彭琳媛,林洪,王靜雪

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266000)

活的非可培養(yǎng)(viable but non-culturable,VBNC)狀態(tài)是非芽孢菌為了應(yīng)對包括極端溫度、營養(yǎng)缺乏、高滲透壓等因素在內(nèi)的自然環(huán)境脅迫而自發(fā)形成的一種生存機(jī)制[1]。研究表明,VBNC現(xiàn)象普遍存在于微生物領(lǐng)域,至今已經(jīng)有100多種微生物被證實(shí)可以進(jìn)入VBNC狀態(tài)[2]。當(dāng)致病微生物進(jìn)入VBNC狀態(tài)時,它們會逐漸失去其可培養(yǎng)性,但仍保留細(xì)胞的某些代謝活性[3],在適宜的條件下能夠恢復(fù)正常生長與致病性[4]。

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種主要存在于海洋環(huán)境中的革蘭氏陰性菌,最早在1950年日本泉州集體食物中毒事件中分離得到[5]。作為貝類中危害最嚴(yán)重的致病微生物之一,它導(dǎo)致的水產(chǎn)品食品安全問題嚴(yán)重危害人類健康。當(dāng)處于低溫寡營養(yǎng)環(huán)境中[6],或遇到加熱、冷藏、高滲、發(fā)酵、殺菌等常見的食品加工處理方法[7-10],副溶血弧菌都會應(yīng)激轉(zhuǎn)化為VBNC狀態(tài)導(dǎo)致漏檢,造成食品中極大的安全隱患[11]。常見的微生物檢測技術(shù)中,平板計數(shù)法會因?yàn)閂BNC狀態(tài)微生物不能培養(yǎng)而造成假陰性檢測結(jié)果；而常規(guī)PCR檢測技術(shù)也因?yàn)椴荒軌騾^(qū)分細(xì)菌的生命狀態(tài),造成假陽性結(jié)果。因此VBNC細(xì)菌檢測技術(shù)的研究與優(yōu)化對副溶血弧菌的防控有著重要意義。

對于細(xì)菌狀態(tài)的精準(zhǔn)區(qū)分與檢測始終是VBNC領(lǐng)域的主要研究方向之一,人們將基于不同原理的方法結(jié)合起來,實(shí)現(xiàn)了更加快速有效的檢測效果。目前普遍利用活菌計數(shù)方法與可培養(yǎng)菌計數(shù)方法相結(jié)合,當(dāng)活菌數(shù)顯著高于可培養(yǎng)菌數(shù)時,二者結(jié)果相減即為VBNC菌的數(shù)量。一般利用平板涂布計數(shù)法就能得到可培養(yǎng)菌數(shù)的準(zhǔn)確結(jié)果,因此VBNC細(xì)菌檢測的難點(diǎn)主要聚焦于活菌計數(shù)方法。近年來不斷有報道證明,疊氮溴化丙錠聯(lián)合實(shí)時熒光定量PCR法(propidium monoazide quantitative PCR,PMA-qPCR)在檢測活菌方面具有廣闊的應(yīng)用前景[12-13]。TSENG等[14]利用PMA-qPCR方法檢測醫(yī)院空氣環(huán)境中的耐藥性和敏感性鮑曼不動桿菌。GOLPAYEGANI等[15]的報道表明對游泳池中可能存在的銅綠假單胞菌的檢測過程中,與常規(guī)PCR、qPCR、平板法等相比,PMA-qPCR檢測效率更高且更準(zhǔn)確。疊氮溴化丙錠(propidium monoazide,PMA)能夠穿過破損的細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入死細(xì)胞內(nèi)部與DNA形成共價氮碳鍵[16],細(xì)胞外殘留的游離PMA光解后被除去。隨后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增時,死細(xì)胞的DNA擴(kuò)增得到有效抑制[17-18]。但PMA對各種細(xì)菌的功效或毒性并不一樣[19-20],因此關(guān)于PMA處理細(xì)菌的方法條件,需要根據(jù)菌種的不同進(jìn)行探究與優(yōu)化,才能保證其檢測的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

本研究以副溶血弧菌為研究對象,在已有研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化副溶血弧菌活菌檢測的PMA-qPCR方法,提高其準(zhǔn)確性與靈敏度,以建立與平板計數(shù)法相結(jié)合的VBNC狀態(tài)副溶血弧菌定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與儀器

1.1.1 菌種

副溶血弧菌ATCC 17802(Vp17802)、VIB461、VIB304,溶藻膠弧菌VIB283,地中?；【鶹IB296,擬態(tài)弧菌VIB298,雙氮養(yǎng)弧菌VIB290,塔氏弧菌VIB309,哈維氏弧菌VIB410,均為中國海洋大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

PMA,美國Biotium公司；SYBR Green Realtime qPCR Master Mix,ToYoBo東洋紡(上海)生物科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、NaCl,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司；Tris、Triton X-100,北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器

1-14K低溫高速離心機(jī),德國Sigma公司；Synergy LX全波長酶標(biāo)儀,美國BioTek公司；ZWY-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海智城分析儀器制造有限公司；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器,日本松下健康醫(yī)療器械株式會社；StepOnePlus Real-Time PCR儀,美國Applied Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液的制備

取-80 ℃下體積分?jǐn)?shù)30%甘油保存的Vp17802菌種活化增殖,37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期,離心得到菌體沉淀用等體積生理鹽水洗滌并復(fù)溶。測定菌懸液OD600 nm,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已測定的OD值與菌液濃度的線性關(guān)系,將濃度調(diào)整至約5.0×107CFU/mL。菌懸液分為2組,一組作為對照組,另一組沸水浴3 min,獲得熱滅活的死菌懸液為實(shí)驗(yàn)組。

平板計數(shù)法：將制備好的菌懸液在含30 g/L NaCl的LB固體平板上涂布計數(shù),確定活菌懸液的準(zhǔn)確濃度以及死菌懸液是否完全滅活。

1.2.2 細(xì)菌基因組的提取

配制DNA提取液：按照20 mmol/L Tris、2 mmol/L EDTA和體積分?jǐn)?shù)0.6% Triton X-100的配比,分別取1.211 4 g Tris、0.336 2 g EDTA-2Na和3 mL Triton X-100,溶于400 mL超純水,調(diào)節(jié)pH=8.0后再用超純水定容至500 mL,滅菌后待用。

取500 μL已測定濃度的菌懸液于1.5 mL離心管中,10 000 r/min、4 ℃低溫離心10 min,棄去上清液后,菌體沉淀用ddH2O洗滌1次,再加入等體積DNA提取液輕輕混勻,100 ℃金屬浴加熱10 min,取出立即冰上低溫放置10 min,再4 ℃離心10 min[21],此時溶液中為提取出的DNA,吸取上清液可直接用于qPCR擴(kuò)增。

1.2.3 引物的合成與驗(yàn)證

參考BEJ等[22]的報道,根據(jù)GenBank中已發(fā)表的副溶血弧菌特異性tlh基因序列(基因序列號M36437.1)設(shè)計引物,委托北京華大基因有限公司合成,引物序列為：上游引物5′-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3′,下游引物5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′,擴(kuò)增得到的片段大小約為450 bp。分別提取Vp17802、VIB416、VIB304這3株副溶血弧菌和其余6株弧菌的DNA作為模板進(jìn)行qPCR,驗(yàn)證上述引物的特異性。

1.2.4 qPCR檢測體系的建立

qPCR反應(yīng)體系共20 μL：DNA模板2 μL,SYBR Green Realtime qPCR Master Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL(終濃度0.2 μmol/L),ddH2O 7.2 μL。

優(yōu)化后的qPCR反應(yīng)程序設(shè)置：95 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸45 s,設(shè)置40個循環(huán),同時收集熒光信號。熔解曲線分析：65～95 ℃,每5 s升高0.5 ℃。

1.2.5 PMA的作用條件優(yōu)化

1.2.5.1 PMA工作液的配制

1 mg PMA完全溶解于200 μL ddH2O,配制成質(zhì)量濃度為5 g/L的PMA儲存液,-20 ℃避光保存。使用前用ddH2O稀釋1/20作為工作液。

1.2.5.2 最小PMA作用濃度

取制備好的菌懸液500 μL,分別加入一定體積的PMA工作液使最終質(zhì)量濃度為0～21 mg/L,混勻后于黑暗處靜置孵育10 min,然后平鋪于冰上,與650 W鹵素?zé)舯３?5 cm間距進(jìn)行10 min強(qiáng)光照射,再根據(jù)上述細(xì)菌基因組提取方法提取DNA進(jìn)行qPCR?；罹c死菌做相同處理作為對照,每組設(shè)置3個平行。

1.2.5.3 最佳孵育時間

取制備好的菌懸液500 μL,加入PMA混勻后于黑暗處分別靜置孵育0～15 min,然后平鋪于冰上,后續(xù)步驟與1.2.5.2相同。活菌與死菌做相同處理作為對照,每組設(shè)置3個平行。

1.2.5.4 最佳光照時間

取制備好的菌懸液500 μL,加入PMA混勻后于黑暗處靜置孵育10 min,然后平鋪于冰上,與650 W鹵素?zé)舯３?5 cm間距,分別進(jìn)行0～20 min的強(qiáng)光照射,根據(jù)上述細(xì)菌基因組提取方法提取DNA進(jìn)行qPCR?；罹c死菌做相同處理作為對照,每組設(shè)置3個平行。

1.2.6 PMA-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Vp17802菌液離心得到菌體沉淀,用等體積的生理鹽水復(fù)溶,調(diào)整菌懸液OD600 nm,使菌液濃度保持在109CFU/mL,取樣于含3%NaCl的LB平板涂布計數(shù)。用生理鹽水將菌懸液依次稀釋,得到101、102、103、104、105、106、107、108、109CFU/mL共9個濃度梯度,取9組菌液各500 μL,按1.2.5優(yōu)化后的PMA處理?xiàng)l件進(jìn)行處理,提取DNA模板進(jìn)行qPCR定量檢測,設(shè)置3組平行。分析平板涂布和qPCR檢測結(jié)果的相關(guān)性,以擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(cycle threshold,Ct)和活菌濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 PMA-qPCR方法檢測混合活死副溶血弧菌

培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Vp17802菌液離心得到菌體沉淀,用等體積的0.85%生理鹽水復(fù)溶,調(diào)整菌懸液OD600 nm,使菌液濃度保持在109CFU/mL。菌懸液分為2組,一組進(jìn)行10倍稀釋,作為活菌懸液；另一組稀釋100倍后沸水浴3 min,獲得熱滅活的死菌懸液。分別將生理鹽水、101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL活菌與106CFU/mL死菌等體積混合,得到500 μL混合活死菌液,參照1.2.2提取DNA模板溶液,進(jìn)行qPCR定量檢測。同時對菌液進(jìn)行平板涂布計數(shù),與PMA-qPCR測定結(jié)果進(jìn)行對比分析,將死菌懸液作為陰性對照,設(shè)置3組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌懸液測定濃度

涂布平板靜置于37 ℃恒溫過夜,選取平板上單菌落數(shù)在30～300內(nèi)的為有效計數(shù)。經(jīng)計算,活菌懸液濃度為4.70×107CFU/mL；死菌懸液平板上均無菌落長出,表明沸水浴3 min使細(xì)菌完全熱滅活,可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 qPCR引物特異性驗(yàn)證

將實(shí)驗(yàn)室保存的多種弧菌平板活化后,液體增殖至對數(shù)生長期,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期測定的OD600 nm與菌液濃度的線性關(guān)系,將濃度均調(diào)整至108數(shù)量級。提取不同弧菌DNA作為模板進(jìn)行qPCR,對設(shè)計合成的tlh基因引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。通過qPCR擴(kuò)增曲線(圖1-a)和熔解曲線(圖1-b)可以看出,實(shí)驗(yàn)所用3株副溶血弧菌均在第15個循環(huán)前后開始檢測到熒光信號并在88 ℃左右出現(xiàn)單一熔解峰；而其余弧菌在20個循環(huán)之后檢測到一部分熒光信號,觀察熔解曲線發(fā)現(xiàn)均為引物二聚體導(dǎo)致。因此該qPCR引物對副溶血弧菌具有高特異性。

a-擴(kuò)增曲線；b-熔解曲線圖1 不同弧菌的qPCR擴(kuò)增曲線與熔解曲線Fig.1 qPCR amplification plot and melt curve of different Vibrios strains

2.3 PMA處理?xiàng)l件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 PMA最佳添加濃度

添加PMA作預(yù)處理時,由圖2可知,PMA在質(zhì)量濃度0～21 mg/L范圍內(nèi),隨著PMA添加量逐漸增加,活菌對照組qPCR擴(kuò)增的Ct值始終在17左右,無顯著性變化,表明ρ(PMA)<21 mg/L時不會影響活菌DNA的擴(kuò)增。而死菌組qPCR擴(kuò)增的Ct值逐漸升高,當(dāng)ρ(PMA)增加至15 mg/L時,與活菌組Ct值結(jié)果差異達(dá)到最大,表明此時可以達(dá)到最大程度上抑制死菌DNA的擴(kuò)增。當(dāng)ρ(PMA)為18和21 mg/L時,活菌組與死菌組得到的Ct值結(jié)果差值與15 mg/L時無顯著差異。因此,選擇15 mg/L作為PMA添加的最佳質(zhì)量濃度。

圖2 PMA質(zhì)量濃度對qPCR擴(kuò)增結(jié)果的影響Fig.2 Effects of PMA concentrations on the amplification results of qPCR

2.3.2 最佳黑暗孵育時間

添加終濃質(zhì)量度為15 mg/L的PMA后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明,在孵育0～15 min時間范圍內(nèi),活菌對照組qPCR擴(kuò)增的Ct值始終無顯著性變化,而死菌組DNA的擴(kuò)增始受到抑制,抑制效果隨暗孵育時間而變化。當(dāng)黑暗環(huán)境孵育時間為10 min時,活菌組與死菌組得到的Ct值結(jié)果差異達(dá)到最大,DNA擴(kuò)增抑制效果最好。孵育時間多于或少于10 min的抑制效果都相對較弱,說明死菌DNA未被完全抑制擴(kuò)增。

圖3 孵育時間對qPCR擴(kuò)增結(jié)果的影響Fig.3 Effects of incubation time on the amplification results of qPCR

2.3.3 最佳強(qiáng)光照射時間

根據(jù)2.3.2得到的最佳暗處理時間,添加15 mg/L的PMA后置于黑暗環(huán)境孵育10 min,再平鋪于冰上,距離光源15 cm進(jìn)行照射。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)表明,光照時間在0～20 min范圍內(nèi),活菌對照組qPCR擴(kuò)增的Ct值始終無顯著性變化,而死菌組DNA的擴(kuò)增始終受到抑制,抑制效果隨光照時間而變化,表現(xiàn)出先增強(qiáng)再減弱的趨勢。當(dāng)強(qiáng)光照射時間為15 min時,活菌組與死菌組得到的Ct值結(jié)果差異達(dá)到最大,DNA擴(kuò)增抑制效果最好,光照時間多于或少于15 min,Ct值結(jié)果差異性均較小,抑制效果相對較弱說明死菌DNA未被完全抑制。

圖4 光照時間對qPCR擴(kuò)增結(jié)果的影響Fig.4 Effects of lighting time on the amplification results of qPCR

2.4 PMA-qPCR法測定活菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

平板計數(shù)方式與2.1相同,最高活菌濃度為2.90×109CFU/mL。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)獲得的PMA-qPCR最佳處理?xiàng)l件,對9組不同濃度菌液進(jìn)行PMA-qPCR定量檢測,最終檢測到qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號時所對應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)即是所得到的Ct值。利用IBM SPSS軟件對Ct值和平板計數(shù)法測得活菌數(shù)進(jìn)行分析統(tǒng)計,結(jié)果如表1所示。在2.90×10～2.90×108CFU/mL,活菌濃度與Ct值的相關(guān)系數(shù)為0.991,二者高度相關(guān)；顯著性水平P=0.000<0.01,差異極顯著。而當(dāng)活菌濃度為2.90×109CFU/mL時,其對應(yīng)Ct值偏差較大,相關(guān)性較差,因此排除該組數(shù)據(jù),不參與標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建。

表1 實(shí)際活菌濃度與qPCR擴(kuò)增Ct值的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between actual viable bacteria concentration and Ct values of qPCR amplification

因此得到了在2.90×10～2.90×108CFU/mL濃度范圍內(nèi)PMA-qPCR定量檢測活菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其關(guān)系式為y=-3.193 4x+41.249,R2=0.992 4,經(jīng)驗(yàn)證靈敏度與重復(fù)性較好,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,Ct>36則認(rèn)為是無效計數(shù)。

2.5 PMA-qPCR方法檢測混合活死副溶血弧菌

根據(jù)平板計數(shù),稀釋后活菌懸液最高濃度為7.00×108CFU/mL,以此作為理論活菌濃度。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)獲得的PMA-qPCR最佳處理?xiàng)l件,對9組不同濃度混合活死菌液進(jìn)行PMA-qPCR定量檢測,再利用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到實(shí)際測定的活菌濃度,利用Excel軟件進(jìn)行分析,結(jié)果見表2。通過對比理論與實(shí)測活菌濃度,得到各濃度組回收率在92.97%～99.57%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.95%。以上結(jié)果表明在不同比例死菌、活菌的混合體系中,利用PMA抑制死菌DNA擴(kuò)增,結(jié)合qPCR反應(yīng)體系的高特異性,保證了上述PMA-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線不會受到其他狀態(tài)細(xì)菌的干擾,能夠于混合體系中準(zhǔn)確測定副溶血弧菌活菌數(shù)量,且方法重復(fù)性較好,基于培養(yǎng)物水平適用于VBNC副溶血弧菌的進(jìn)一步探究。

表2 PMA-qPCR測定活菌數(shù)與理論值的對比分析Table 2 Comparative analysis between viable bacteria count determined of PMA-qPCR and theoretical count

3 結(jié)論

PMA-qPCR具有高度特異性,不僅可以避免平板檢測的漏檢問題,也能有效排除普通PCR等核酸技術(shù)中受到死細(xì)菌信號的局限性,已成為近幾年來區(qū)分細(xì)菌狀態(tài)、定量活菌數(shù)量的重要技術(shù)之一[23-24],但PMA-qPCR對于副溶血弧菌活菌計數(shù)方面的應(yīng)用報道較少[25]。利用改良基因組提取方法和副溶血弧菌特異性qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系,對PMA處理副溶血弧菌細(xì)胞的最佳條件進(jìn)行探究,當(dāng)添加質(zhì)量濃度為15～21 mg/L時,能夠基本抑制死菌的DNA擴(kuò)增,且對活菌無影響。本研究實(shí)現(xiàn)了定量檢測副溶血弧菌活菌的PMA-qPCR方法優(yōu)化,檢測限降低至101數(shù)量級且Ct值保持在更加合理有效的范圍內(nèi)。PMA-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率較高,在2.90×101～2.90×108CFU/mL濃度范圍內(nèi)成立且合理,結(jié)合平板計數(shù)法建立了更加精準(zhǔn)的VBNC副溶血弧菌定量檢測方法。通過驗(yàn)證,不同狀態(tài)菌體的存在不會干擾檢測,但食品基質(zhì)是否會干擾檢測的靈敏度仍需進(jìn)一步探究。目前該方法已成功應(yīng)用于本課題組基于純培養(yǎng)物對VBNC狀態(tài)副溶血弧菌的機(jī)制研究,提供了可靠的技術(shù)手段。未來將通過人工模擬食品體系中存在VBNC副溶血弧菌,對該方法進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用探究。