng)皿中濾紙和處理液，并觀察蒙古黃芪種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)情況。將所有種子置于直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿30粒種子，實(shí)驗(yàn)組分別加入10 mL不同濃度的AgNPs溶液，使之將濾紙完全濕潤(rùn)，對(duì)照組加入相同體積的純凈水，種子萌發(fā)的標(biāo)志為露白。AgNPs溶液設(shè)置9個(gè)不同濃度：0、10、20、60、100、200、400、600和1 000 mg·L-1。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在人工氣候箱中完成，溫度為25 ℃、光/暗周期為12 h/12 h、光照度為Ⅲ級(jí)和濕度為60%。

利用文獻(xiàn)搜索網(wǎng)站W(wǎng)eb of science、Google scholar和中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)，設(shè)定“納米銀(AgNPs、silver nanoparticles、Ag nanoparticles)”、“種子(seed)”、“幼苗(seedling)”、“萌發(fā)(germination)”、“生長(zhǎng)(growth)”等為關(guān)鍵詞進(jìn)行文獻(xiàn)收集，共收集到文獻(xiàn)105篇。經(jīng)篩選，符合我們分析條件的文獻(xiàn)有英文文獻(xiàn)16篇，中文文獻(xiàn)2篇。

1.2 種子萌發(fā)指標(biāo)與幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

每日觀察并記錄各培養(yǎng)皿中發(fā)芽種子數(shù)，至所有培養(yǎng)皿連續(xù)3 d無(wú)新種子萌發(fā)時(shí)停止觀察，次日進(jìn)行各指標(biāo)測(cè)定。最終發(fā)芽率(total germination percentage, TGP)=發(fā)芽種子數(shù)/供試總種子數(shù)；平均發(fā)芽時(shí)間(mean of germination time, MGT)=∑[(nt×t)/n]，其中nt為第t天的發(fā)芽數(shù)，n為最終發(fā)芽數(shù)。

萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從各處理的各重復(fù)中隨機(jī)取出9株幼苗，分別測(cè)定幼苗生理生化指標(biāo)，包括胚根長(zhǎng)(radicle length, RL)、胚軸長(zhǎng)(hypocotyl length, HL)、子葉長(zhǎng)(cotyledon length, CL)、子葉寬(cotyledon width, CW)、總鮮質(zhì)量(total fresh weight, TFW)、總干質(zhì)量(total dry weight, TDW)、葉綠素含量(chlorophyll content, Chl)和氮含量(nitrogen content)。將測(cè)完鮮質(zhì)量的幼苗放置烘箱，80 ℃烘干至恒重。不同指標(biāo)對(duì)AgNPs的耐受性不同，為了能更準(zhǔn)確地比較AgNPs對(duì)蒙古黃芪的毒性作用，用AgNPs對(duì)各指標(biāo)的抑制率表示，抑制率(inhibition rate, IR)=(1-處理組/對(duì)照組)×100%，IR<0表示具有促進(jìn)作用，IR≥0表示具有抑制作用。IR的絕對(duì)值越大，表示促進(jìn)或抑制作用越大。

每個(gè)處理中選取長(zhǎng)勢(shì)較好的幼苗，分別取其地上和地下部分進(jìn)行過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)含量測(cè)定，分別用CATS、CATR、PODS、PODR、SODS、SODR表示。CAT采用紫外吸收法、POD采用愈創(chuàng)木酚法、SOD含量測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法分別進(jìn)行含量測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定得到16個(gè)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)評(píng)價(jià)指標(biāo)：最終發(fā)芽率(TGP，X1)、平均發(fā)芽時(shí)間(MGT，X2)、胚根長(zhǎng)(RL，X3)、胚軸長(zhǎng)(HL，X4)、子葉長(zhǎng)(CL，X5)、子葉寬(CW，X6)、總鮮質(zhì)量(TFW，X7)、總干質(zhì)量(TDW，X8)、葉綠素含量(Chl，X9)、氮含量(N，X10)、地上過(guò)氧化氫酶(CATS，X11)、地下過(guò)氧化氫酶(CATR，X12)、地上過(guò)氧化物酶(PODS，X13)、地下過(guò)氧化物酶(PODR，X14)、地上超氧化物歧化酶(SODS，X15)和地下超氧化物歧化酶(SODR，X16)。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，查閱AgNPs對(duì)植物種子和幼苗影響的相關(guān)文獻(xiàn)，并搜集整理數(shù)據(jù)，同樣得到16個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)：最終發(fā)芽率(TGP)、幼苗總長(zhǎng)度(TL)、根長(zhǎng)(RL)、根鮮質(zhì)量(RFW)、根干質(zhì)量(RDW)、莖長(zhǎng)(SL)、莖鮮質(zhì)量(SFW)、莖干質(zhì)量(SDW)、幼苗總鮮質(zhì)量(TFW)、幼苗總干質(zhì)量(TDW)、葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)、總?cè)~綠素(Chl)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 AgNPs對(duì)黃芪種子萌發(fā)的影響

由圖1(a)和(b)可知，在不同濃度AgNPs溶液中，蒙古黃芪種子的萌發(fā)受到不同程度的抑制，最終發(fā)芽率隨著AgNPs濃度的升高而降低。在濃度10～400 mg·L-1的范圍內(nèi)，與對(duì)照組相比，處理組最終發(fā)芽率降低；而在濃度達(dá)到600 mg·L-1和1 000 mg·L-1時(shí)，最終發(fā)芽率顯著降低(P<0.05)，在1 000 mg·L-1時(shí)，出現(xiàn)最低值，為8.67%。由圖1(c)可知，濃度10～400 mg·L-1的處理與對(duì)照組的發(fā)芽時(shí)間無(wú)顯著性差異；而濃度為600 mg·L-1和1 000 mg·L-1時(shí)平均發(fā)芽時(shí)間顯著高于其他處理組(P<0.05)，且600 mg·L-1的平均發(fā)芽時(shí)間最長(zhǎng)，為5.50 d。

2.2 AgNPs對(duì)黃芪幼苗生長(zhǎng)和抗氧化酶系統(tǒng)的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，濃度為10～400 mg·L-1的AgNPs對(duì)蒙古黃芪幼苗的生長(zhǎng)無(wú)影響，但隨著濃度的升高，在觀察后期其生長(zhǎng)受到影響。濃度為600 mg·L-1時(shí)在觀察第11天幼苗開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)莖葉失水并腐爛的現(xiàn)象，至觀察結(jié)束時(shí)，葉綠素、氮含量和抗氧化酶等指標(biāo)已無(wú)法進(jìn)行測(cè)量；而1 000 mg·L-1時(shí)，種子發(fā)芽后的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，胚根突出后，伸長(zhǎng)非常緩慢，且在觀察第9天時(shí)，發(fā)芽的種子開(kāi)始腐爛發(fā)霉，觀察結(jié)束時(shí)，生理生化指標(biāo)已無(wú)法測(cè)量。

圖1 AgNPs對(duì)蒙古黃芪種子累計(jì)發(fā)芽率(a)、最終發(fā)芽率(b)和平均發(fā)芽時(shí)間(c)的影響注：柱狀圖和折線圖上不同小寫字母表示所有處理在P<0.05水平與對(duì)照組相比差異顯著；下同。Fig. 1 Effects of AgNPs on the cumulative germination rate (a), total germination percentage (b) and mean of germination time (c) of A. mongholicus seeds Note: Values with different lowercase letters on the line and bars chart represent all treatments are significantly different from control at P<0.05; the same below.

由圖2可知，當(dāng)濃度為400～1 000 mg·L-1時(shí)，胚根伸長(zhǎng)受到抑制，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；除1 000 mg·L-1外，各處理間胚軸的長(zhǎng)度未受到AgNPs濃度變化的顯著影響，當(dāng)濃度為200 mg·L-1時(shí)，胚軸出現(xiàn)最大值，為1.07 cm，而最短值出現(xiàn)在對(duì)照組，為0.77 cm；子葉長(zhǎng)趨勢(shì)同胚根長(zhǎng)度一致，濃度為400 mg·L-1時(shí)開(kāi)始受到抑制，為600 mg·L-1時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；濃度為10～400 mg·L-1時(shí)，與對(duì)照組相比，子葉寬無(wú)明顯變化，當(dāng)濃度達(dá)到600 mg·L-1時(shí)，子葉寬顯著減少(P<0.05)；葉綠素和氮含量隨AgNPs濃度的增加趨勢(shì)基本一致，濃度為200 mg·L-1時(shí)開(kāi)始顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組相比較，各濃度處理組(除20 mg·L-1外)的鮮質(zhì)量與干質(zhì)量均顯著減少(P<0.05)，最小值均出現(xiàn)在600 mg·L-1時(shí)，分別為0.1426 g和0.0062 g。

如圖3所示，隨著AgNPs溶液濃度升高，蒙古黃芪幼苗地上部分和地下部分的抗氧化酶CAT、POD和SOD活性變化趨勢(shì)基本一致，且POD和SOD活性明顯高于CAT活性。由圖3(a)可知，AgNPs濃度為10 mg·L-1時(shí)激發(fā)黃芪幼苗產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶應(yīng)激，地上和地下部分活性均明顯高于對(duì)照組，而其他處理的活性與對(duì)照組相比差別不大。由圖3(b)和(c)可知，POD在10～400 mg·L-1AgNPs和SOD在10～200 mg·L-1AgNPs的范圍內(nèi)，二者地上和地下部分活性均高于對(duì)照組。

2.3 AgNPs的毒性與蒙古黃芪種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的關(guān)系

在表1中列出了不同AgNPs濃度處理后蒙古黃芪種子萌發(fā)和幼苗指標(biāo)的抑制率，可知AgNPs對(duì)蒙古黃芪種子萌發(fā)和幼苗產(chǎn)生了不同程度的毒害作用。1 000 mg·L-1時(shí)，AgNPs對(duì)蒙古黃芪幼苗生長(zhǎng)有毒害作用，幼苗的生長(zhǎng)指標(biāo)已無(wú)法測(cè)定；AgNPs對(duì)最終發(fā)芽率的抑制隨著濃度升高而增強(qiáng)，1 000 mg·L-1顯著抑制種子萌發(fā)(P<0.05)，抑制率為89.92%；AgNPs對(duì)胚根長(zhǎng)、子葉長(zhǎng)、子葉寬、總鮮質(zhì)量和總干質(zhì)量的抑制率在濃度為600 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高；但胚軸長(zhǎng)的抑制不受AgNPs濃度影響，各濃度間無(wú)顯著性差異；葉綠素含量的抑制率最高達(dá)到38.33%，對(duì)氮含量抑制率最高達(dá)到29.43%。

2.4 AgNPs對(duì)蒙古黃芪種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)影響評(píng)價(jià)及驗(yàn)證

2.4.1 隸屬函數(shù)分析及綜合評(píng)價(jià)

不同濃度AgNPs處理下蒙古黃芪各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值如表2所示，其中10、20、60和100 mg·L-1AgNPs處理綜合評(píng)價(jià)值均高于對(duì)照組，分別提高了17.45%、11.35%、5.67%和5.53%，說(shuō)明低濃度AgNPs對(duì)蒙古黃芪的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用；濃度200 mg·L-1和400 mg·L-1的AgNPs處理綜合評(píng)價(jià)值與對(duì)照相比分別降低了1.70%和17.30%，這表明，中濃度AgNPs對(duì)蒙古黃芪的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，而600 mg·L-1和1 000 mg·L-1AgNPs處理綜合評(píng)價(jià)值與對(duì)照相比分別降低了62.27%和94.18%，可見(jiàn)高濃度AgNPs對(duì)蒙古黃芪具有毒害作用，嚴(yán)重影響了蒙古黃芪生長(zhǎng)發(fā)育。

2.4.2 主成分分析

為保持原始各指標(biāo)數(shù)值的相對(duì)穩(wěn)定性，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后再分析，標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)如表3所示。主成分分析對(duì)原有變量總體描述情況如表4所示，由表4提取了2個(gè)主成分，其累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到85.817%。由軟件直接得出的初始因子載荷矩陣得分除以相應(yīng)的特征值的平方根，以計(jì)算載荷得到主成分載荷矩陣(即每個(gè)主成分中每個(gè)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的系數(shù))，結(jié)果如表5所示。根據(jù)方程計(jì)算出不同濃度的各主成分及綜合得分(表6)。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行主成分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取了2個(gè)主成分，濃度為10 mg·L-1的綜合得分最高，為2.414。

由以上分析過(guò)程得到相應(yīng)的主成分表達(dá)式如下：

F1=0.28X1-0.255X2+0.281X3+0.18X4+0.275X5+0.272X6+0.248X7+0.271X8+0.28X9+0.282X10+0.138X11+0.151X12+0.26X13+0.256X14+0.253X15+0.251X16

F2=-0.094X1-0.055X2-0.042X3-0.301X4-0.145X5-0.154X6-0.258X7-0.159X8+0.056X9+0.041X10+0.605X11+0.594X12+0.046X13-0.028X14+0.097X15+0.15X16

F=0.87F1+0.13F2

圖2 AgNPs對(duì)蒙古黃芪幼苗生長(zhǎng)的影響Fig. 2 Effects of AgNPs on the growth of A. mongholicus seedlings n=9)

圖3 AgNPs對(duì)蒙古黃芪幼苗地上和地下部分抗氧化酶的影響注：CATS表示地上過(guò)氧化氫酶，CATR表示地下過(guò)氧化氫酶，PODS表示地上過(guò)氧化物酶，PODR表示地下過(guò)氧化物酶， SODS表示地上超氧化物歧化酶，SODR表示地下超氧化物歧化酶。Fig. 3 Effects of AgNPs on antioxidant enzymes of aboveground and underground portions of A. mongholicus seedlingsNote: CATS and CATR represent shoot- and root catalase; PODS and PODR represent shoot- and root peroxidase; SODS and SODR represent shoot- and root superoxide dismutase.

表1 不同AgNPs濃度對(duì)蒙古黃芪種子和幼苗指標(biāo)的抑制率Table 1 Inhibition rate of indexes of A. mongholicus seed and seedling under different AgNPs concentrations

2.4.3 冗余分析

由圖4(a)可知，TGP、RL、SL、TFW、TDW、Chl與CATS相關(guān)性強(qiáng)，而CATR、SODS、SODR與PODS相關(guān)性較強(qiáng)。AgNPs濃度在0～50 mg·L-1時(shí)對(duì)蒙古黃芪的CATR、SODS、SODR和PODS影響較大，在50～100 mg·L-1時(shí)對(duì)蒙古黃芪的PODR影響較大，而蒙古黃芪其余指標(biāo)受AgNPs濃度變化影響不明顯。由圖4(b)可知，TFW與Chl、TDW與RL相關(guān)性較強(qiáng)，CAT、POD與SOD相關(guān)性強(qiáng)，AgNPs濃度在0 mg·L-1時(shí)(對(duì)照組)對(duì)TDW和RL、0～50 mg·L-1對(duì)SL、50～100 mg·L-1對(duì)TGP、100～1 000 mg·L-1對(duì)TFW和Chl影響較大。

2.4.4 Meta分析

為進(jìn)一步明確不同濃度的AgNPs對(duì)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響，利用Meta分析來(lái)進(jìn)行討論。由圖5可知，AgNPs濃度<50 mg·L-1時(shí)，對(duì)TGP、MGT、GI和TFW的影響為顯著正效應(yīng)，而對(duì)TDW影響不顯著；濃度50～100 mg·L-1和100～1 000 mg·L-1時(shí)，對(duì)TGP、GI沒(méi)有顯著影響；3個(gè)AgNPs濃度區(qū)間均使得RL和SL顯著減少；濃度<50和100～1 000 mg·L-1時(shí)對(duì)葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素影響不顯著。

3 討論(Discussion)

人們對(duì)納米材料安全性的認(rèn)知需求伴隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展與納米材料的廣泛應(yīng)用而不斷增強(qiáng)。種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)是一種快速的植物毒性檢測(cè)方法，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，故常用于進(jìn)行納米顆粒毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)[14-15]。比如，AgNPs對(duì)水稻種子萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)具有明顯的劑量依賴性抑制作用，AgNPs在設(shè)置的濃度范圍內(nèi)(0.1、1、10、100和1 000 mg·L-1)都會(huì)影響幼苗的生長(zhǎng)[16]。AgNPs顆粒似乎由于濃度和受供試植物種類不同而對(duì)植物產(chǎn)生不同的影響。AgNPs濃度為0.5 mg·L-1和2.5 mg·L-1時(shí)對(duì)西葫蘆種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，而2 mg·L-1時(shí)提高了西瓜發(fā)芽率[17]。AgNPs濃度中使用的AgNPs是經(jīng)過(guò)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)包被，增加了其穩(wěn)定性，且蓖麻經(jīng)AgNPs處理后其POD和SOD活性增強(qiáng)，并產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)[18]。由此可以推測(cè)，AgNPs經(jīng)過(guò)表面或生物修飾變得較穩(wěn)定，不會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響，這或許是降低納米粒子毒性的有效措施。本研究中，隨著AgNPs濃度的升高，蒙古黃芪最終發(fā)芽率降低；而低濃度AgNPs對(duì)幼苗的生長(zhǎng)無(wú)影響，高濃度使幼苗后期的生長(zhǎng)嚴(yán)重受到影響。這說(shuō)明高濃度的AgNPs積累過(guò)多，對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生了強(qiáng)烈的脅迫[19]。同樣的，將水稻幼苗暴露于不同濃度的AgNPs后，觀察到根伸長(zhǎng)、莖和根鮮質(zhì)量、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量顯著降低，這可能是因?yàn)锳gNPs暴露導(dǎo)致ROS生成量增加，引起細(xì)胞毒性[20]。雖然關(guān)于納米粒子的研究較多，但納米毒性的機(jī)理仍不清楚。據(jù)推測(cè)納米毒性可能來(lái)自化學(xué)成分本身具有的化學(xué)毒性(如有毒離子的釋放)和顆粒表面、大小以及形狀引起的壓力或刺激[21]。

表2 不同AgNPs濃度下蒙古黃芪種子和幼苗指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Table 2 Sobordinative function values among indexes of A. mongholicus seeds and seedlings under different AgNPs concentrations

表3 標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)Table 3 Standardized data

表4 主成分分析總方差分析表Table 4 Total variance explained table in principal component analysis

表5 載荷矩陣分析Table 5 Loading matrix analysis

表6 不同濃度AgNPs對(duì)蒙古黃芪種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)綜合評(píng)價(jià)表Table 6 Comprehensive evaluation form of seed germination and seedling growth of A. mongholicus with different concentrations of AgNPs

圖4 不同濃度AgNPs對(duì)蒙古黃芪(a)、其他植物(b)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)參數(shù)RDA二維排序圖注：SL表示莖長(zhǎng)；◇表示AgNPs濃度區(qū)間，包括0、0～50 mg·L-1、50～100 mg·L-1、100～1 000 mg·L-1； 數(shù)據(jù)來(lái)源于參考文獻(xiàn)[6-9,11,15-21,23-25,27, 29-30]。Fig. 4 RDA two-dimensional ordination diagram of seed germination and seedling growth parameters of A. mongholicus (a) and other plants (b) with different concentrations of AgNPsNote: SL stands for shoot length; ◇ represents the AgNPs concentration range, including 0, 0～50 mg·L-1, 50～100 mg·L-1, 100～1 000 mg·L-1; data refers to references [6-9,11,15-21,23-25,27, 29-30].

納米顆粒對(duì)植物的影響體現(xiàn)在不同方面，首先根系被認(rèn)為是植物暴露于納米顆粒的主要途徑，可能導(dǎo)致植物的物理或化學(xué)毒性[22-23]。Gusev等[24]在含有AgNPs的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甜菜，發(fā)現(xiàn)根系生長(zhǎng)受到抑制。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與此一致，蒙古黃芪胚根的伸長(zhǎng)隨著AgNPs濃度的升高受到抑制。而且納米粒子可以由根部運(yùn)輸至葉片，或者被氣孔直接吸收蓄積在葉片等，葉片的生長(zhǎng)也會(huì)受到影響[25]。此外，葉綠素含量、含氮量及氧化應(yīng)激水平的變化可以解釋蒙古黃芪幼苗形態(tài)學(xué)的變化[26]。葉綠素和氮含量在AgNPs濃度為200 mg·L-1時(shí)開(kāi)始顯著降低，隨著AgNPs濃度升高，葉綠素含量降低，這與前人的研究結(jié)果一致[6,25]。10 mg·L-1的AgNPs激發(fā)黃芪幼苗產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶應(yīng)激，地上和地下部分CAT活性均明顯高于對(duì)照組。Cvjetko等[27]的研究表明一般根部暴露于較低濃度的AgNPs則引起較高的CAT活性。POD在10～400 mg·L-1AgNPs和SOD在10～200 mg·L-1AgNPs的范圍內(nèi)，二者地上和地下部分活性均高于對(duì)照組，說(shuō)明抗氧化酶系統(tǒng)在這個(gè)范圍內(nèi)較好保護(hù)了蒙古黃芪幼苗。在無(wú)壓力和壓力溫和的條件下，由于抗氧化酶的適當(dāng)活性，ROS的形成和去除達(dá)到平衡。而在較高濃度下，SOD活性增加不足以抵御ROS形成增加，ROS形成過(guò)量時(shí)防御系統(tǒng)可能無(wú)法承受[27]。故高濃度AgNPs (600 mg·L-1和1 000 mg·L-1)的毒性較強(qiáng)，蒙古黃芪幼苗體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)不足以抵抗，組織細(xì)胞受到一定的損傷，所以幼苗開(kāi)始發(fā)霉腐爛或死亡，不能正常生長(zhǎng)。有研究表明，AgNPs可通過(guò)影響植物體內(nèi)的活性氧、植物激素和能量代謝等途徑來(lái)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[28]。但是，具體的活性氧物質(zhì)以及AgNPs如何與植物互作還需進(jìn)一步研究。

圖5 不同濃度AgNPs對(duì)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)影響的平均效應(yīng)大小注：GI表示發(fā)芽指數(shù)；<50、50～100、100～1 000表示AgNPs濃度區(qū)間，包括<50 mg·L-1、50～100 mg·L-1、100～1 000 mg·L-1， 括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示樣本量，誤差線表示95%置信區(qū)間，數(shù)據(jù)來(lái)源于參考文獻(xiàn)[17-18,24,29]。Fig. 5 Mean effect sizes of different concentrations of AgNPs on plant seed germination and seedling growthNote: GI stands for germination index; <50, 50～100, 100～1 000 represent the AgNPs concentration range, including <50 mg·L-1, 50～100 mg·L-1, 100～1 000 mg·L-1; the number in parentheses represents the sample size for each variable; error bars represent 95% confidence intervals; data refers to references [17-18,24,29].

由于單一指標(biāo)并不能準(zhǔn)確全面地概括不同濃度AgNPs對(duì)蒙古黃芪的影響[13]，故對(duì)所有測(cè)定指標(biāo)的結(jié)果用隸屬函數(shù)法分析和主成分分析來(lái)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，二者雖然是不同的計(jì)算方法但結(jié)果一致，更加證明了結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明，低濃度的AgNPs可以促進(jìn)蒙古黃芪生長(zhǎng)發(fā)育，但隨著濃度的升高，產(chǎn)生抑制作用，高濃度AgNPs對(duì)蒙古黃芪甚至具有毒害作用，符合之前的研究結(jié)果[19,29-30]。冗余分析發(fā)現(xiàn)同一類型的指標(biāo)相關(guān)性較強(qiáng)，且濃度影響某些指標(biāo)的變化，尤其是CAT、POD和SOD，而預(yù)測(cè)結(jié)果和實(shí)際結(jié)果的其他各指標(biāo)和劃分的濃度區(qū)間分布位置和距離并不相同(圖4)，可能是受到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、種子或幼苗類型等的影響。而meta分析中AgNPs的3個(gè)濃度區(qū)間均影響植物根和莖的伸長(zhǎng)(圖5)，本研究結(jié)果符合這一預(yù)測(cè)結(jié)果。由此可以說(shuō)明，meta分析的結(jié)果比冗余分析更適用于單一物種趨勢(shì)的預(yù)測(cè)。綜上所述，AgNPs對(duì)單一植物蒙古黃芪的作用部分符合大數(shù)據(jù)分析的趨勢(shì)，這可能是由于AgNPs對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生的影響是綜合性結(jié)果，不同植物由于其不同的生長(zhǎng)時(shí)期(比如萌發(fā)期、幼苗期、花期和果期等)和生理特性(抗氧化系統(tǒng)活性、光合作用和氣孔開(kāi)合等)對(duì)環(huán)境條件的響應(yīng)表現(xiàn)出一定的差異性，故目前現(xiàn)存的數(shù)據(jù)挖掘分析結(jié)果并不能概括所有的植物類型。根據(jù)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)AgNPs對(duì)植物的影響可以概括為抑制(AgNPs表現(xiàn)出植物毒性)、促進(jìn)和無(wú)影響3種結(jié)果，因此在討論AgNPs對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響時(shí)，按照具體的植物類型來(lái)進(jìn)行分析是很有必要的。