楊雨桐，楊曉波，王尚，薛斌，李辰宇，趙辰，張曦，諶志強，王景峰，邱志剛

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是一種革蘭氏陽性球菌，廣泛分布于在動物、人體胃腸道內(nèi)以及水體和土壤等環(huán)境中。其主要來源是人畜糞便，并通過飲食、呼吸以及皮膚接觸途徑感染人類，從而引起感染性心內(nèi)膜炎、菌血癥等相關(guān)疾病[1-2]。糞腸球菌還可以作為一種指示微生物反映水環(huán)境中病原微生物的污染情況，對生態(tài)安全的風(fēng)險控制具有重要意義[3]。糞腸球菌的細(xì)胞壁較厚，對氨基糖苷類及頭孢類抗生素具有固有耐藥性[4-5]。而近年來在畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及臨床上廣泛應(yīng)用的抗生素，也使得耐藥菌株尤其是多重耐藥菌株的檢出率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢。更加嚴(yán)重的是，世界各地均檢測出了目前仍無特效藥的耐萬古霉素腸球菌[6]。耐藥細(xì)菌可通過醫(yī)院廢水、畜牧廠廢水等各種途徑向環(huán)境中擴散，使自然水體或土壤中耐藥細(xì)菌廣泛傳播，進(jìn)而通過食物鏈等途徑影響人類健康[7]。糞腸球菌多重耐藥性的急劇發(fā)展對人類健康及生態(tài)安全都構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，引發(fā)了科研人員的廣泛關(guān)注。

糞腸球菌耐藥的嚴(yán)峻之處在于其攜帶抗生素抗性基因的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可移動遺傳元件可通過水平轉(zhuǎn)移在種屬內(nèi)或跨種屬的細(xì)菌間進(jìn)行傳播，使其他更危險的細(xì)菌獲得耐藥性[8-9]。基因在細(xì)菌間的水平轉(zhuǎn)移主要分為轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合3種方式，其中接合是指通過細(xì)菌間接觸從而轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的方式，其轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的頻率和效率最高[10]。質(zhì)粒是獨立于染色體的能夠自我復(fù)制的閉合環(huán)狀DNA，有研究發(fā)現(xiàn)耐藥基因及其相關(guān)的可移動基因元件存在于質(zhì)粒上，是引起細(xì)菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的主要原因之一[11]。腸球菌質(zhì)粒一般分為接合質(zhì)粒和非接合質(zhì)粒，接合質(zhì)粒分為信息素調(diào)控質(zhì)粒和非信息素調(diào)控質(zhì)粒[12]。其中，信息素調(diào)控質(zhì)粒在糞腸球菌菌屬中非常常見，其大小通常在37～128 kb，拷貝數(shù)較低，并且具有一種利用多肽信息素作為信號分子且僅限于腸球菌間轉(zhuǎn)移的特殊接合轉(zhuǎn)移機制[13-14]。信息素調(diào)控質(zhì)粒相較于R質(zhì)粒等其他質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率更高，耐藥基因擴散速度更快，自然狀態(tài)下R質(zhì)粒接合頻率只有10-6[15]，而糞腸球菌攜帶質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率卻可達(dá)10-3，能夠造成耐藥基因的快速擴散。因此研究信息素調(diào)控質(zhì)粒介導(dǎo)的糞腸球菌耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移過程對防控耐藥基因水平轉(zhuǎn)移具有重要意義。

1 我國部分地區(qū)環(huán)境中糞腸球菌耐藥現(xiàn)狀(Current status of drug resistance of E. faecalis in the environment in some areas of China)

在全國各地的調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，耐藥糞腸球菌檢出率逐年攀升，耐藥問題日趨嚴(yán)峻。不僅耐藥的范圍和類別逐步擴增，而且多重、交叉耐藥的現(xiàn)象也逐漸加劇。易秀麗等[16]從魚塘、污水溝等環(huán)境中分離出共99株糞腸球菌，其中污水溝中糞腸球菌對紅霉素、土霉素等耐藥率可達(dá)89.3%；多重耐藥現(xiàn)象也十分嚴(yán)重，其中21%的菌株可達(dá)五重耐藥。吳麗云等[17]從福建省部分河流中分離出糞腸球菌31株，發(fā)現(xiàn)其對紅霉素的耐藥率可達(dá)80.65%，對四環(huán)素的耐藥率也可達(dá)74.19%。陳玉紅等[18]從閩江流域的不同水樣中分離出40株腸球菌菌株，發(fā)現(xiàn)其對檢測的土霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素和氨芐西林5種常用抗生素均具有耐藥性，其中對土霉素的耐藥率可達(dá)70%。林云琴等[19]在養(yǎng)殖場管網(wǎng)水環(huán)境中分離出的42株腸球菌樣本中，呈多重耐藥趨勢，其中就包括對萬古霉素耐藥，其耐藥率可達(dá)14.29%?？梢姰?dāng)前自然環(huán)境中糞腸球菌耐藥形勢嚴(yán)峻，對耐藥細(xì)菌蔓延的控制刻不容緩。隨著合理使用抗生素的意識逐步普及，以及糞腸球菌的實驗室監(jiān)測進(jìn)一步深入，糞腸球菌的耐藥問題是可以得到控制的，因此深入透徹地研究糞腸球菌的耐藥機制也是非常必要的。

2 糞腸球菌耐藥基因轉(zhuǎn)移的機制(Drug resistance gene transfer mechanism of E. faecalis)

2.1 信息素調(diào)控質(zhì)粒的主要特點

在臨床糞腸球菌分離株中，已鑒定出多種受到信息素調(diào)控的接合質(zhì)粒，其中包括攜帶四環(huán)素抗性基因的pCF10質(zhì)粒[20-21]，編碼溶血素的pAD1質(zhì)粒[22]，攜帶萬古霉素抗性基因的pAM373質(zhì)粒[23]等等。在信息素調(diào)控質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移過程中，多肽信息素將作為供、受體菌的配對信號，通過2種具有拮抗效應(yīng)的信息素更高效地調(diào)控接合轉(zhuǎn)移過程[24-25]。信息素調(diào)控質(zhì)粒的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域大部分是高度保守的，例如質(zhì)粒pCF10、pAM373和pAD1在cDNA鏈上均攜帶2個5’末端存在重疊區(qū)域的操縱子，如圖1所示。這種結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄干擾從而產(chǎn)生二者之間的相互負(fù)調(diào)控，在這個重疊區(qū)域內(nèi)同時還編碼質(zhì)粒的負(fù)調(diào)控信息素[26-30]。而正是由于關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域的高度保守，使得信息素調(diào)控質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移現(xiàn)象和機制高度類似。本文將主要以接合質(zhì)粒pCF10為例，探討信息素調(diào)控質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的機制。pCF10可以編碼抗四環(huán)素的耐藥基因，也可以響應(yīng)供體細(xì)胞對多肽信息素cCF10的感應(yīng)從而進(jìn)行快速且有效地傳播[31]。

圖1 信息素調(diào)控質(zhì)粒中高度保守的調(diào)控區(qū)域[32]注：pCF10質(zhì)粒、pAD1質(zhì)粒和pAM373質(zhì)粒的信息素調(diào)控區(qū)域的比較；PQ、PO、PX、PA分別表示prgQ、 iad、iam373、prgX和traA的轉(zhuǎn)錄起始點，重疊區(qū)域始于PQ和PO(表示為“1”)，終于PX和PA(對應(yīng)數(shù)字為 重疊區(qū)域核苷酸序列長度)；重疊區(qū)域同時編碼負(fù)調(diào)控信息素iCF10、iAD1和iAM373，在負(fù)調(diào)控信息素編碼 基因與下游基因之間的區(qū)域，編碼調(diào)控RNA，進(jìn)而控制轉(zhuǎn)錄終止子t1下游接合基因的轉(zhuǎn)錄。Fig. 1 Substantial conservation of the critical regulatory regions in pheromone-responsive plasmids [32]Note: Comparison of the pheromone-responsive region of pCF10 to the sex pheromone plasmids pAD1 and pAM373 in their regulatory regions; PQ, PO, PX, PA indicated the transcription start sites of prgQ, iad, iam373, prgX and traA; the overlapping region start from PQ and PO(indicated as “1”), and terminate in PX and PA(the length of nucleotides of the overlapping region indicated as revelant numbers); the overlapping region also encodes the inhibitor pheromone iCF10, iAD1 and iAM373; the region between the inhibitor determinant and the downstream genes is of great regulatory importance, as it is known to encode a small regulatory RNA that participates in controlling the transcription of conjugation genes downstream of the transcriptional terminator t1.

2.2 信息素調(diào)控質(zhì)粒的主要機制

2.2.1 細(xì)胞間緊密接觸為接合轉(zhuǎn)移提供條件

糞腸球菌主要通過基因的水平轉(zhuǎn)移獲得抗生素抗性基因。糞腸球菌的臨床分離株中普遍存在可移動遺傳元件(MGEs)，如上文所述的pCF10、pAD1等接合質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子[33]。雖然信息素調(diào)控質(zhì)?？稍诩S腸球菌中進(jìn)行高效且高頻地水平傳播，但該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移受到分子調(diào)控機制中信號分子的嚴(yán)格調(diào)控，并且只受到靠近提供質(zhì)粒的供體細(xì)胞的受體細(xì)胞誘導(dǎo)[34]。在質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率較高的供、受體細(xì)胞混合培養(yǎng)液中，經(jīng)?？梢杂^察到細(xì)菌細(xì)胞有明顯的聚集現(xiàn)象，這是由于接合轉(zhuǎn)移過程中在細(xì)菌細(xì)胞間緊密接觸形成了“接合橋”[35]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在接合轉(zhuǎn)移過程中存在一種聚集誘導(dǎo)劑，可以誘導(dǎo)聚集形成從而促進(jìn)細(xì)胞配對。相關(guān)的實驗結(jié)果也證實了聚集和質(zhì)粒轉(zhuǎn)移之間存在正相關(guān)關(guān)系[36]。接合轉(zhuǎn)移過程中受體細(xì)胞將一系列信息素釋放到環(huán)境中，受到誘導(dǎo)的供體細(xì)胞對特異性的信息素做出特異性反應(yīng)產(chǎn)生聚集誘導(dǎo)劑。聚集誘導(dǎo)劑是接合過程中質(zhì)粒編碼產(chǎn)生的一種稱為“聚集性物質(zhì)”的粘性蛋白，該蛋白可以促進(jìn)配對形成，進(jìn)而使得質(zhì)粒從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞[37]。聚集性物質(zhì)的表達(dá)促使供體細(xì)胞和受體細(xì)胞間進(jìn)行緊密的物理接觸，使得供體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率高達(dá)10-1[34]。Olmsted等[38]通過用特定的抗Asc10抗體阻止聚集體的形成等實驗證實質(zhì)粒pCF10的聚集誘導(dǎo)物質(zhì)就是Asc10蛋白。受體細(xì)胞緊密地和供體細(xì)胞聯(lián)系在一起，使得供體細(xì)胞受信息素誘導(dǎo)加劇，最終促進(jìn)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，為接合轉(zhuǎn)移提供了先決條件。

2.2.2 拮抗信號分子對接合轉(zhuǎn)移的影響

Clewell[39]在實驗中發(fā)現(xiàn)，將受體細(xì)胞的培養(yǎng)基濾液加入到供體細(xì)胞中，在沒有受體細(xì)胞的情況下也可以觀察到細(xì)胞間的聚集現(xiàn)象，加入受體細(xì)胞后也可以在短時間內(nèi)發(fā)生接合轉(zhuǎn)移；若供體細(xì)胞未提前接觸受體細(xì)胞的培養(yǎng)基濾液，在較短時間內(nèi)不會觀察到明顯的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。這使得人們了解到受體細(xì)胞分泌的信息素促進(jìn)了供受體菌間耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移。質(zhì)粒pCF10的表達(dá)由受體細(xì)胞分泌的多肽信息素cCF10誘導(dǎo)[40]，使接合轉(zhuǎn)移基因和毒力基因高表達(dá)[32,41]。此外，pCF10質(zhì)粒編碼的多肽iCF10充當(dāng)cCF10的競爭性抑制劑，防止供體細(xì)胞分泌的內(nèi)源信息素進(jìn)行自我誘導(dǎo)，并且可以抑制緊鄰供體的受體細(xì)胞所分泌的cCF10的活性[32,42]。信息素cCF10和iCF10都是調(diào)節(jié)接合轉(zhuǎn)移過程的信號分子，且cCF10促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移進(jìn)程，iCF10降低接合轉(zhuǎn)移進(jìn)程，二者互為拮抗作用。而在其他的信息素應(yīng)答質(zhì)粒中也存在類似的拮抗信號分子對，例如質(zhì)粒pAD1和pAM373同樣對各自的正調(diào)控信息素cAD1和cAM373做出應(yīng)答，促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移，同時分別編碼各自的負(fù)調(diào)控信號分子多肽iAD1和iAM373作為競爭性抑制劑，防止自我誘導(dǎo)[43-46]。正調(diào)控信息素對質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移有積極的影響，而負(fù)調(diào)控信息素對質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移則有著負(fù)面調(diào)節(jié)的作用，二者之間相輔相成，互相調(diào)節(jié)，才使得接合轉(zhuǎn)移過程更加高效，耐藥基因擴散更加廣泛。

2.2.3 通過質(zhì)粒編碼蛋白調(diào)控信息素的機制

信息素在進(jìn)入細(xì)胞后，與一系列受體蛋白結(jié)合，從而影響接合轉(zhuǎn)移過程。以質(zhì)粒pCF10為例，cCF10在進(jìn)入受體細(xì)胞后，將與質(zhì)粒pCF10編碼的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PrgX結(jié)合[47-48]。當(dāng)細(xì)胞中cCF10缺乏時，PrgX對編碼產(chǎn)生抑制劑iCF10的prgQ操縱子的啟動子(PQ)產(chǎn)生了抑制[49-50]。當(dāng)供體細(xì)胞將cCF10導(dǎo)入受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，cCF10與PrgX結(jié)合后，PrgX對PQ的抑制將會解除，從而誘導(dǎo)接合轉(zhuǎn)移[31,51-53]。信息素cCF10和iCF10對誘導(dǎo)受體細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)通過對信號肽受體蛋白PrgX的結(jié)構(gòu)域調(diào)整實現(xiàn)。cCF10和iCF10都與PrgX的同一結(jié)構(gòu)域結(jié)合，在與cCF10和iCF10結(jié)合形成的絡(luò)合物中，PrgX在晶體和溶液中都形成了四聚體，iCF10將穩(wěn)定四聚體結(jié)構(gòu)，而cCF10與PrgX的結(jié)合將破壞四聚體的穩(wěn)定，使PrgX的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，其與操縱子prgQ結(jié)合位點間的相互作用被破壞[48,54]。所以當(dāng)外源cCF10或產(chǎn)生cCF10的受體細(xì)胞加入，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cCF10水平的增加，使PrgX結(jié)構(gòu)從抑制構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榉且种茦?gòu)象，導(dǎo)致抑制解除，最終誘導(dǎo)接合的發(fā)生。pCF10通過誘導(dǎo)編碼iCF10的prgQ操縱子和質(zhì)粒轉(zhuǎn)移所啟動的接合轉(zhuǎn)移機制如圖2所示[47]。除此之外，還有其余一些質(zhì)粒編碼的蛋白也能影響接合轉(zhuǎn)移的過程，例如質(zhì)粒編碼的膜蛋白PrgY，它可以降低由供體細(xì)胞所產(chǎn)生的信息素的活性。PrgY的胞外結(jié)構(gòu)域可以與cCF10相互作用并對其進(jìn)行修飾或降解，從而降低供體細(xì)胞的內(nèi)源信息素活性[55]。又如質(zhì)粒上prgU基因編碼的表面粘附素PrgU，Bhatty等[56]證明缺少prgU基因的細(xì)胞，cCF10的誘導(dǎo)具有高度毒性，會嚴(yán)重?fù)p害細(xì)胞包膜的完整性；而攜帶prgU基因的細(xì)胞過表達(dá)粘附素PrgU后，細(xì)胞對信息素不敏感，cCF10的誘導(dǎo)毒性降低。因此，PrgU對pCF10接合進(jìn)程起到另一層負(fù)調(diào)控作用?？偟膩碚f，整個接合轉(zhuǎn)移過程由質(zhì)粒pCF10攜帶的多個基因所編碼的不同種類的蛋白通過協(xié)同作用共同調(diào)節(jié)，通過相關(guān)基因蛋白調(diào)控信息素對供受體細(xì)胞的效應(yīng)影響整個接合轉(zhuǎn)移進(jìn)程。質(zhì)粒pCF10是信息素調(diào)控質(zhì)粒家族中的重要代表，研究其接合轉(zhuǎn)移機制對研究信息素調(diào)控質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移機制具有廣泛的參考價值，為防止環(huán)境中耐藥基因的擴散，維護生態(tài)安全也具有重要意義。

3 展望(Prospect)

綜上所述，糞腸球菌不但具有較強的天然耐藥性，更因其特殊的接合轉(zhuǎn)移機制，極易被誘導(dǎo)而發(fā)生高效的耐藥基因水平轉(zhuǎn)移。糞腸球菌還可以將耐藥基因水平傳遞給其他腸球菌或其他種屬的革蘭氏陽性菌，包括毒力更強的金黃色葡萄球菌，導(dǎo)致耐藥金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)。一旦耐藥金黃色葡萄球菌出現(xiàn)并造成傳播，將會給人類健康和環(huán)境生態(tài)安全到來巨大的威脅[57]。目前已有研究證明，金屬離子、消毒副產(chǎn)物等環(huán)境因素在抗生素抗性基因的擴散中產(chǎn)生了巨大影響[58-60]。闡明環(huán)境影響因素下耐藥基因擴散規(guī)律和機制已成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，是阻斷耐藥基因產(chǎn)生和控制耐藥基因擴散不可或缺的科學(xué)基礎(chǔ)。環(huán)境因素影響耐藥基因擴散揭示了耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的新途徑，同時也提示我們關(guān)注環(huán)境污染物的生物效應(yīng)形式和機制，需要我們重新認(rèn)識其在環(huán)境中的行為。例如目前水體環(huán)境中廣泛存在的具有生物活性或激素效應(yīng)的環(huán)境污染物是否可以模擬信息素效應(yīng)從而調(diào)控糞腸球菌中耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移過程，還亟待進(jìn)一步研究。

圖2 糞腸球菌中2種多肽信號對接合轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制[47]注：拮抗信號分子cCF10和iCF10分別由受體細(xì)胞和供體細(xì)胞編碼，并被供體細(xì)胞攝??；在供體細(xì)胞中，這些信號分子競爭性地與PrgX結(jié)合； PrgX與iCF10的復(fù)合物抑制prgQ轉(zhuǎn)錄啟動，而PrgX與cCF10的復(fù)合物不抑制轉(zhuǎn)錄啟動；在未誘導(dǎo)的供體細(xì)胞中，prgQ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本QS和 QL，二者編碼iCF10前體，前體被加工成iCF10后將分泌到胞外；當(dāng)cCF10濃度足夠時，prgQ轉(zhuǎn)錄啟動，進(jìn)一步影響下游基因表達(dá)。Fig. 2 Control of conjugation by two peptide signals in E. faecalis[47]Note: Antagonistic signaling molecules cCF10 and iCF10 are released by recipient and donor cells, respectively, and imported into the donor cell; these signals compete for binding to PrgX in donor cells; PrgX-iCF10 complexes repress transcription initiation of prgQ, whereas PrgX-cCF10 complexes do not; in uninduced donor cells, transcription of prgQ generates transcripts QS and QL; both of them encode for the preiCF10 polypeptide, which is processed into iCF10 and secreted into the extracellular; sufficient cCF10 is produced to induce prgQ transcription, encoding downstream genes.