王軍,鄭妙楷,李曉婷,胡文梅,王忠合

(韓山師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,廣東 潮州,521041)

草甘膦(glyphosate,Glyp)和草銨膦(glufosinate,Gluf)屬于廣譜、非選擇性、滅生性、氨基酸類除草劑[1],極性大易溶于水,不溶于有機(jī)溶劑。草甘膦主要抑制植物體內(nèi)的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶,從而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的轉(zhuǎn)化,使蛋白質(zhì)合成受到干擾,導(dǎo)致植物死亡。初期的研究認(rèn)為,草甘膦對(duì)動(dòng)物或人類不會(huì)產(chǎn)生危害,因在脊椎動(dòng)物中不存在莽草酸代謝路徑,然而近期研究表明該抑制路徑也同樣影響腸道中的微生物合成3種芳香族氨基酸,進(jìn)而影響腸道微生物的生態(tài)平衡[2-3]。草甘膦不僅影響蜜蜂中腸道微生物的生態(tài)平衡,降低對(duì)致病菌的抗性[4-5],而且亞慢性和慢性暴露實(shí)驗(yàn)[6]表明,草甘膦誘導(dǎo)小鼠的焦慮和抑郁等癥狀增加,小鼠腸道中棒狀桿菌、厚壁菌、擬桿菌、乳酸菌等的數(shù)量下降。草甘膦因其毒性、抗性及對(duì)環(huán)境的不良影響,近年來在歐盟受到了嚴(yán)格的監(jiān)管,全球其他國家和地區(qū)也提出禁止或限制使用的呼聲。

草甘膦和草銨膦類除草劑被廣泛施用于茶園,與茶葉中的有機(jī)物具有很強(qiáng)的結(jié)合能力,對(duì)其殘留量分析的難度較大,常用的檢測(cè)方法有免疫法、電化學(xué)法、毛細(xì)管電泳法、離子色譜法、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法、高效液相色譜-熒光法、氣相色譜-氮磷檢測(cè)法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[7-9]。其中離子色譜法、電泳法具有簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn),但檢測(cè)限量較難滿足國內(nèi)外要求；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較高的靈敏度和選擇性,為目前檢測(cè)草甘膦和草銨膦類除草劑殘留量的最主要方法,而我國尚無同時(shí)測(cè)定茶葉中草甘膦和草銨膦類除草劑殘留量的國家標(biāo)準(zhǔn)方法。

近年來,隨著高分辨率質(zhì)譜(high resolution mass spectrometry,HRMS)技術(shù)的發(fā)展,HRMS的使用對(duì)定性篩查和結(jié)構(gòu)確認(rèn)產(chǎn)生了革命性影響,且其選擇性、動(dòng)態(tài)范圍、線性、靈敏度等有了很大的提升,從而提高了HRMS在定量分析中的應(yīng)用,三重四級(jí)桿質(zhì)譜無法有效排除復(fù)雜基質(zhì)中的干擾物,而HRMS則可利用與之不同的數(shù)據(jù)采集達(dá)到出色的選擇性和靈敏度,從而有效減少假陽性或假陰性等情況的發(fā)生。HRMS中的飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)采用的準(zhǔn)多重反應(yīng)數(shù)據(jù)采集模式(time-of-flight pseudo-multiple reaction monitoring,TOF-MRM)具有目標(biāo)增益功能(target enhancement),四級(jí)桿選擇母離子,可選擇性地增加目標(biāo)碎片的占空比,提高了響應(yīng)和選擇性,從而大幅提升了該平臺(tái)的定量分析性能。

本實(shí)驗(yàn)選取草甘膦和草銨膦為研究對(duì)象,采用9-芴甲氧羰酰氯(9-fluorene methoxycarbonyl chloride,FMOC-Cl)柱前衍生法測(cè)定茶葉中的草甘膦和草銨膦,利用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法檢測(cè),分別探討衍生反應(yīng)條件、凈化條件、色譜分離條件、質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)等,以期建立一種高效、準(zhǔn)確測(cè)定茶葉中草甘膦和草銨膦除草劑殘留量的檢測(cè)方法,為科學(xué)監(jiān)控和制定標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Glyp、Gluf、FMOC-Cl等,美國Sigma-Aldrich公司；乙酸銨、硼酸鈉(Na2B3O7·10H2O)、氫氧化鈉、硼酸等均為優(yōu)級(jí)純,阿拉丁(上海)有限公司；質(zhì)譜級(jí)乙腈、甲酸和甲醇,美國Fisher公司；超純水(≥18 MΩ·cm),實(shí)驗(yàn)室自制。成茶樣品,當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters I-Class Plus超高壓液相色譜儀,由二元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、脫氣機(jī)等組成；WCX、MAX、MCX、HLB、C18柱,均為3 mL/60 mg；Xevo G2-XS QTOF高分辨質(zhì)譜儀,配電噴霧電離源(electrospray ionization,ESI),以上均為美國沃特世有限公司生產(chǎn)；JY3002電子天平,梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；DZF-6050型真空干燥箱,河南鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；ZX4漩渦振蕩器,意大利VELP公司；JSP-200型高速多功能粉碎機(jī),浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠；N-丙基乙二胺鍵合固相萃取填料(primary secondary amine,PSA)、ENVI-18固相萃取填料,美國Sigma-Aldrich公司；固相萃取空柱(3 mL),生工生物(上海)工程有限公司；GWA-UN1-10超純水器,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取、凈化及衍生

提?。悍謩e將茶葉樣品置于干燥粉碎機(jī)中,粉碎過40目篩,-20 ℃冷藏,備用。準(zhǔn)確稱取1.00 g(精確至1 mg)試樣于50 mL離心管中,加入超純水20 mL,充分振蕩2 min,超聲波提取30 min,浸提后以5 000 r/min離心5 min,取上清液,待凈化。

凈化：分別用3 mL甲醇、3 mL超純水活化固相萃取柱,取2 mL上清液過固相萃取柱,收集流出液于離心管中,待衍生。

衍生：取1.0 mL的凈化液,分別依次加入0.2 mL 5% pH 9.0或10.0的硼酸鈉緩沖液、0.2 mL 1.0 mg/mL的FMOC-Cl乙腈溶液,混勻后于室溫下衍生0.5、1、2、4、12 h,以4 500 r/min離心5 min,過0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜,超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀測(cè)定衍生產(chǎn)物,草甘膦和草銨膦的衍生產(chǎn)物分別以FMOC-Glyp、FMOC-Gluf表示。

1.3.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱(Waters Acquity UPLC BEH C18柱,2.1 mm×50 mm,1.7 μm),柱溫40 ℃,進(jìn)樣室溫度10 ℃,流速0.3 mL/min；流動(dòng)相A為2 mmol/L的乙酸銨水溶液(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸),流動(dòng)相B為純乙腈；梯度洗脫程序?yàn)?～1 min、10% B；1～5 min、95% B,5～8 min、95% B,8～8.1 min、10% B,8.1～11 min、10% B。

質(zhì)譜條件：正離子(ESI+)靈敏度模式,毛細(xì)管電壓3.0 kV,離子源溫度130 ℃,脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔氣流速60 L/h,脫溶劑氣流速800 L/h,掃描時(shí)間0.2 s,掃描范圍m/z50～800,數(shù)據(jù)格式為棒狀圖(centroid)；四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜的二級(jí)篩查模式(MS/MS)優(yōu)化采集方法：母離子質(zhì)量數(shù)分別固定設(shè)為392.09(FMOC-Glyp)和404.13(FMOC-Gluf),碰撞能值分別設(shè)6、10、15、20、25、30 V,前1 min和后6 min的流動(dòng)相進(jìn)廢液,質(zhì)譜只采集1～5 min的信號(hào)。TOF-MRM定量采集方法：FMOC-Glyp設(shè)固定m/z392.09,碎片離子214.011 9、179.085 8、170.022、88.039 5,優(yōu)化后的碰撞能值為15 V,定量離子179.085 8；FMOC-Gluf設(shè)固定m/z404.13,碎片離子179.085 8、182.058、136.052、208.038,優(yōu)化后的碰撞能值為20 V,定量離子179.085 8；前1 min和后6 min的流動(dòng)相進(jìn)廢液,質(zhì)譜只采集1～5 min的信號(hào)。采用質(zhì)量鎖定(LockSpray)技術(shù)測(cè)定準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù),以200 pg/μL的亮氨酸腦啡肽溶液為鎖定質(zhì)量溶液,流速為5 μL/min,電壓為0.53 kV,每隔30 s采集1次,在正離子模式下產(chǎn)生m/z556.277 1的離子。

1.3.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

分別準(zhǔn)確稱取10份樣品,加水按照1.3.1的方法超聲波提取,離心后取上清液2.0 mL過固相萃取柱凈化,收集流出液過0.22 μm微孔濾膜,作為樣品溶液。取凈化后的樣品溶液1.6 mL,加入0.4 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液至目標(biāo)物終質(zhì)量濃度分別為1.25～400 μg/L(FMOC-Glyp)和0.25～160 μg/L(FMOC-Gluf),衍生后注入超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀測(cè)定,分別作基質(zhì)匹配標(biāo)曲和溶劑外標(biāo)曲線。另取未經(jīng)凈化的樣品溶液1.6 mL,加入0.4 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,衍生后注入超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀測(cè)定,分別作基質(zhì)匹配和溶劑外標(biāo)曲線?；|(zhì)效應(yīng)以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑曲線斜率的比值評(píng)定,比值>1,表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；比值<1則為基質(zhì)抑制效應(yīng),用符號(hào)ME表示基質(zhì)效應(yīng),按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.4 方法準(zhǔn)確度與精確度評(píng)價(jià)

分別準(zhǔn)確稱取18份樣品于50 mL離心管中,加入2 mL草甘膦和草銨膦的混標(biāo)溶液,配制成低、中、高3個(gè)水平(分別為定量限的2、10、40倍)的加標(biāo)樣品,每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行試驗(yàn)。分別加入超純水18 mL,充分振蕩2 min,超聲提取30 min,浸提后以5 000 r/min離心5 min,取離心后的上清液,過固相萃取柱凈化后衍生,過0.22 μm微孔濾膜,采用超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀測(cè)定,計(jì)算回收率和精密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Waters公司的MassLynx 4.1軟件,通過提取MS/MS采集方法中各通道母離子及碎片離子的質(zhì)譜圖,調(diào)節(jié)碰撞能量以獲得各衍生產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好的離子碎片,并篩選出定量離子對(duì)。TOF-MRM定量采集圖選用ApexTrack的積分方法,適當(dāng)調(diào)整積分參數(shù)的方式完成色譜積分,根據(jù)質(zhì)譜圖中碎片離子峰的強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

分別配制以下2組流動(dòng)相,組I：流動(dòng)相A為2 mmol/L的乙酸銨水溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸),流動(dòng)相B為純乙腈；組Ⅱ：流動(dòng)相A為2 mmol/L甲酸銨水溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸),流動(dòng)相B為純乙腈。根據(jù)上述1.3.2的流動(dòng)相梯度洗脫條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,組I的出峰效果較好,而組II的出峰有較大的拖尾現(xiàn)象,效果較差。這可能是乙酸銨鹽的存在可以改善目標(biāo)物的峰形,讓目標(biāo)物的峰形變得較為對(duì)稱,且流動(dòng)相A中甲酸可以提供一定量的H+,為形成的目標(biāo)離子的質(zhì)子化狀態(tài)提供了H+的支撐,并維持了目標(biāo)離子的質(zhì)子化狀態(tài),提高了目標(biāo)物的離子化程度,從而提高了目標(biāo)物的檢出率[10],后續(xù)試驗(yàn)選擇第I組流動(dòng)相。

2.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

采用超純水配制質(zhì)量濃度為1 mg/L的草甘膦和草銨膦標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL,分別加入pH 9.0的5%硼酸鈉緩沖溶液0.2 mL、1.0 mg/mL的FMOC-Cl衍生劑溶液0.2 mL,室溫下衍生12 h,將各標(biāo)準(zhǔn)溶液注入進(jìn)樣器中,色譜分離后在正離子模式下進(jìn)行MS/MS掃描,得到草甘膦和草銨膦衍生物的母離子及碎片離子峰的掃描圖,如圖1所示。毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和碰撞能量是影響質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果的重要因素,錐孔電壓直接影響各組分的靈敏度[11],過高的錐孔電壓會(huì)導(dǎo)致分子離子在離子源內(nèi)發(fā)生碰撞解離,從而影響母離子的豐度,進(jìn)而影響檢測(cè)限和靈敏度。錐孔電壓40 V且不加碰撞能量下采集的質(zhì)譜圖中母離子(m/z392.090 5和m/z404.126 8)信號(hào)強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好,施加不同碰撞能量后采集的二級(jí)質(zhì)譜圖中草甘膦衍生產(chǎn)物顯示348.097 3、214.011 9、179.085 8、170.022 0、88.039 5等5種碎片離子,草銨膦衍生產(chǎn)物的碎片離子主要有360.136 7、208.037 5、182.058 2、179.085 7、136.052 3、119.026 3等6種碎片離子。各碎片離子形成過程及理論質(zhì)荷比(見增強(qiáng)出版附件圖)。

由圖1可以看出,草甘膦和草銨膦衍生物分別施加15和20 V碰撞能量下碎片離子m/z179.085 8的響應(yīng)最高、穩(wěn)定性好,分別選擇m/z179.085 8的碎片離子與母離子392.090 5和404.126 8作為草甘膦和草銨膦衍生物測(cè)定的定量離子對(duì)。為了實(shí)現(xiàn)草甘膦和草銨膦的定量分析,使用TOF-MRM采集模式和Target Enhancement采集數(shù)據(jù),該模式下四級(jí)桿中選擇母離子,儀器的Target Enhancement功能可增加目標(biāo)離子的靈敏度,從而大大增強(qiáng)了定量分析的靈敏度和選擇性。

2.3 衍生條件的優(yōu)化

1.0 mL質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的草甘膦和草銨膦混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與pH 10.0的5%硼酸鈉緩沖溶液0.2 mL、1.0 mg/mL的FMOC-Cl衍生劑溶液0.2 mL,室溫下衍生0.5、1.0、2.0、4.0、12.0 h,MS/MS采集模式和TOF-MRM采集模式的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。隨著衍生時(shí)間的增加,草甘膦和草銨膦與FMOC-Cl衍生產(chǎn)物的信號(hào)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),且方差分析結(jié)果顯示差異顯著(P<0.05)。草甘膦和草銨膦與FMOC-Cl衍生反應(yīng)2 h時(shí)產(chǎn)物信號(hào)最強(qiáng),過長時(shí)間的衍生反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性下降。

a-FMOC-Glyp;b-FMOC-Gluf圖1 草甘膦和草銨膦衍生產(chǎn)物的碰撞能優(yōu)化Fig.1 Optimization of collision for glyphosate and glyphosate derivatives

1.0 mL質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的草甘膦和草銨膦混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與pH 9.0和pH 10.0的5%硼酸鈉緩沖溶液0.2 mL、1.0 mg/mL的FMOC-Cl衍生劑溶液0.2 mL,室溫下衍生2 h,MS/MS模式和TOF-MRM測(cè)定結(jié)果如表1所示。草甘膦和草銨膦與FMOC-Cl在較高pH條件下反應(yīng)形成的衍生產(chǎn)物信號(hào)較強(qiáng),t檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異顯著(P<0.05),且TOF-MRM比MS/MS采集模式下目標(biāo)產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度更大(P<0.05),后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用TOF-MRM采集模式和硼酸鹽緩沖液pH 10.0的衍生條件。

2.4 凈化方法的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12-13],采用純水能較好地提取樣品中的草甘膦和草銨膦等目標(biāo)物,本文不再對(duì)提取溶劑做過多的優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)過程均采用純水作為提取溶劑,超聲強(qiáng)化提取,本文重點(diǎn)考察固相萃取柱和分散固相萃取法對(duì)草甘膦和草銨膦凈化效果的影響。按照1.3.1的方法提取茶葉樣品,分別取1.6 mL茶葉提取液加入1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液0.4 mL,渦旋混勻后,過PSA、HLB、ENVI-18、C18柱,收集流出液1 mL衍生后測(cè)定。分別吸取渦旋混勻后的加標(biāo)提取液2 mL,過MAX、MCX、WCX等固相萃取柱,流出液棄去不要,用1.0 mL水∶甲醇=4∶1(含體積分?jǐn)?shù)1%甲酸)洗脫2次,收集洗脫液,取1.0 mL衍生后測(cè)定,各固相萃取柱的凈化效果如表2和圖3所示。

a-MS/MS;b-TOF-MRM圖2 衍生時(shí)間對(duì)草甘膦和草銨膦與FMOC-Cl 衍生產(chǎn)物形成的影響Fig.2 Effect of derivation time on formation of glyphosate and glyphosate derivatives with FMOC-Cl 注：圖中同一目標(biāo)物標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05

表1 緩沖液pH對(duì)草甘膦和草銨膦與FMOC-Cl衍生產(chǎn)物 形成的影響Table 1 Effect of buffer pH on the formation of glyphosate and glyphosate derivatives with FMOC-Cl

表2 固相萃取柱對(duì)草甘膦和草銨膦的凈化效果Table 2 Purification effect of solid phase extraction column on glyphosate and glufosinate

茶葉含有較多的咖啡堿、氨基酸、色素等物質(zhì)對(duì)質(zhì)譜具有較強(qiáng)的抑制效應(yīng),需要經(jīng)過凈化處理,排除掉或降低這些物質(zhì)的干擾,固相萃取凈化方式操作快速、簡(jiǎn)便,常用于色譜-質(zhì)譜分析檢測(cè)中凈化目標(biāo)物[14]。從表2和圖3可以看出,不同固相萃取柱凈化對(duì)目標(biāo)物的回收率差異顯著(P<0.05),C18反相吸附型填料的凈化效果較差、回收率低；而ENVI-18為含更高碳量的修飾型C18柱,同為反相吸附型填料,對(duì)目標(biāo)物凈化效果和回收率較好,可吸附茶湯中部分色素等雜質(zhì)以降低其對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的影響。PSA為正相弱陰離子交換劑,其強(qiáng)親和性和高容量可用于去除脂肪酸、有機(jī)酸和一些極性色素及糖類,常用于降低分析過程中出現(xiàn)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)的影響,其對(duì)茶葉提取液的凈化效果較差、回收率也較低。同樣,MAX為反相混合模式強(qiáng)陰離子交換吸附劑,適用于酸性化合物，具有高度選擇性與高靈敏度,該柱對(duì)茶葉提取液的凈化效果較好,但回收率低。HLB為反相親水性的改性苯乙烯聚合物,可保留極性化合物,可以去除茶葉中的咖啡堿、茶多酚、氨基酸、色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)[15],對(duì)草甘膦和草銨膦的吸附作用小,樣品的基質(zhì)效應(yīng)和基質(zhì)干擾小,凈化效果好,其保留率也能滿足要求。MCX為反相混合模式強(qiáng)陽離子交換吸附劑,適用于堿性化合物,具有高度選擇性與高靈敏度,其對(duì)目標(biāo)物的凈化效果較好,可有效去除茶湯中其他物質(zhì)的干擾,提高質(zhì)譜檢測(cè)的能力[16],回收率最佳,但是需要多一步洗脫過程。WCX為反相混合模式弱陽離子交換吸附劑,適用于強(qiáng)堿性化合物，具有高度選擇性與高靈敏度,該柱對(duì)目標(biāo)物的凈化效果較好,對(duì)茶湯中色素等雜質(zhì)的吸附能力較強(qiáng),但其回收率遠(yuǎn)低于MCX固相萃取柱。因此,采用衍生法測(cè)定茶葉中草甘膦和草銨膦類除草劑的凈化可根據(jù)需求選用MCX、HLB、ENVI-18固相萃取柱,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用MCX固相萃取柱凈化茶葉提取液。

2.5 方法學(xué)考察及基質(zhì)效應(yīng)評(píng)定

針對(duì)茶葉樣品中的草甘膦和草銨膦,未經(jīng)固相萃取柱凈化的基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)明顯,雜質(zhì)干擾大；經(jīng)固相萃取柱凈化后,基質(zhì)效應(yīng)分別為88.6和93.2。由此可見,MCX固相萃取柱凈化處理后能有效降低超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法檢測(cè)Glyp和Gluf過程中的基質(zhì)抑制效應(yīng)。一般情況下,基質(zhì)效應(yīng)為85%～115%表示不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。據(jù)此判斷,本檢測(cè)方法對(duì)Glyp和Gluf基質(zhì)效應(yīng)不顯著(表3)。因此,采用外標(biāo)法和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線法能準(zhǔn)確定量檢測(cè)茶葉樣品中Glyp和Gluf的殘留量,線性范圍分別為1.25～400和0.25～160 μg/L,且線性相關(guān)系數(shù)均>0.99。檢測(cè)限(limit of detection,LOD)是通過在空白樣品中添加低濃度水平目標(biāo)組分的方法確定,依據(jù)其特征離子色譜峰的信噪比(S/N)>3而測(cè)定的,Glyp和Gluf的LOD分別為1.2、0.4 μg/kg。定量限(limit of quantitation,LOQ)是以信噪比(S/N)為10計(jì)算的,Glyp和Gluf的LOQ分別為4.0、1.34 μg/kg,Glyp的LOQ低于國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23750—2009《植物性產(chǎn)品中草甘膦殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》的值(其LOQ為5 μg/kg)。

a-FMOC-Glyp總離子流圖;b-FMOC-Glyp二級(jí)質(zhì)譜圖;c-FMOC-Gluf總離子流圖;d-FMOC-Gluf二級(jí)質(zhì)譜圖圖3 茶葉樣品過固相萃取柱凈化后的色譜-質(zhì)譜圖Fig.3 Chromatography-mass spectrometry of tea samples purified by different solid phase extraction columns

表3 Glyp和Gluf測(cè)定的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Linear range,regression equation,correlation coefficient and matrix effect of Glyp and Gluf determination

2.6 方法的回收率、準(zhǔn)確度和精密度

移取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入到茶樣品中,配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平(2、10、40倍LOQ)的添加試驗(yàn),按照1.3.1的方法處理,過柱凈化、衍生后采用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè),每個(gè)加標(biāo)水平測(cè)定6次,回收率和精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果如表4所示。由表4可知,Glyp和Gluf目標(biāo)物在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下均有較好的準(zhǔn)確度和精密度,Glyp的加標(biāo)回收率為88%～103%,Gluf的加標(biāo)回收率為93%～99%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均<5%,可用于茶葉樣品中Glyp和Gluf殘留量的測(cè)定。

表4 茶葉樣品中Glyp和Gluf添加回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Recoveries and relative standard deviations of Glyp and Gluf spiked in tea samples

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用衍生高分辨質(zhì)譜方法對(duì)市售的10種茶葉樣品進(jìn)行篩查與檢測(cè),根據(jù)Glyp和Gluf 2種除草劑標(biāo)準(zhǔn)化合物的碎片離子信息確定其在茶葉樣品中的存在情況,并根據(jù)二級(jí)定量碎片離子的峰強(qiáng)度進(jìn)行定量,結(jié)果如表5所示。7種茶葉樣品中檢測(cè)出含有草甘膦(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.16～0.96 mg/kg),與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的測(cè)定值0.085～0.65 mg/kg相當(dāng),1種樣品檢出含有草銨膦,含量低于文獻(xiàn)[17]報(bào)道的測(cè)定值0.12～0.45 mg/kg,其他樣品均未檢出草甘膦和草銨膦的殘留。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)茶葉中草甘膦的限量值為1.0 mg/kg,未包含其代謝物氨甲基膦酸,草銨膦的臨時(shí)限量值為0.5 mg/kg,未包含其代謝物N-乙?；蒌@膦和3-(甲基膦基)丙酸,實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的茶樣中草甘膦和草銨膦的殘留量均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

表5 茶葉樣品中Glyp和Gluf含量測(cè)定 單位：mg/kg

3 結(jié)論

用超純水作為溶劑超聲輔助法提取茶葉樣中的草甘膦和草銨膦殘留除草劑,再經(jīng)過MCX固相萃取柱凈化除去樣品中的色素等物質(zhì)后,在pH 10.0、濃度為0.1 mol/L的硼酸鈉緩沖溶液中與FMOC-Cl溶液進(jìn)行衍生反應(yīng)2 h,以2 mmol/L的乙酸銨水溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸)和乙腈為流動(dòng)相,HRMS檢測(cè)采用電噴霧正離子化模式和準(zhǔn)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下檢測(cè)草甘膦和草銨膦目標(biāo)物,掃描范圍m/z50～800,毛細(xì)管電壓3.0 kV,錐孔電壓40 V,提取錐孔電壓6 V,離子源溫度130 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔氣流速60 L/h,脫溶劑氣流速800 L/h,掃描時(shí)間0.2 s,數(shù)據(jù)格式為棒狀圖(centroid),草甘膦和草銨膦的碰撞能值分別為15和20 V,定量離子為m/z179.085 8。該方法結(jié)合了色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及能夠提供精確質(zhì)量數(shù)和碎片離子等信息的優(yōu)點(diǎn),操作過程簡(jiǎn)單,檢測(cè)速度快,可以作為茶葉中草甘膦和草銨膦殘留量的檢測(cè)方法。