楊雨桐，楊曉波，王尚，薛斌，李辰宇，趙辰，張曦，諶志強，王景峰，邱志剛

軍事科學院軍事醫(yī)學研究院環(huán)境醫(yī)學與作業(yè)醫(yī)學研究所，天津 300050

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是一種革蘭氏陽性球菌，廣泛分布于在動物、人體胃腸道內以及水體和土壤等環(huán)境中。其主要來源是人畜糞便，并通過飲食、呼吸以及皮膚接觸途徑感染人類，從而引起感染性心內膜炎、菌血癥等相關疾病[1-2]。糞腸球菌還可以作為一種指示微生物反映水環(huán)境中病原微生物的污染情況，對生態(tài)安全的風險控制具有重要意義[3]。糞腸球菌的細胞壁較厚，對氨基糖苷類及頭孢類抗生素具有固有耐藥性[4-5]。而近年來在畜牧業(yè)、水產養(yǎng)殖業(yè)以及臨床上廣泛應用的抗生素，也使得耐藥菌株尤其是多重耐藥菌株的檢出率呈現逐年遞增的趨勢。更加嚴重的是，世界各地均檢測出了目前仍無特效藥的耐萬古霉素腸球菌[6]。耐藥細菌可通過醫(yī)院廢水、畜牧廠廢水等各種途徑向環(huán)境中擴散，使自然水體或土壤中耐藥細菌廣泛傳播，進而通過食物鏈等途徑影響人類健康[7]。糞腸球菌多重耐藥性的急劇發(fā)展對人類健康及生態(tài)安全都構成了嚴重威脅，引發(fā)了科研人員的廣泛關注。

糞腸球菌耐藥的嚴峻之處在于其攜帶抗生素抗性基因的質粒、轉座子等可移動遺傳元件可通過水平轉移在種屬內或跨種屬的細菌間進行傳播，使其他更危險的細菌獲得耐藥性[8-9]?；蛟诩毦g的水平轉移主要分為轉化、轉導和接合3種方式，其中接合是指通過細菌間接觸從而轉移質粒的方式，其轉移質粒的頻率和效率最高[10]。質粒是獨立于染色體的能夠自我復制的閉合環(huán)狀DNA，有研究發(fā)現耐藥基因及其相關的可移動基因元件存在于質粒上，是引起細菌耐藥基因水平轉移的主要原因之一[11]。腸球菌質粒一般分為接合質粒和非接合質粒，接合質粒分為信息素調控質粒和非信息素調控質粒[12]。其中，信息素調控質粒在糞腸球菌菌屬中非常常見，其大小通常在37～128 kb，拷貝數較低，并且具有一種利用多肽信息素作為信號分子且僅限于腸球菌間轉移的特殊接合轉移機制[13-14]。信息素調控質粒相較于R質粒等其他質粒接合轉移頻率更高，耐藥基因擴散速度更快，自然狀態(tài)下R質粒接合頻率只有10-6[15]，而糞腸球菌攜帶質粒接合轉移頻率卻可達10-3，能夠造成耐藥基因的快速擴散。因此研究信息素調控質粒介導的糞腸球菌耐藥基因的接合轉移過程對防控耐藥基因水平轉移具有重要意義。

1 我國部分地區(qū)環(huán)境中糞腸球菌耐藥現狀(Current status of drug resistance of E. faecalis in the environment in some areas of China)

在全國各地的調研中發(fā)現，耐藥糞腸球菌檢出率逐年攀升，耐藥問題日趨嚴峻。不僅耐藥的范圍和類別逐步擴增，而且多重、交叉耐藥的現象也逐漸加劇。易秀麗等[16]從魚塘、污水溝等環(huán)境中分離出共99株糞腸球菌，其中污水溝中糞腸球菌對紅霉素、土霉素等耐藥率可達89.3%；多重耐藥現象也十分嚴重，其中21%的菌株可達五重耐藥。吳麗云等[17]從福建省部分河流中分離出糞腸球菌31株，發(fā)現其對紅霉素的耐藥率可達80.65%，對四環(huán)素的耐藥率也可達74.19%。陳玉紅等[18]從閩江流域的不同水樣中分離出40株腸球菌菌株，發(fā)現其對檢測的土霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素和氨芐西林5種常用抗生素均具有耐藥性，其中對土霉素的耐藥率可達70%。林云琴等[19]在養(yǎng)殖場管網水環(huán)境中分離出的42株腸球菌樣本中，呈多重耐藥趨勢，其中就包括對萬古霉素耐藥，其耐藥率可達14.29%。可見當前自然環(huán)境中糞腸球菌耐藥形勢嚴峻，對耐藥細菌蔓延的控制刻不容緩。隨著合理使用抗生素的意識逐步普及，以及糞腸球菌的實驗室監(jiān)測進一步深入，糞腸球菌的耐藥問題是可以得到控制的，因此深入透徹地研究糞腸球菌的耐藥機制也是非常必要的。

2 糞腸球菌耐藥基因轉移的機制(Drug resistance gene transfer mechanism of E. faecalis)

2.1 信息素調控質粒的主要特點

在臨床糞腸球菌分離株中，已鑒定出多種受到信息素調控的接合質粒，其中包括攜帶四環(huán)素抗性基因的pCF10質粒[20-21]，編碼溶血素的pAD1質粒[22]，攜帶萬古霉素抗性基因的pAM373質粒[23]等等。在信息素調控質粒介導的接合轉移過程中，多肽信息素將作為供、受體菌的配對信號，通過2種具有拮抗效應的信息素更高效地調控接合轉移過程[24-25]。信息素調控質粒的關鍵調控區(qū)域大部分是高度保守的，例如質粒pCF10、pAM373和pAD1在cDNA鏈上均攜帶2個5’末端存在重疊區(qū)域的操縱子，如圖1所示。這種結構可能導致轉錄干擾從而產生二者之間的相互負調控，在這個重疊區(qū)域內同時還編碼質粒的負調控信息素[26-30]。而正是由于關鍵調控區(qū)域的高度保守，使得信息素調控質粒的接合轉移現象和機制高度類似。本文將主要以接合質粒pCF10為例，探討信息素調控質粒介導的耐藥基因接合轉移的機制。pCF10可以編碼抗四環(huán)素的耐藥基因，也可以響應供體細胞對多肽信息素cCF10的感應從而進行快速且有效地傳播[31]。

圖1 信息素調控質粒中高度保守的調控區(qū)域[32]注：pCF10質粒、pAD1質粒和pAM373質粒的信息素調控區(qū)域的比較；PQ、PO、PX、PA分別表示prgQ、 iad、iam373、prgX和traA的轉錄起始點，重疊區(qū)域始于PQ和PO(表示為“1”)，終于PX和PA(對應數字為 重疊區(qū)域核苷酸序列長度)；重疊區(qū)域同時編碼負調控信息素iCF10、iAD1和iAM373，在負調控信息素編碼 基因與下游基因之間的區(qū)域，編碼調控RNA，進而控制轉錄終止子t1下游接合基因的轉錄。Fig. 1 Substantial conservation of the critical regulatory regions in pheromone-responsive plasmids [32]Note: Comparison of the pheromone-responsive region of pCF10 to the sex pheromone plasmids pAD1 and pAM373 in their regulatory regions; PQ, PO, PX, PA indicated the transcription start sites of prgQ, iad, iam373, prgX and traA; the overlapping region start from PQ and PO(indicated as “1”), and terminate in PX and PA(the length of nucleotides of the overlapping region indicated as revelant numbers); the overlapping region also encodes the inhibitor pheromone iCF10, iAD1 and iAM373; the region between the inhibitor determinant and the downstream genes is of great regulatory importance, as it is known to encode a small regulatory RNA that participates in controlling the transcription of conjugation genes downstream of the transcriptional terminator t1.

2.2 信息素調控質粒的主要機制

2.2.1 細胞間緊密接觸為接合轉移提供條件

糞腸球菌主要通過基因的水平轉移獲得抗生素抗性基因。糞腸球菌的臨床分離株中普遍存在可移動遺傳元件(MGEs)，如上文所述的pCF10、pAD1等接合質?；蜣D座子[33]。雖然信息素調控質?？稍诩S腸球菌中進行高效且高頻地水平傳播，但該質粒的轉移受到分子調控機制中信號分子的嚴格調控，并且只受到靠近提供質粒的供體細胞的受體細胞誘導[34]。在質粒轉移頻率較高的供、受體細胞混合培養(yǎng)液中，經?？梢杂^察到細菌細胞有明顯的聚集現象，這是由于接合轉移過程中在細菌細胞間緊密接觸形成了“接合橋”[35]。前期研究發(fā)現，在接合轉移過程中存在一種聚集誘導劑，可以誘導聚集形成從而促進細胞配對。相關的實驗結果也證實了聚集和質粒轉移之間存在正相關關系[36]。接合轉移過程中受體細胞將一系列信息素釋放到環(huán)境中，受到誘導的供體細胞對特異性的信息素做出特異性反應產生聚集誘導劑。聚集誘導劑是接合過程中質粒編碼產生的一種稱為“聚集性物質”的粘性蛋白，該蛋白可以促進配對形成，進而使得質粒從供體細胞轉移到受體細胞[37]。聚集性物質的表達促使供體細胞和受體細胞間進行緊密的物理接觸，使得供體的質粒轉移頻率高達10-1[34]。Olmsted等[38]通過用特定的抗Asc10抗體阻止聚集體的形成等實驗證實質粒pCF10的聚集誘導物質就是Asc10蛋白。受體細胞緊密地和供體細胞聯(lián)系在一起，使得供體細胞受信息素誘導加劇，最終促進質粒的轉移，為接合轉移提供了先決條件。

2.2.2 拮抗信號分子對接合轉移的影響

Clewell[39]在實驗中發(fā)現，將受體細胞的培養(yǎng)基濾液加入到供體細胞中，在沒有受體細胞的情況下也可以觀察到細胞間的聚集現象，加入受體細胞后也可以在短時間內發(fā)生接合轉移；若供體細胞未提前接觸受體細胞的培養(yǎng)基濾液，在較短時間內不會觀察到明顯的轉移現象。這使得人們了解到受體細胞分泌的信息素促進了供受體菌間耐藥基因的接合轉移。質粒pCF10的表達由受體細胞分泌的多肽信息素cCF10誘導[40]，使接合轉移基因和毒力基因高表達[32,41]。此外，pCF10質粒編碼的多肽iCF10充當cCF10的競爭性抑制劑，防止供體細胞分泌的內源信息素進行自我誘導，并且可以抑制緊鄰供體的受體細胞所分泌的cCF10的活性[32,42]。信息素cCF10和iCF10都是調節(jié)接合轉移過程的信號分子，且cCF10促進接合轉移進程，iCF10降低接合轉移進程，二者互為拮抗作用。而在其他的信息素應答質粒中也存在類似的拮抗信號分子對，例如質粒pAD1和pAM373同樣對各自的正調控信息素cAD1和cAM373做出應答，促進接合轉移，同時分別編碼各自的負調控信號分子多肽iAD1和iAM373作為競爭性抑制劑，防止自我誘導[43-46]。正調控信息素對質粒的接合轉移有積極的影響，而負調控信息素對質粒的接合轉移則有著負面調節(jié)的作用，二者之間相輔相成，互相調節(jié)，才使得接合轉移過程更加高效，耐藥基因擴散更加廣泛。

2.2.3 通過質粒編碼蛋白調控信息素的機制

信息素在進入細胞后，與一系列受體蛋白結合，從而影響接合轉移過程。以質粒pCF10為例，cCF10在進入受體細胞后，將與質粒pCF10編碼的主要轉錄調控因子PrgX結合[47-48]。當細胞中cCF10缺乏時，PrgX對編碼產生抑制劑iCF10的prgQ操縱子的啟動子(PQ)產生了抑制[49-50]。當供體細胞將cCF10導入受體細胞的細胞質，cCF10與PrgX結合后，PrgX對PQ的抑制將會解除，從而誘導接合轉移[31,51-53]。信息素cCF10和iCF10對誘導受體細胞過程的調節(jié)通過對信號肽受體蛋白PrgX的結構域調整實現。cCF10和iCF10都與PrgX的同一結構域結合，在與cCF10和iCF10結合形成的絡合物中，PrgX在晶體和溶液中都形成了四聚體，iCF10將穩(wěn)定四聚體結構，而cCF10與PrgX的結合將破壞四聚體的穩(wěn)定，使PrgX的結構發(fā)生了改變，其與操縱子prgQ結合位點間的相互作用被破壞[48,54]。所以當外源cCF10或產生cCF10的受體細胞加入，導致細胞內cCF10水平的增加，使PrgX結構從抑制構象轉變?yōu)榉且种茦嬒螅瑢е乱种平獬?，最終誘導接合的發(fā)生。pCF10通過誘導編碼iCF10的prgQ操縱子和質粒轉移所啟動的接合轉移機制如圖2所示[47]。除此之外，還有其余一些質粒編碼的蛋白也能影響接合轉移的過程，例如質粒編碼的膜蛋白PrgY，它可以降低由供體細胞所產生的信息素的活性。PrgY的胞外結構域可以與cCF10相互作用并對其進行修飾或降解，從而降低供體細胞的內源信息素活性[55]。又如質粒上prgU基因編碼的表面粘附素PrgU，Bhatty等[56]證明缺少prgU基因的細胞，cCF10的誘導具有高度毒性，會嚴重損害細胞包膜的完整性；而攜帶prgU基因的細胞過表達粘附素PrgU后，細胞對信息素不敏感，cCF10的誘導毒性降低。因此，PrgU對pCF10接合進程起到另一層負調控作用。總的來說，整個接合轉移過程由質粒pCF10攜帶的多個基因所編碼的不同種類的蛋白通過協(xié)同作用共同調節(jié)，通過相關基因蛋白調控信息素對供受體細胞的效應影響整個接合轉移進程。質粒pCF10是信息素調控質粒家族中的重要代表，研究其接合轉移機制對研究信息素調控質粒介導的接合轉移機制具有廣泛的參考價值，為防止環(huán)境中耐藥基因的擴散，維護生態(tài)安全也具有重要意義。

3 展望(Prospect)

綜上所述，糞腸球菌不但具有較強的天然耐藥性，更因其特殊的接合轉移機制，極易被誘導而發(fā)生高效的耐藥基因水平轉移。糞腸球菌還可以將耐藥基因水平傳遞給其他腸球菌或其他種屬的革蘭氏陽性菌，包括毒力更強的金黃色葡萄球菌，導致耐藥金黃色葡萄球菌的出現。一旦耐藥金黃色葡萄球菌出現并造成傳播，將會給人類健康和環(huán)境生態(tài)安全到來巨大的威脅[57]。目前已有研究證明，金屬離子、消毒副產物等環(huán)境因素在抗生素抗性基因的擴散中產生了巨大影響[58-60]。闡明環(huán)境影響因素下耐藥基因擴散規(guī)律和機制已成為環(huán)境科學領域的研究熱點，是阻斷耐藥基因產生和控制耐藥基因擴散不可或缺的科學基礎。環(huán)境因素影響耐藥基因擴散揭示了耐藥基因水平轉移的新途徑，同時也提示我們關注環(huán)境污染物的生物效應形式和機制，需要我們重新認識其在環(huán)境中的行為。例如目前水體環(huán)境中廣泛存在的具有生物活性或激素效應的環(huán)境污染物是否可以模擬信息素效應從而調控糞腸球菌中耐藥基因的接合轉移過程，還亟待進一步研究。

圖2 糞腸球菌中2種多肽信號對接合轉移的調控機制[47]注：拮抗信號分子cCF10和iCF10分別由受體細胞和供體細胞編碼，并被供體細胞攝?。辉诠w細胞中，這些信號分子競爭性地與PrgX結合； PrgX與iCF10的復合物抑制prgQ轉錄啟動，而PrgX與cCF10的復合物不抑制轉錄啟動；在未誘導的供體細胞中，prgQ轉錄產生轉錄本QS和 QL，二者編碼iCF10前體，前體被加工成iCF10后將分泌到胞外；當cCF10濃度足夠時，prgQ轉錄啟動，進一步影響下游基因表達。Fig. 2 Control of conjugation by two peptide signals in E. faecalis[47]Note: Antagonistic signaling molecules cCF10 and iCF10 are released by recipient and donor cells, respectively, and imported into the donor cell; these signals compete for binding to PrgX in donor cells; PrgX-iCF10 complexes repress transcription initiation of prgQ, whereas PrgX-cCF10 complexes do not; in uninduced donor cells, transcription of prgQ generates transcripts QS and QL; both of them encode for the preiCF10 polypeptide, which is processed into iCF10 and secreted into the extracellular; sufficient cCF10 is produced to induce prgQ transcription, encoding downstream genes.