余曉瑞,裴滬榮,龍力,方磊,龍章富

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都,610065)

塊菌(Truffle)是一種珍稀食藥兩用真菌,屬于盤(pán)菌綱(Discomycetes)、塊菌目(Tuberales)、塊菌科(Tuberaceae)、塊菌屬(Tuber)[1]。目前我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的塊菌資源有60余種,其中西南地區(qū)資源最為豐富[2],而攀枝花和會(huì)東是我國(guó)最早開(kāi)發(fā)塊菌資源的地區(qū)。國(guó)產(chǎn)黑塊菌包括印度塊菌復(fù)合種、中華夏塊菌、假凹陷塊菌等,其中中華塊菌屬于印度塊菌復(fù)合種[3]。

塊菌子實(shí)體中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素等成分,塊菌含有能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等活性成分[4-5]。塊菌中所含的尿苷能作為藥物治療貧血以及心血管方面的疾病,肌醇能夠降低膽固醇、促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、供給腦細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)等,花生四烯酸在維持機(jī)體細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能方面發(fā)揮著重要的作用[6]。目前國(guó)內(nèi)塊菌研究主要集中在對(duì)塊菌形態(tài)、孢子形態(tài)以及揮發(fā)性物質(zhì)研究,且以塊菌干品為對(duì)象的研究較多,對(duì)新鮮塊菌以及攀枝花地區(qū)和會(huì)東地區(qū)塊菌成分差異性對(duì)比分析的相關(guān)研究較少,傳統(tǒng)方法無(wú)法有效區(qū)分塊菌產(chǎn)地,內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)鑒定的方法適合于真菌物種的鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的鑒定分析,會(huì)東和攀枝花的中華塊菌在ITS間隔區(qū)上差異較小,所以只用ITS分子鑒定法不能區(qū)分兩地中華塊菌。

本文利用GC-MS技術(shù)對(duì)來(lái)自攀枝花和會(huì)東地區(qū)的中華塊菌組成成分和含量進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)主成分分析方法(principal components analysis,PCA)、偏最小二乘分析法(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析,分析了兩地塊菌的組成成分、對(duì)比了兩地成分含量的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

塊菌(新鮮),分別采自涼山州會(huì)東縣嘎吉鎮(zhèn),攀枝花市中壩鄉(xiāng)(2021年1月,經(jīng)ITS鑒定為中華塊菌)。

會(huì)東嘎吉鎮(zhèn)：屬中亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣侯區(qū),光熱資源豐富,四季如春,晝夜溫差大,雨量集中,干濕季分明,多年平均降水量1 058 mm,雨熱同季,地貌氣候復(fù)雜多樣,垂直差異十分明顯。

攀枝花中壩鄉(xiāng)：屬于亞熱帶季風(fēng)及南亞熱帶亞濕潤(rùn)氣候,夏季長(zhǎng),日溫差大,年溫差小,降雨少而集中,冬半年日照充足,少雨干暖；夏半年云雨較多,氣候涼爽；由于地形的多樣性,氣候垂直差異顯著。

甲醇、乙腈、己烷、異丙醇、N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺、三甲基一氯硅烷、甲氧基胺鹽酸鹽、吡啶、肉豆蔻酸(D27,98%),美國(guó)默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀、5975C MSD質(zhì)譜儀、DB5-MS(30 m×250 μm×0.25 μm)色譜柱,安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 塊菌樣品準(zhǔn)備

對(duì)來(lái)自攀枝花市的新鮮塊菌組編號(hào)為PZH-B組,會(huì)東縣的新鮮塊菌組為PZH-S組。每組3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 GC-MS樣本的制備

稱量5 mg塊菌樣本,加入1 mL提取劑[V(異丙醇)∶V(乙腈)∶V(水)=3∶2∶2],加入5 μL 3 mg/mL肉豆蔻酸(D27,98%)溶液,渦旋 1 min；4 ℃,13 000 r/min離心5 min,取800 μL上清液氮吹干燥。

衍生化處理：首先加入20 μL 40 mg/mL甲氧基胺鹽酸鹽/吡啶,30 ℃衍生90 min；接著加入90 μL含體積分?jǐn)?shù)1%三甲基一氯硅烷的N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺,37 ℃衍生 30 min,4 ℃離心(13 000 r/min)5 min,取60 μL的上清液上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 檢測(cè)條件

采用Agilent DB5-MS(30 m×250 μm×0.25 μm)色譜柱,體積流量1.1 mL/min,分流比為10∶1,進(jìn)樣口溫度250 ℃,接口溫度230 ℃。色譜柱升溫方式為程序升溫,起始溫度60 ℃,保持1 min。以10 ℃/min的速率升到300 ℃,保持10 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度250 ℃,四級(jí)桿溫度150 ℃,溶劑延遲5.9 min,檢測(cè)范圍m/z50～500。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

將采集到的原始數(shù)據(jù)使用Agilent Chrom Station software(Agilent Technologies,USA)轉(zhuǎn)換成通用格式。在R軟件平臺(tái)下,進(jìn)行峰的識(shí)別,保留時(shí)間對(duì)齊,自動(dòng)積分等預(yù)處理。使用夢(mèng)圖數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)圖譜對(duì)比,匹配度大于80%作為鑒定依據(jù),對(duì)所測(cè)的成分進(jìn)行定性定量分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 攀枝花和會(huì)東地區(qū)中華塊菌的PCA

本研究將PZH-B和PZH-S兩組通過(guò)GC-MS檢測(cè)得到的成分進(jìn)行主成分分析,結(jié)果如圖1所示。PC-1(49.6%)與PC-2(21.7%)累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為71.3%,說(shuō)明降維時(shí)保留了GC-MS結(jié)果的主要有用信息,能夠較好地反映結(jié)果信息。PZH-B和PZH-S兩組團(tuán)聚性都較差,PC-1與PC-2未能將PZH-B組和PZH-S組分離開(kāi),表明攀枝花中華塊菌和會(huì)東中華塊菌的組成成分差異小。

圖1 攀枝花和會(huì)東塊菌主成分分析Fig.1 PCA of T.sinense (Panzhihua) and T.sinense (huidong)

2.2 攀枝花和會(huì)東中華塊菌中檢測(cè)出的氨基酸

選取攀枝花地區(qū)和會(huì)東地區(qū)1月的新鮮塊菌組織進(jìn)行GC-MS檢測(cè),將得到的產(chǎn)物進(jìn)行分類(lèi),攀枝花地區(qū)塊菌和會(huì)東地區(qū)塊菌共鑒定出15種氨基酸,如表1所示。

表1 兩地塊菌中檢測(cè)出的氨基酸成分Table 1 Amino acid components detected in truffles from two areas

15種氨基酸中有8種為必需氨基酸：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸；7種為非必需氨基酸：脯氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、賴氨酸。氨基酸是塊菌特征風(fēng)味化合物之一。其中天冬氨酸是鮮味型；蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸是甜味型；纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸是苦味型。陶愷等[7]在對(duì)中國(guó)塊菌的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值鑒定中表明,中國(guó)塊菌蛋白質(zhì)含量豐富,富含人體所需的8種必需氨基酸,而黑孢塊菌中甲硫氨酸未被檢測(cè)出；任新軍等[8]在對(duì)中華夏塊菌、假喜馬拉雅塊菌、攀枝花白塊菌的氨基酸檢測(cè)中未檢測(cè)出半胱氨酸。不同地區(qū)的塊菌氨基酸成分不同可能與當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境、降水等因素有關(guān)。

2.3 攀枝花和會(huì)東中華塊菌中的糖類(lèi)測(cè)定

選取攀枝花地區(qū)和會(huì)東地區(qū)1月的新鮮塊菌組織進(jìn)行GC-MS檢測(cè),將得到的產(chǎn)物進(jìn)行分類(lèi),攀枝花地區(qū)塊菌和會(huì)東地區(qū)塊菌共鑒定出10種糖類(lèi)(表2),分別為巖藻糖、2-脫氧-L-核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、N-乙酰氨基葡萄糖、棉子糖。糖類(lèi)是塊菌成分中重要的組成成分之一,塊菌抗氧化活性、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤抗癌的作用都與其體內(nèi)的多糖有關(guān)。李美鳳等[9]在對(duì)塊菌的多糖提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定實(shí)驗(yàn)中表明塊菌多糖是由甘露糖、葡萄糖和鼠李糖組成,其中葡萄糖的含量高達(dá)95%。BHOTMANGE等[10]對(duì)塊菌多糖進(jìn)行提取的實(shí)驗(yàn)中表明,鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖是多種塊菌多糖的重要組成成分；有的塊菌也含有特殊多糖,如巖藻糖、阿拉伯糖,如印度塊菌、棕紅塊菌[11-12]。

表2 兩地塊菌中檢測(cè)出的糖類(lèi)成分Table 2 Saccharides detected in truffles from two areas

2.4 攀枝花和會(huì)東縣塊菌中的有機(jī)酸

選取攀枝花地區(qū)和會(huì)東地區(qū)1月的新鮮塊菌組織進(jìn)行GC-MS檢測(cè),將得到的產(chǎn)物進(jìn)行分類(lèi),攀枝花地區(qū)塊菌和會(huì)東地區(qū)塊菌共鑒定出22種有機(jī)酸(表3),有機(jī)酸類(lèi)化合物可作用于中樞神經(jīng),具有抗菌,升高白細(xì)胞等作用[13]。ANGELINIA等[14]研究表明,多不飽和脂肪酸是塊菌脂肪酸的主要成分,主要為亞油酸、油酸、硬脂酸、棕櫚酸。

表3 兩地塊菌中檢測(cè)出的有機(jī)酸Table 3 Organic acids detected in truffles from two areas

2.5 攀枝花和會(huì)東中華塊菌組成成分含量分析

將PZH-S組和PZH-B組中的6個(gè)新鮮松露樣本進(jìn)行PLS-DA分析,找到2組之間的差別。圖2為PLS-DA分析成分含量差異的載荷圖,能夠反映組成成分對(duì)樣本組間區(qū)分的貢獻(xiàn)度,成分在loading 1和loading 2方向上離中心點(diǎn)(0,0)越遠(yuǎn)對(duì)區(qū)分樣本組所作的貢獻(xiàn)越大,通過(guò)圖2可以看出,肌醇半乳糖苷、山梨醇、反油酸乙酯等多個(gè)組成成分距離中心點(diǎn)較遠(yuǎn),它們對(duì)樣本區(qū)分做出了突出貢獻(xiàn)。通過(guò)這些有差異的物質(zhì)可以對(duì)PZH-B組與PZH-S組進(jìn)行區(qū)分。

圖2 PLS-DA組成成分含量差異載荷圖Fig.2 PLS-DA loading plot of different component

圖3為2組具有顯著性差異的15種組成成分及其在2組中的含量對(duì)比圖,變量投影重要性指標(biāo)(variable importance in projection,VIP)值越大,該成分在樣本的區(qū)分中所作的貢獻(xiàn)越大,紅色為相對(duì)高濃度,藍(lán)色為相對(duì)低濃度。通過(guò)圖3可以看出,PZH-B與PZH-S在15種組成成分上有顯著差異,并對(duì)這15種組成成分在2組中含量的高低做出了對(duì)比。在15種組成成分中,有10種成分PZH-S組含量高于PZH-B組,有5種PZH-B組含量高于PZH-S組。其中差異最大的組成成分為肌醇半乳糖苷,PZH-S組含量高于PZH-B組。PZH-S組中的尿苷、肌醇、2-哌啶甲酸、異亮氨酸、十八烷酸、脯氨酸、亞油酸、花生四烯酸、亮氨酸也高于PZH-B組。張世奇等[15]的研究中表明9-(E)-十八烯酸是會(huì)東塊菌的主要香氣成分之一。香氣成分是塊菌的品種重要指標(biāo)之一,產(chǎn)地對(duì)食用菌的香氣成分含量有重要影響[16-17]。1-辛烯-3-醇是大多數(shù)食用菌的重要芳香化合物之一,而亞油酸是合成1-辛烯-3-醇的前體[18]。本研究中對(duì)兩地中華塊菌成分含量通過(guò)PLS-DA進(jìn)行差異成分分析,共找到了15種差異成分,肌醇半乳糖苷、尿苷、肌醇、亞氨基二乙酸、山梨醇、2-哌啶甲酸、正亮氨酸、亞油酸、異亮氨酸、3-羥基-吡啶、脯氨酸、9-(E)-十八烯酸、花生四烯酸、2-氨基-2-去甲菠烷羧酸、亮氨酸。其中,會(huì)東地區(qū)中華塊菌在9-(E)-十八烯酸和亞油酸的含量上都高于攀枝花地區(qū)的塊菌。

圖3 顯著性差異的組成成分及其在2組中的含量對(duì)比圖Fig.3 Comparison of components with significant differences in content in truffles from two areas

3 結(jié)論

本文通過(guò)攀枝花和會(huì)東地區(qū)的中華塊菌進(jìn)行GC-MS檢測(cè),共檢測(cè)出了15種氨基酸,其中8種為必需氨基酸。在會(huì)東和攀枝花塊菌中檢測(cè)出了10種糖類(lèi),在兩地中均檢測(cè)出巖藻糖,它是松露多糖的重要組成成分。在會(huì)東和攀枝花中華塊菌中檢測(cè)出22種有機(jī)酸,多為不飽和脂肪酸。在15種含量差異化組成成分中,有10種成分會(huì)東組含量高于攀枝花組,有5種攀枝花組含量高于會(huì)東組。其中差異最大的組成成分為肌醇半乳糖苷,會(huì)東組含量高于攀枝花組。會(huì)東組中的尿苷、肌醇、2-哌啶甲酸、異亮氨酸、十八烷酸、脯氨酸、亞油酸、花生四烯酸、亮氨酸也高于攀枝花組。

塊菌具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,塊菌多糖和有機(jī)酸在塊菌抗氧化、抑菌、抗腫瘤上發(fā)揮著重要作用[19]。隨著對(duì)塊菌研究的深入,塊菌的價(jià)值被不斷開(kāi)發(fā),通過(guò)對(duì)會(huì)東地區(qū)和攀枝花地區(qū)的塊菌成分分析,找到了兩地中華塊菌在含量上有顯著性差異的化合物,這有利于對(duì)中華塊菌更好地進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分,更合理地開(kāi)采和利用塊菌資源。