宋京洋,李澤昌,楊婧,王思予,池勾劍,崔源源,趙靜,劉薇
大連理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院,工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大連 116024
污水經(jīng)處理后回用于農(nóng)田灌溉、城市景觀補(bǔ)給、洗車和工業(yè)用水,甚至被用于飲用水,是應(yīng)對(duì)淡水資源稀缺的重要替代水源。目前,污水處理廠通常以傳統(tǒng)的活性污泥和膜生物反應(yīng)器等處理技術(shù)為基礎(chǔ),盡管處理后排水的理化參數(shù)滿足當(dāng)?shù)鼗蛐袠I(yè)相應(yīng)的排放標(biāo)準(zhǔn),但仍殘留低濃度有毒物質(zhì)或形成毒性產(chǎn)物[1]。例如,Xue等[2]研究發(fā)現(xiàn),現(xiàn)行的污水處理工藝(例如砂濾、混凝、活性炭吸附和消毒)對(duì)內(nèi)毒素的處理效果較低,再生水的回用使內(nèi)毒素的人體暴露水平升高。此外,某二級(jí)處理排水樣品中檢測(cè)到了遺傳毒性作用,而進(jìn)水并未檢測(cè)出遺傳毒性,可能在處理過(guò)程中形成了遺傳毒物[3]。再生水中殘留的有毒有害污染物可以通過(guò)多種暴露途徑直接或間接對(duì)人體健康產(chǎn)生有害影響。因此,須對(duì)再生水回用進(jìn)行綜合毒性評(píng)估,有利于保障再生水回用的安全性[4]。歐美許多國(guó)家已開始推行毒性評(píng)估廢水管理法律法規(guī)[5]。發(fā)光細(xì)菌、藻類和魚類等水生生物毒性評(píng)估結(jié)果無(wú)法直接外推至人體健康,基于大鼠小鼠等哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)仍存在種屬差異的問題,同時(shí)受倫理學(xué)和周期成本等限制。
體外生物毒性測(cè)試在復(fù)合型污染特征下可敏感、準(zhǔn)確地量化環(huán)境混合物的綜合生物效應(yīng)[6],但目前仍較為缺乏面向人體健康的體外生物毒性模型。本研究選擇人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)為體外模型,評(píng)估典型二級(jí)處理、三級(jí)處理和濕地修復(fù)技術(shù)對(duì)污水綜合毒性的削減。人源干細(xì)胞是一種前景良好的體外毒理學(xué)模型,目前已應(yīng)用于典型環(huán)境污染物的毒性預(yù)測(cè)、評(píng)估和毒性機(jī)制解析,但在環(huán)境復(fù)合污染毒性評(píng)估中的應(yīng)用極為有限。筆者在前期研究中,利用hBMSCs研究地表水的毒性特征,結(jié)果表明基于hBMSCs的測(cè)試對(duì)水體復(fù)合污染在分子和細(xì)胞水平造成的有害效應(yīng)具有良好的靈敏性、重現(xiàn)性及人體健康相關(guān)性[7-8]。此外,本研究將基于人源干細(xì)胞的綜合毒性評(píng)價(jià)結(jié)果與常用的發(fā)光菌急性毒性測(cè)試進(jìn)行比較。研究結(jié)果有助于更好地了解人源干細(xì)胞對(duì)水體復(fù)合污染的毒性響應(yīng)特征,為排水的人體健康效應(yīng)評(píng)估以及提升水處理技術(shù)的毒性削減效能提供科學(xué)依據(jù)和參考方法。
水樣采自大連市、沈陽(yáng)市和哈爾濱市的4個(gè)城鎮(zhèn)二級(jí)污水處理廠(A~D)、天津某再生水廠(E)和海口市某濕地公園(F)。采集各廠進(jìn)水、主要工藝出水和最終出水,以超純水作為流程空白。城鎮(zhèn)二級(jí)污水處理廠(A~D)主要工藝均由活性污泥法和紫外消毒工藝組成,且進(jìn)水主要來(lái)源為生活污水混有少量的工業(yè)廢水。再生水廠(E)的進(jìn)水主要來(lái)源為多個(gè)城鎮(zhèn)二級(jí)污水處理廠排水,經(jīng)混凝、微濾、反滲透和臭氧氧化三級(jí)處理工藝再次處理后排放回用。濕地公園(F)的進(jìn)水主要為生活污水,預(yù)處理后經(jīng)梯級(jí)潛流濕地和河流型濕地處理排放。A~F廠最終出水化學(xué)需氧量(COD)和氨氮均達(dá)到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn),并回用于城市雜用水、景觀用水和河道補(bǔ)給(圖1)。
采集水樣貯存在塑料桶中,立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用0.7 μm(Waters, GF/B, 47 mm)玻璃纖維濾膜過(guò)濾水樣后,在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行COD和氨氮理化參數(shù)的測(cè)定[9]。將水樣進(jìn)行富集濃縮,采用HLB(6 mL, 500 mg, OASIS, Waters, USA)萃取柱萃取水中有機(jī)物,用二氯甲烷和甲醇進(jìn)行洗脫,將洗脫液經(jīng)氮吹后用200 μL二甲基亞砜(DMSO)定容[10]。
明亮發(fā)光桿菌T3小種(PhotobacteriumphosphoreumT3spp)購(gòu)自浙江清華長(zhǎng)三角研究院(浙江,中國(guó))。將1 mL復(fù)蘇液注入裝有凍干粉的安瓿瓶中,充分混勻。2 min后在暗室中可肉眼觀察到菌液發(fā)光,即復(fù)蘇完成。采用3% NaCl(m∶m)稀釋濃縮菌液至合適濃度,作為后續(xù)測(cè)試菌液。實(shí)驗(yàn)采用3% NaCl作為空白對(duì)照,并用3% NaCl稀釋水樣。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)已確定正式實(shí)驗(yàn)濃度范圍,設(shè)定不同梯度濃度的水樣作為實(shí)驗(yàn)組。明亮發(fā)光桿菌菌液與水樣充分混勻15 min后,用原子摩爾冷光檢測(cè)儀(Lumin Max-C, Maxwell Sensors Inc)測(cè)定明亮發(fā)光桿菌的發(fā)光強(qiáng)度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行,重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)均<30%。發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)抑制率與各工藝出水急性毒性成正比,計(jì)算公式如下:
人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)購(gòu)自廣州賽業(yè)公司(廣州,中國(guó))。培養(yǎng)條件控制為37 ℃、5% CO2和飽和濕度,細(xì)胞復(fù)蘇、傳代至6代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度達(dá)到85%以上時(shí),進(jìn)行消化接板。含有0.1% DMSO(V∶V)的培養(yǎng)基設(shè)為對(duì)照組,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)已確定正式實(shí)驗(yàn)濃度范圍,用含有0.1% DMSO的培養(yǎng)基將水樣萃取物稀釋為不同的濃度梯度作為實(shí)驗(yàn)組。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行,重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD均<30%。暴露48 h后吸出暴露液,加入配制的CCK-8工作液,設(shè)定僅含有CCK-8工作液的背景空白孔,37 ℃孵育1.5~2 h后,用酶標(biāo)儀(Spark, Tecan)450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度,并根據(jù)如下公式計(jì)算細(xì)胞毒性。
圖1 代表性城鎮(zhèn)二級(jí)、三級(jí)污水處理廠和濕地修復(fù)技術(shù)處理流程和采樣點(diǎn)分布Fig. 1 Treatment process and sampling points of representative urban secondary and tertiary sewage treatment plants and wetland restoration technique
根據(jù)濃度-效應(yīng)關(guān)系計(jì)算水樣萃取物對(duì)發(fā)光菌和hBMSCs產(chǎn)生毒性效應(yīng)強(qiáng)度分別為20%和50%的濃度即EC20和EC50。由于EC20和EC50的大小與急性毒性效應(yīng)強(qiáng)弱呈反比,為更直觀地評(píng)價(jià)2種模型的急性毒性,故采用1/EC20和毒性單位(toxicity unit, TU)來(lái)進(jìn)行比較。根據(jù)如下公式計(jì)算TU值:
TU=1/EC50
使用SPSS 16.0的單因素分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性差異分析。
盡管各個(gè)工藝水樣在未經(jīng)富集濃縮條件下(即稀釋度100%)對(duì)發(fā)光菌沒有產(chǎn)生顯著的急性毒性。進(jìn)一步將水樣富集濃縮后進(jìn)行暴露,發(fā)光抑制效應(yīng)呈明顯的劑量依賴性(圖2)。部分水樣的有機(jī)萃取物在稀釋度100%(REF1)時(shí)對(duì)發(fā)光菌產(chǎn)生顯著的急性毒性,主要原因可能為水樣中的有機(jī)萃取物相對(duì)于水中的其他組分毒性更強(qiáng)。4個(gè)二級(jí)城鎮(zhèn)污水處理廠中,A、B和C最終排水的發(fā)光抑制效應(yīng)較進(jìn)水均有所減弱,經(jīng)二級(jí)處理工藝后分別削減了88.9%、57.1%和66.7%。但其中經(jīng)D廠工藝處理后,發(fā)光菌的發(fā)光抑制作用顯著增強(qiáng)了1倍。這說(shuō)明盡管大部分二級(jí)處理可以有效去除水中毒性物質(zhì),但過(guò)程中潛在毒性副產(chǎn)物的生成也主要取決于不同的水質(zhì)特點(diǎn)和處理的工藝條件。與本研究相似,某污水廠排水的生物發(fā)光抑制作用在物種敏感度分布模型(SSD)中都超過(guò)了影響5%水生生物的危險(xiǎn)濃度(HC5)的上限,對(duì)水生生物可能造成較高風(fēng)險(xiǎn)[11]。三級(jí)城鎮(zhèn)污水處理廠(E)進(jìn)水經(jīng)混凝、微濾和反滲透處理后,對(duì)發(fā)光菌無(wú)明顯毒性。但經(jīng)臭氧消毒后,毒性較反滲透出水增強(qiáng),但仍略低于進(jìn)水。比較1/EC20,再生水E廠對(duì)于進(jìn)水的發(fā)光菌急性毒性的削減率為66.8%。濕地公園(F)修復(fù)技術(shù)對(duì)進(jìn)水的發(fā)光菌急性毒性削減了45.6%。
城鎮(zhèn)二級(jí)、三級(jí)污水處理廠和濕地公園進(jìn)水和各主要工藝出水對(duì)hBMSCs產(chǎn)生的細(xì)胞毒性呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖2)。4個(gè)二級(jí)城鎮(zhèn)污水處理廠(A~D)主要采用活性污泥法結(jié)合紫外消毒工藝,隨著工藝的深入,細(xì)胞毒性顯著降低。大連某污水處理廠A的主要工藝特點(diǎn)為改良A2O工藝結(jié)合紫外消毒,A廠各工藝出水的TU分別為0.06、0.03和0.02,出水細(xì)胞毒性低于進(jìn)水。大連某污水處理廠B的主要工藝為序批式活性污泥法(SBR)結(jié)合紫外消毒工藝。由B廠各工藝出水的EC50可計(jì)算得到進(jìn)水和出水的TU分別為0.11和0.03,細(xì)胞毒性總體削減率為35.0%。哈爾濱某污水處理廠C對(duì)細(xì)胞毒性的削減率為40.0%。沈陽(yáng)某污水處理廠D進(jìn)水和出水的TU分別為0.05和0.02,細(xì)胞毒性削減率為60.0%。
天津某再生水廠E的三級(jí)處理工藝,主要包括混凝、微濾結(jié)合反滲透及臭氧化消毒。經(jīng)混凝處理后,污水細(xì)胞毒性沒有顯著變化,提示混凝對(duì)細(xì)胞毒物的削減能力較低。經(jīng)微濾和反滲透單元處理后,污水的細(xì)胞毒性逐漸降低,比較1/EC20,微濾的毒性削減率為29.9%。但是經(jīng)臭氧消毒后,細(xì)胞毒性反而升高了10.8%。與發(fā)光菌急性毒性測(cè)試結(jié)果一致,提示可能在臭氧消毒過(guò)程中產(chǎn)生了毒性較強(qiáng)的消毒副產(chǎn)物。與本研究結(jié)果相似,有文獻(xiàn)報(bào)道臭氧消毒處理后,污水對(duì)大鼠的急性毒性[12]和細(xì)胞遺傳毒性升高[13]。但也有研究與本研究結(jié)果不同,加拿大蒙特利爾某污水處理廠的臭氧消毒工藝使雌激素活性降低98.0%以上,雄激素活性去除68.0%以上,而抗雌激素活性保持不變[14]。表明廢水的特性可能會(huì)影響臭氧消毒過(guò)程中毒性的變化。
??谀碀竦毓珗@F的水樣的細(xì)胞毒性隨著再生水萃取物濃度的升高而降低。進(jìn)水的細(xì)胞毒性(抑制率)范圍為42.7%~54.0%,出水用于當(dāng)?shù)鼐坝^湖的生態(tài)補(bǔ)給,其細(xì)胞毒性為50.4%~84.9%。比較各工藝排水的1/EC20,預(yù)處理和人工濕地對(duì)水體污染的細(xì)胞毒性削減率分別為45.1%和49.4%,總削減率為72.3%。結(jié)果表明該生態(tài)修復(fù)工藝對(duì)于二級(jí)處理工藝排水中有毒有害物質(zhì)能夠進(jìn)一步去除。出水用于湖泊和河流生態(tài)補(bǔ)給,有利于提高再生水景觀回用的安全性。
圖2 城鎮(zhèn)二級(jí)、三級(jí)污水廠和濕地修復(fù)技術(shù)水樣有機(jī)萃取物對(duì)發(fā)光菌和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs) 毒性效應(yīng)的濃度-效應(yīng)關(guān)系注:REF表示相對(duì)富集倍數(shù),NC表示陰性對(duì)照;數(shù)據(jù)代表平均值±樣本標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE),n=3;*P≤0.05、 **P≤0.01、***P≤0.001,與對(duì)照組相比。Fig. 2 Concentration-response relationship of the toxicity caused by organic extractions of water samples from urban secondary and tertiary sewage treatment plants and wetland effluents in luminescent bacteria and human stem cellsNote: REF stands for related fold enrichment; NC stands for negative control; data represents mean±SE, n=3; *P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001, compared with the control.
采用A~F進(jìn)出水的TU值或1/EC20計(jì)算削減率,對(duì)比城鎮(zhèn)二級(jí)、三級(jí)處理廠和濕地修復(fù)技術(shù)對(duì)發(fā)光菌和人源干細(xì)胞的綜合毒性去除效果(圖3)。代表性二級(jí)處理、三級(jí)處理和濕地生態(tài)修復(fù)技術(shù)的對(duì)于人源干細(xì)胞毒性的削減率分別為59.8%、-10.8%和49.9%,對(duì)發(fā)光菌急性毒性的削減率分別為74.6%、66.8%和25.0%。二級(jí)處理和三級(jí)處理技術(shù)對(duì)污水hBMSCs細(xì)胞毒性的削減率低于發(fā)光菌急性毒性,但濕地修復(fù)技術(shù)對(duì)細(xì)胞毒性的削減率高于發(fā)光菌急性毒性。結(jié)果提示,濕地修復(fù)技術(shù)對(duì)污水細(xì)胞毒性可能具有良好的削減能力。此外,二級(jí)處理技術(shù)和濕地生態(tài)修復(fù)技術(shù)對(duì)于綜合毒性的削減率低于COD和NH3-N的削減率,提示污水中殘留的難降解有機(jī)污染物毒性相對(duì)較強(qiáng)。
通過(guò)比較水樣萃取物對(duì)于發(fā)光菌和人源干細(xì)胞的毒性效應(yīng)強(qiáng)度,分析排水綜合毒性評(píng)價(jià)的物種靈敏度。污水有機(jī)萃取物對(duì)hBMSCs的毒性高于發(fā)光菌,66.7%(14/21)水樣品對(duì)于hBMSCs細(xì)胞毒性的TU值高于發(fā)光菌急性毒性測(cè)試結(jié)果(圖4)。因此,在檢測(cè)排水的毒性效應(yīng)中,人源干細(xì)胞比發(fā)光菌更為靈敏。對(duì)于反映水處理工藝過(guò)程中的毒性削減趨勢(shì),發(fā)光菌急性毒性監(jiān)測(cè)測(cè)定得到的毒性削減率平均是人源干細(xì)胞相應(yīng)劑量值的1.5倍,這說(shuō)明污水對(duì)發(fā)光菌的急性毒性相對(duì)較容易削減,而殘留的難降解有機(jī)污染物對(duì)人源干細(xì)胞毒性較強(qiáng),提示排水中有毒有害污染物對(duì)人體健康的潛在危害。此外,還可能和不同測(cè)定方法本身的特點(diǎn)及污水處理工藝的實(shí)際運(yùn)行條件有關(guān)[15]。
人源干細(xì)胞毒性和發(fā)光菌毒性的TU和COD、氨氮呈顯著正相關(guān)關(guān)系(圖5)。Ma等[16]報(bào)道,高濃度廢水的COD可能與發(fā)光菌毒性存在明顯的相關(guān)性,而低濃度廢水的毒性與COD的相關(guān)性則不太明顯。Roig等[17]發(fā)現(xiàn),某污水處理廠污水污泥中的總氮與通過(guò)水樣萃取物的Microtox?試驗(yàn)獲得發(fā)光菌的EC50值呈顯著負(fù)相關(guān),與本研究結(jié)果相一致。但對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定的2種受試生物的1/EC20,發(fā)現(xiàn)一般毒性結(jié)果與COD、氨氮的結(jié)果無(wú)相關(guān)關(guān)系,說(shuō)明低效應(yīng)濃度/無(wú)效應(yīng)濃度與理化指標(biāo)無(wú)明顯相關(guān)性。已有研究結(jié)果表明理化參數(shù)的降低并不等同于毒性的削減。應(yīng)結(jié)合毒性實(shí)驗(yàn)作為水質(zhì)理化指標(biāo)監(jiān)測(cè)的重要補(bǔ)充[18],對(duì)于保障再生水水質(zhì)安全具有重要意義。
傳統(tǒng)的水處理方法無(wú)法有效去除微量污染物[19]。盡管系統(tǒng)中半揮發(fā)性有機(jī)物(SVOC)的總濃度在μg·L-1或更低水平,但它們對(duì)人體的負(fù)面影響日益引起人們的關(guān)注。人源干細(xì)胞和發(fā)光菌的TU值與城鎮(zhèn)二級(jí)、三級(jí)中檢測(cè)到的SVOC組分濃度進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果表明,hBMSCs的TU值與各工藝排水中SVOC的總濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P≤0.01,r=0.45)。單獨(dú)分析城鎮(zhèn)二級(jí)和三級(jí)的TU與各自的理化參數(shù)和SVOC總濃度相關(guān)性,毒性指標(biāo)均與SVOC總濃度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系。再一次提示污水中殘留的有機(jī)污染物會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。盡管污水中有機(jī)微污染物的濃度水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其效應(yīng)濃度,但大量不同的污染物之間可能會(huì)通過(guò)聯(lián)合作用產(chǎn)生有害影響[20]。
圖3 不同處理工藝對(duì)發(fā)光菌和人源干細(xì)胞毒性的削減效果注:a城鎮(zhèn)二級(jí)污水處理廠(A、B、C)削減率均值; b毒性指標(biāo)采用“1/EC20”進(jìn)行削減率計(jì)算;COD表示化學(xué)需氧量; SVOC表示半揮發(fā)性有機(jī)物;ND表示由于濕地 水樣未進(jìn)行SVOC濃度測(cè)定,所以無(wú)SVOC削減率結(jié)果。Fig. 3 Removal of toxicity on luminescent bacteria and human stem cells by different treatment processesNote: a indicates average reduction of urban secondary sewage treatment plants (A, B, C); b indicates “1/EC20” is used to calculate the reduction; COD stands for chemical oxygen demand; SVOC stands for semi-volatile organic compounds; ND stands for no SVOC reduction of wetland effluents due to the lack of SVOC concentration measurement.
圖4 不同處理工藝排水對(duì)hBMSCs和發(fā)光菌綜合 毒性的毒性單位(TU)值的比較注:ND表示未檢測(cè)出。Fig. 4 Comparison of toxicity unit (TU) for integrate toxicity evaluation of effluent from different treatment processes in luminescent bacteria and human stem cellsNote: ND represents not detected.
圖5 污水TU、理化參數(shù)及SVOC總濃度相關(guān)性分析注:a城鎮(zhèn)二級(jí)、三級(jí)處理工藝排水中SVOC總濃度;*P≤0.05、**P≤0.01、***P≤0.001,與對(duì)照組相比。Fig. 5 Correlation analysis of sewage TU, physico-chemical parameters and total concentration of SVOCNote: a means total SVOC concentration of urban secondary and tertiary sewage treatment plants; *P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001, compared with the control.
城鎮(zhèn)污水再生回用是解決淡水資源危機(jī)和水資源污染的重要措施,但再生水中殘留的有毒有害污染物在其回用過(guò)程中對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成潛在威脅。本研究利用人源干細(xì)胞測(cè)試典型污水處理技術(shù)對(duì)污水綜合毒性的削減效果,結(jié)果提示污水處理廠排水中殘留的難降解有機(jī)污染物對(duì)人源干細(xì)胞具有較強(qiáng)的有害效應(yīng),細(xì)胞毒性強(qiáng)于發(fā)光菌急性毒性,二級(jí)處理技術(shù)對(duì)細(xì)胞毒性的削減率為74.6%,低于COD和NH3-N的去除率,三級(jí)處理過(guò)程中經(jīng)混凝、微濾和反滲透處理后,出水無(wú)顯著細(xì)胞毒性,但經(jīng)臭氧消毒后最終排水的細(xì)胞毒性較進(jìn)水無(wú)顯著變化,提示人源干細(xì)胞對(duì)于消毒副產(chǎn)物形成較為敏感。此外,濕地修復(fù)技術(shù)對(duì)污水細(xì)胞毒性削減率為49.4%,對(duì)污水綜合毒性的削減可能具有良好的前景。初步研究結(jié)果表明人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)水體污染物毒性響應(yīng)較靈敏,應(yīng)進(jìn)一步研究排水對(duì)干細(xì)胞分化潛能的影響。干細(xì)胞的增殖和分化與個(gè)體發(fā)育密切相關(guān),適于篩查污染物的發(fā)育毒性,而發(fā)育毒性正是消毒副產(chǎn)物等水體污染物的重要健康危害之一。研究結(jié)果為再生水水質(zhì)安全性評(píng)價(jià)以及城鎮(zhèn)污水資源化技術(shù)研發(fā)提供參考依據(jù)和方法。需要指出的是,本研究所選取的污水處理項(xiàng)目較為有限,毒性指標(biāo)限于一般毒性,仍需面向更大范圍的污水處理廠進(jìn)行包括遺傳毒性和發(fā)育毒性等敏感指標(biāo)的毒性評(píng)估。