連思雨,朱姍姍,張紫娟,謝瑜杰,范春林,陳輝*,王明林*

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安,271018) 2(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京,100176)

枸杞顏色鮮艷、口感較好,富含胡蘿卜素、維生素及氨基酸等成分,因其較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥理作用作為高值產(chǎn)品深受大眾喜愛[1-2]。研究表明,不同產(chǎn)地枸杞受氣候、光照等因素影響品質(zhì)存在較大差異[3],其市場價(jià)格差異在數(shù)倍到十倍之間。建立切實(shí)可行的枸杞產(chǎn)地判別方法,不僅能改善枸杞市場現(xiàn)狀,增強(qiáng)消費(fèi)者購買信心,而且有利于枸杞生產(chǎn)者進(jìn)行品牌建設(shè),提高經(jīng)濟(jì)利益,同時(shí)也維護(hù)了消費(fèi)者的權(quán)益[4],對(duì)保護(hù)枸杞產(chǎn)業(yè)合理有序發(fā)展發(fā)揮一定的作用。

近年來,國內(nèi)外利用穩(wěn)定同位素溯源的相關(guān)研究明顯增加[5]。RASHMI等[6]和OCVIRK等[7]分別研究了意大利小麥中δ13C、δ15N值和啤酒花中δ13C、δ15N、δ34S值,肯定了穩(wěn)定同位素與地理環(huán)境的關(guān)系；PIANEZZE等[8]測定了意大利紅皮蒜樣品中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S 5種穩(wěn)定同位素比值分析意大利樣品,使用SIMCA分析軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)和判別(discriminant analysis,DA)分析,結(jié)合線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)和K近鄰算法(K nearest neighbor,K-NN)等方法建立模型；KANG等[9]測定海參中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O 4種同位素比值實(shí)現(xiàn)產(chǎn)地判別。同時(shí),穩(wěn)定同位素技術(shù)在國內(nèi)也取得一定成果,張建輝等[10]測定湖南3個(gè)產(chǎn)地茶葉樣品中5種重金屬元素同位素比值,結(jié)合SAS進(jìn)行聚類分析和判別分析,判別分析結(jié)果為86.96%；佘僧等[11]綜述了近年來穩(wěn)定同位素分析技術(shù)結(jié)合PCA、LDA和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis,OPLS-DA)等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法在蜂蜜的產(chǎn)地識(shí)別及品種判別方面應(yīng)用的研究進(jìn)展。由此可見,穩(wěn)定同位素技術(shù)進(jìn)行高值產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源方面應(yīng)用已經(jīng)較為成熟,此外,其在中藥[12-13]、乳肉制品[14-15]以及谷物果蔬[16-18]等各類產(chǎn)品的產(chǎn)地判別方面也得到了廣泛應(yīng)用。穩(wěn)定同位素以其方便、可靠、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)在農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地判別方面表現(xiàn)出非常樂觀的應(yīng)用前景。

近幾年,應(yīng)用色譜、色譜-質(zhì)譜和紅外光譜測定有機(jī)物和礦物元素對(duì)不同產(chǎn)地枸杞進(jìn)行差異化研究的報(bào)道相對(duì)較多[19],但是利用穩(wěn)定同位素進(jìn)行枸杞溯源的研究并不多見。孟靖[20]測定了青海、寧夏和甘肅枸杞中檸檬烯、四甲基吡嗪等具有代表性的揮發(fā)性化合物的碳穩(wěn)定同位素值;BERTOLDI等[21]測定意大利和亞洲共21份枸杞樣品中5種輕穩(wěn)定同位素比值以及57種礦物元素含量和14種類胡蘿卜素,這些研究仍存在前處理技術(shù)要求較高、判別準(zhǔn)確率較低以及枸杞樣本量較少等局限。張森燊[22]測定枸杞以及土壤中的20種礦物元素以及同位素進(jìn)行產(chǎn)地判別,判別模型傾向于對(duì)中寧枸杞與周邊地區(qū)枸杞的區(qū)分,對(duì)青海產(chǎn)區(qū)尚未提及。因此,建立準(zhǔn)確可靠的模型對(duì)枸杞主要產(chǎn)地進(jìn)行判別是很有必要的。

本文應(yīng)用穩(wěn)定同位素測定了采自青海、寧夏和新疆3個(gè)地區(qū)共97份地理信息可靠的枸杞樣品的5種穩(wěn)定同位素比值,應(yīng)用LDA和支持向量機(jī)(support vector machine,SVM)分別建立了不同產(chǎn)地枸杞判別模型。本文對(duì)測定的枸杞穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行分析,不僅為枸杞產(chǎn)地鑒別提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),而且應(yīng)用有效的化學(xué)計(jì)量法建立青海、寧夏和新疆3個(gè)主產(chǎn)區(qū)的判別模型,為枸杞產(chǎn)地判別提供了有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集地理信息來源可靠的枸杞樣品97份,其中青海38份、寧夏33份、新疆26份。穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)IAEA-CH-7(δ2H=-100.3‰VSMOW)、IAEA-601(δ18O=23.3‰)、USGS43(δ34S=+10.46‰,δ15N=+8.44‰)均為美國地質(zhì)勘探局Reston穩(wěn)定同位素實(shí)驗(yàn)室研制；穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)炭黑GBW04407(δ13C=-22.43‰VPDB)由石油勘探開發(fā)科學(xué)研究院研制。

1.2 儀器與設(shè)備

烘箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；多功能料理機(jī),九陽股份有限公司；超微量天平,梅特勒-托列多儀器上海有限公司；Flash 2000元素分析儀、Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀,美國賽默飛世爾公司；vario PYRO cube元素分析儀,德國 Elementar 公司；isoprime 100同位素質(zhì)譜儀,英國 isoprime 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

取適量干果枸杞樣品置于65 ℃烘箱中加熱12～24 h[13],烘干后待枸杞冷卻用料理機(jī)粉碎至粉末狀態(tài),裝入100 mL樣品瓶備用。

1.3.2 測定方法

碳、氮、硫同位素比值的測定：取3～5 mg粉末狀枸杞樣品于錫杯(5 mm×8 mm)中壓實(shí)包好后直接放入元素分析儀(vario PYRO,elementar)自動(dòng)進(jìn)樣器中,在高溫下燃燒、還原,最終生成CO2、N2和SO2,經(jīng)過吸附與解析的過程,按照N2、CO2、SO2的順序先后進(jìn)入同位素比率質(zhì)譜儀(isoprime,elementar)進(jìn)行檢測。以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)炭黑、USGS43進(jìn)行單點(diǎn)校正,每隔12個(gè)樣品插入1個(gè)標(biāo)物。儀器長期標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2‰。

儀器檢測條件：氧化管溫度為1 150 ℃,還原管溫度為850 ℃,通氧時(shí)間為70 s,元素分析儀氦氣吹掃流量為230 mL/min,進(jìn)入質(zhì)譜儀氦載氣流量為100 mL/min,高純N2、CO2、SO2(純度>99.999%)為參考?xì)狻?/p>

氫、氧同位素比值的測定：取約4 mg粉末枸杞樣品,用銀杯(3.2 mm×4 mm)包好壓實(shí)后放入元素分析儀(FALSA 2000,Thermo Fisher)自動(dòng)進(jìn)樣器中,在高溫下裂解成H2和CO進(jìn)入同位素比率質(zhì)譜儀(Delta V Advantage)進(jìn)行檢測。以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)IAEA-CH-7、IAEA-601進(jìn)行單點(diǎn)校正,每隔6個(gè)樣品插入1個(gè)標(biāo)物。儀器長期標(biāo)準(zhǔn)偏差為6‰。

儀器檢測條件：左爐燃燒管溫度為1 450 ℃,色譜柱溫度90 ℃,氦氣流速100 mL/min,高純H2和O2為參考?xì)狻?/p>

穩(wěn)定同位素比值的計(jì)算如公式(1)所示：

δ‰=(R樣品-R標(biāo)準(zhǔn))/R標(biāo)準(zhǔn)×1 000

(1)

式中：R樣品,測試樣品中重同位素與輕同位素豐度比值,即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H、34S/32S；R標(biāo)準(zhǔn),國際標(biāo)準(zhǔn)樣的重同位素與輕同位素豐度比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S在不同地區(qū)枸杞中的分布

由于植物生長的氣候、大氣成分、海拔、土壤、地形、水源及代謝類型等因素會(huì)導(dǎo)致同位素在植物體內(nèi)發(fā)生自然分餾效應(yīng),植物體內(nèi)的同位素比值信息相應(yīng)地反映植物所處的生長環(huán)境信息,基于此,穩(wěn)定同位素技術(shù)在產(chǎn)地溯源方面得到了廣泛應(yīng)用。

將本文測定的不同產(chǎn)地枸杞樣本中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S導(dǎo)入Origin軟件分析,所得箱線圖反映了不同產(chǎn)地間穩(wěn)定同位素比值差異趨勢(shì),見圖1。不同產(chǎn)地枸杞中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值均存在顯著差異。

碳同位素比值青海地區(qū)最高,平均值為-25.43‰；其次是新疆,δ13C平均值為-26.14‰,范圍為-27.46‰～-25.12‰；寧夏地區(qū)最低,38份寧夏枸杞樣品碳同位素比值為-27.06‰,3個(gè)產(chǎn)地δ13C值為-27.71‰～-24.06‰；由圖1可知,青海采樣點(diǎn)枸杞樣品δ15N值相對(duì)高于其他地區(qū),為1.37‰～9.058‰,平均值為5.08‰,其次是寧夏和新疆,δ15N值分別為0.21‰～4.70‰、-2.64‰～3.92‰,平均值分別為2.68‰和0.62‰；不同地區(qū)枸杞中氫穩(wěn)定同位素比值從高到低依次是新疆、寧夏、青海,平均值分別為-77.91‰、-92.41‰、-101.89‰；氧穩(wěn)定同位素比值青海最高,平均值為33.68‰,其次是新疆和寧夏,平均值分別為31.44‰、30.72‰,相比氫穩(wěn)定同位素差異范圍較??；硫穩(wěn)定同位素比值箱線圖顯示,青海、新疆、寧夏δ34S平均值分別8.10‰、7.45‰、6.84‰,由差異性分析可知,青海和寧夏枸杞δ34S值存在顯著差異,新疆枸杞與青海、寧夏枸杞δ34S值無明顯差異。

a-C；b-N；c-H；d-O；e-S圖1 三個(gè)產(chǎn)地C、N、H、O、S穩(wěn)定同位素比值箱線圖Fig.1 Box-plot of stable carbon,nitrogen,hydrogen,oxygen and sulfur isotope ratios in three common wolfberry producing areas 注：不同小寫字母表差異顯著(P<0.05)

2.2 主成分分析

選取3個(gè)地區(qū)具有代表性的樣品將數(shù)據(jù)以指數(shù)進(jìn)行歸一化處理,導(dǎo)入MPP進(jìn)行主成分分析,根據(jù)第1主成分和第2主成分的得分分布圖(圖2)可以看出,青海和寧夏枸杞樣品的距離相對(duì)較遠(yuǎn),寧夏枸杞樣品基本位于第1主成分的正半軸,青海的枸杞樣品基本位于第2主成分的負(fù)半軸,因此,第1主成分可以基本將青海和寧夏地區(qū)的樣品分開。新疆枸杞在第1主成分的正半軸和負(fù)半軸均有分布,但基本位于第2主成分的負(fù)半軸,前2個(gè)主成分可以解釋75.29%的變量。

因子載荷值的絕對(duì)值越大,代表該同位素在主成分中的方差貢獻(xiàn)率越大。結(jié)合該模型載荷分布圖來看,第1主成分中δ13C值、δ18O值的載荷值在區(qū)別枸杞產(chǎn)地時(shí)方差貢獻(xiàn)率較大,分別為60.0%和63.3%；在第2主成分中δ15N方差貢獻(xiàn)率最大為74.1%,其次是δ2H。由圖1可知,不同產(chǎn)地枸杞δ13C、δ18O、δ15N、δ2H值變化在同位素箱線圖中差異趨勢(shì)均較為明顯,但不同產(chǎn)地枸杞中δ34S值與其他穩(wěn)定同位素相比差異性相對(duì)較弱,這與主成分分析結(jié)果一致,δ13C、δ18O、δ15N、δ2H對(duì)枸杞產(chǎn)地判別均發(fā)揮了不同程度的作用。

■-寧夏；▲-青海；●-新疆圖2 不同地區(qū)枸杞PCA得分分布圖Fig.2 PCA score distribution of wolfberry in different regions

結(jié)合2.1分析結(jié)果,不同產(chǎn)地枸杞中的穩(wěn)定同位素比值與各地區(qū)采樣地點(diǎn)的地理位置以及海拔高度、降水等因素有密切的聯(lián)系,采樣點(diǎn)間環(huán)境條件的差異影響了不同產(chǎn)地枸杞同位素比值的差異性。

2.3 判別模型建立

在產(chǎn)地溯源研究中,分散的采樣點(diǎn)及龐大的數(shù)據(jù)量需依靠化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,這對(duì)結(jié)果可視化起到不可或缺的作用,無監(jiān)督(PCA等)及有監(jiān)督的識(shí)別方法(LDA、SVM等)均被廣泛應(yīng)用。

LDA是一種有監(jiān)督判別方法,以投影后類內(nèi)方差最小,類間方差最大的原則對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行降維,實(shí)現(xiàn)樣品的分類。PIANEZZE等[8]應(yīng)用LDA建立蒜的判別模型；與LDA類似,SVM是通過已知樣品集的特點(diǎn),建立分析模型應(yīng)用于對(duì)未知樣品集的判別,在農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地判別及溯源等研究領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用,判別效果較好。因此,本文選用LDA和SVM 2種算法對(duì)幾個(gè)地區(qū)枸杞進(jìn)行建模。

2.3.1 基于LDA的枸杞產(chǎn)地判別模型

應(yīng)用LDA算法進(jìn)行模型驗(yàn)證時(shí),寧夏枸杞和青海枸杞各有1個(gè)樣品被誤判為新疆枸杞,判別率分別為97.4%和97.0%,LDA模型在判別新疆樣品時(shí),18個(gè)新疆樣品可以被準(zhǔn)確判別,模型驗(yàn)證對(duì)3個(gè)產(chǎn)地枸杞的整體判別率為89.7%；交叉訓(xùn)練時(shí)所有青海枸杞樣品均能被準(zhǔn)確識(shí)別,新疆僅有5個(gè)樣品分別被誤判為青海枸杞和寧夏枸杞,交叉訓(xùn)練模型整體的準(zhǔn)確率為93.8%。將不同產(chǎn)地的枸杞樣品的前2個(gè)判別函數(shù)作模型圖(圖3),可以直觀地看出不同產(chǎn)地來源的枸杞有其各自的空間分布特征,其中寧夏枸杞和青海枸杞分布相對(duì)較遠(yuǎn),新疆枸杞和寧夏、青海的枸杞均有不同程度的重合,導(dǎo)致新疆枸杞判別準(zhǔn)確率較低,這可能與枸杞樣本量有關(guān),未來實(shí)驗(yàn)將考慮增加實(shí)驗(yàn)樣本,提升枸杞判別的準(zhǔn)確率。

■-寧夏；▲-青海；●-新疆圖3 三個(gè)產(chǎn)地枸杞樣品前2個(gè)判別函數(shù)得分圖Fig.3 Scatter plots of wolfberry samples from three producing areas on the first two discriminant functions

2.3.2 基于SVM的枸杞產(chǎn)地判別模型

使用SVM算法在進(jìn)行模型初始驗(yàn)證時(shí),寧夏枸杞有1個(gè)樣品被誤判為新疆枸杞,模型判別率為97.4%,青海枸杞均被準(zhǔn)確識(shí)別,判別準(zhǔn)確率為100%,新疆枸杞有1個(gè)樣品被誤判別為青海枸杞,2個(gè)樣品被誤判為寧夏枸杞,判別率相對(duì)較低為88.5%。在模型訓(xùn)練的結(jié)果中,青海枸杞和寧夏枸杞均能被準(zhǔn)確識(shí)別,新疆枸杞有3個(gè)樣品被誤判,與模型初始驗(yàn)證的結(jié)果一致。但模型初始驗(yàn)證和模型訓(xùn)練時(shí)準(zhǔn)確率分別為95.9%和96.9%,可以實(shí)現(xiàn)大部分枸杞的產(chǎn)地甄別。由表1可知,SVM算法建立的判別模型在初始驗(yàn)證和模型訓(xùn)練的準(zhǔn)確性相對(duì)較高,判別效果明顯優(yōu)于LDA模型?；诜€(wěn)定同位素含量結(jié)合化學(xué)計(jì)量法建立青海、寧夏和新疆枸杞的判別模型是可行的。

表1 LDA和SVM模型預(yù)測準(zhǔn)確率Table 1 The accuracy of LDA and SVM models

3 結(jié)論與討論

枸杞作為藥材及養(yǎng)生佳品持續(xù)出現(xiàn)在大眾視野,產(chǎn)地來源對(duì)其價(jià)格產(chǎn)生了較大影響,建立切實(shí)可行的產(chǎn)地判別方法尤為重要。植物中的同位素比值受氣候、環(huán)境等條件的影響表現(xiàn)出不同的產(chǎn)地特征。青海、寧夏和新疆是目前枸杞的主要原產(chǎn)地,本文通過簡便快捷的前處理過程測定枸杞中穩(wěn)定同位素比值,結(jié)合化學(xué)計(jì)量法建立產(chǎn)地判別模型實(shí)現(xiàn)了這3個(gè)產(chǎn)地枸杞的快速判別,具有明顯的優(yōu)勢(shì)和可行性。

枸杞是典型的C3植物,δ13C值通常為-35‰～-20‰[23],本文測定其δ13C值為-27.71‰～-24.06‰,與文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果一致,不同產(chǎn)地枸杞δ13C值存在顯著差異,說明了環(huán)境因素對(duì)δ13C值的影響,肯定碳同位素在判別不同產(chǎn)地同源植物時(shí)的作用。δ15N值變化往往會(huì)受到大氣環(huán)境、土壤類型等因素的影響,較環(huán)境因素而言,化學(xué)肥料造成的土壤中含氮量不同導(dǎo)致δ15N值差異的影響要更大。李安等[24]在產(chǎn)地溯源中提到,施用有機(jī)肥的農(nóng)作物樣品中δ15N值明顯高于施用無機(jī)化肥樣品,由2.1分析結(jié)果可知,青海枸杞δ15N值明顯高于寧夏和青海,近年來青海枸杞產(chǎn)地發(fā)展勢(shì)頭較好,與施用有機(jī)肥是密不可分的。

植物中δ2H值和δ18O值通常受蒸騰作用、降水和海拔等因素的影響,常用作載體進(jìn)行產(chǎn)地溯源分析[25]。將寧夏產(chǎn)區(qū)枸杞中H、O同位素比值導(dǎo)入SPSS軟件以雙變量進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn),結(jié)果顯示在0.01水平上相關(guān)性顯著,如圖4所示。這與H和O都是水的組成因素,在水循環(huán)過程中有著相似的分餾作用有關(guān)。氫穩(wěn)定同位素比值通常隨海拔的升高而降低,3個(gè)地區(qū)采樣點(diǎn)海拔從高到低依次為青海、寧夏、新疆,氫穩(wěn)定同位素比值從高到低依次為新疆、寧夏、青海,這與生態(tài)規(guī)律相吻合；青海枸杞氧穩(wěn)定同位素比值偏高,這可能與枸杞中自身物質(zhì)合成影響了氧同位素比值有關(guān)[26]。同時(shí),3個(gè)地區(qū)采樣點(diǎn)緯度范圍相近,當(dāng)?shù)毓喔确绞?、降水量的差異也可能?duì)枸杞中氧同位素比值產(chǎn)生不同程度的影響。溯源進(jìn)程中應(yīng)考慮緯度效應(yīng)、海拔效應(yīng)和大陸效應(yīng)等多種效應(yīng)的綜合影響[27]。

大氣中的硫化物、水源中的硫化物(包括大氣降水和海洋水)、化石燃料等因素影響硫穩(wěn)定同位素豐度變化,其中水源和化石燃料均通過土壤影響植物的生長,青海、寧夏和新疆地區(qū)枸杞中S同位素并未表現(xiàn)出顯著差異,這可能與3個(gè)主產(chǎn)區(qū)均位于西北地區(qū),地質(zhì)結(jié)構(gòu)相似有關(guān)。本文建立以同位素為依據(jù)對(duì)枸杞主產(chǎn)地進(jìn)行判別,模型準(zhǔn)確率較高,后續(xù)試驗(yàn)將考慮繼續(xù)增加采樣量和采樣地點(diǎn),以建立最優(yōu)的枸杞產(chǎn)地溯源模型。

圖4 H、O穩(wěn)定同位素組成相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of stable isotope compositions of the δ2H and δ18O

本文采用穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀測定了青海、寧夏和新疆3個(gè)地區(qū)份共97份枸杞樣品中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S 5種穩(wěn)定同位素比值組成?；谙渚€圖、單因素方差分析及主成分分析等化學(xué)計(jì)量法分析各同位素比值差異,進(jìn)一步肯定各同位素在枸杞產(chǎn)地判別中的重要作用。結(jié)合LDA和SVM兩種算法建立枸杞判別模型,SVM判別模型初始驗(yàn)證和模型訓(xùn)練的準(zhǔn)確率分別為95.9%和96.9%,相對(duì)優(yōu)于LDA模型,可為實(shí)現(xiàn)枸杞產(chǎn)地判別提供依據(jù)。