賀曉潔,趙良忠*,李明,3,周曉潔,車麗娜,劉婷, 江振桂,劉汁琪,林碧蓮,龔周亮

1(邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院,湖南 邵陽(yáng),422000)2(豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 邵陽(yáng),422000) 3(廣州佳明食品科技有限公司,廣東 廣州,510000) 4(湖南肯基因科技有限公司,湖南 長(zhǎng)沙,410000)

貴州紅酸湯是以鮮辣椒、鮮西紅柿為主要原料,通過發(fā)酵法生產(chǎn)的半固態(tài)傳統(tǒng)發(fā)酵食品,具有色澤紅亮,香味濃郁,酸味醇厚的特點(diǎn)[1]。根據(jù)原料種類不同,貴州紅酸湯分為辣椒紅酸湯[2]、西紅柿紅酸湯[3]、辣椒與西紅柿混合紅酸湯[4]。辣椒作為紅酸湯主要原料,季節(jié)性明顯,為延長(zhǎng)辣椒保質(zhì)期并降低生產(chǎn)成本,工廠通常會(huì)對(duì)新鮮紅辣椒進(jìn)行高鹽鹽漬保藏,發(fā)酵時(shí)再將辣椒進(jìn)行脫鹽處理,脫鹽時(shí)辣椒營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味等物質(zhì)流失嚴(yán)重并帶來水污染問題[5]。篩選耐鹽乳酸菌,在高鹽條件下直接生產(chǎn)紅酸湯有利于簡(jiǎn)化生產(chǎn)工序、有效減少環(huán)境污染,保持產(chǎn)品色澤和營(yíng)養(yǎng)。

乳酸菌屬是紅酸湯發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌屬,約占微生物菌群78.05%～90.26%,也是酸湯風(fēng)味形成的核心微生物菌屬[6]。研究表明,食鹽可促進(jìn)酸湯風(fēng)味形成,延長(zhǎng)保質(zhì)期,但食鹽濃度過高會(huì)抑制乳酸菌生長(zhǎng)代謝,導(dǎo)致酸湯有機(jī)酸含量低、風(fēng)味不足[7]。因此,篩選耐高鹽脅迫且產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株更適于酸湯工業(yè)化生產(chǎn)。誘變育種可改良菌株遺傳特性,紫外誘變具有經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定性好的特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)誘變育種[8]。

乳酸菌具有良好的益生功能,如降膽固醇[9]、增強(qiáng)免疫力[10]、抗氧化[11]等,但需其耐受人體消化才能充分發(fā)揮益生功能。本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒中篩選一株耐鹽乳酸菌,并通過二輪紫外誘變進(jìn)一步提高乳酸菌耐鹽產(chǎn)酸能力,同時(shí)比較原始菌株和突變菌株的耐受性,包括耐酸、耐膽鹽、耐人工模擬胃腸液、耐鹽能力,以期為高鹽紅酸湯生產(chǎn)提供發(fā)酵菌株,從而簡(jiǎn)化辣椒脫鹽工序,提高生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本,緩解工業(yè)化生產(chǎn)過程中紅酸湯主要原料辣椒脫鹽處理時(shí)所帶來的營(yíng)養(yǎng)成分流失和水污染問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒制品,湖南邵陽(yáng)農(nóng)家,要求總酸>10 g/kg,NaCl添加量(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))>6%。

MRS肉湯,杭州百思生物技術(shù)有限公司；乳酸菌成套生化鑒定管,青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；人工模擬胃液、人工模擬腸液,廣州臻萃質(zhì)檢技術(shù)服務(wù)公司；其他試劑無(wú)特別說明來自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EL340多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio-Tek公司；SW-CJ-2FD(標(biāo)準(zhǔn))雙人單面凈化工作臺(tái),蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；IS-RDD3恒溫振蕩器,上海珂淮儀器有限公司；TG16K-II臺(tái)式高速離心機(jī),長(zhǎng)沙艾迪生物科技有限公司；HWS智能型恒溫培養(yǎng)箱,寧波江南儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 耐鹽乳酸菌篩選

1.3.1.1 初篩

參考熊蝶等[12]的方法稱取樣品,選擇合適梯度稀釋。每個(gè)稀釋度吸取100 μL樣液涂布于含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基,36 ℃,48 h培養(yǎng)。挑取含溶鈣圈的疑似菌落,平板劃線分離純化得到單菌落,進(jìn)行革蘭氏染色與接觸酶實(shí)驗(yàn)。挑選G+、接觸酶陰性的單菌落并編號(hào),于MRS液體培養(yǎng)基活化,接種量2%(接種量以體積分?jǐn)?shù)計(jì),下同)于質(zhì)量濃度為0、40、70、100、130、160、200 g/L NaCl的MRS液體培養(yǎng)基,36 ℃,24 h培養(yǎng),酶標(biāo)儀測(cè)定OD600,挑選最高鹽濃度下的D70菌株,接種2%于40、50、60、70、80、90、100 g/L的MRS液體培養(yǎng)基,選擇D70最高的5株菌進(jìn)行復(fù)篩。D70按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：D70,OD600值比值大于70%,%；Ax,不同NaCl質(zhì)量濃度下的菌株OD600值；A0,不含NaCl下的菌株OD600值。

1.3.1.2 復(fù)篩

將復(fù)篩菌株活化,接種2%于70 g/L NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng),每2 h取樣,測(cè)定OD600、總酸含量,選擇菌株活力、產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 總酸測(cè)定

參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定方法》中酸堿滴定法,以乳酸計(jì)。

1.3.3 耐鹽乳酸菌鑒定

生理生化鑒定：乳酸菌成套生化鑒定管；16S rDNA測(cè)序：活化的菌液于湖南擎科生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序,MEGA 7.0繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹,最終確定菌株種屬。

1.3.4 紫外誘變及傳代穩(wěn)定性

1.3.4.1 紫外誘變時(shí)間的選擇

活化菌株,4 ℃、8 000 r/min離心10 min,無(wú)菌生理鹽水洗滌2次,稀釋菌液至107CFU/mL,取2 mL菌液于9 cm培養(yǎng)皿中,無(wú)菌條件下打開皿蓋,紫外(30 W,30 cm)分別照射0、5、10、15、20、25、30 s。紫外誘變后的菌液適當(dāng)稀釋后取200 μL涂布于含1% CaCO3的MRS平板,37 ℃培養(yǎng)48 h,平板計(jì)數(shù),按公式(2)計(jì)算致死率,為避免光修復(fù)稀釋涂布培養(yǎng)等操作應(yīng)避光或在黃光、紅光下進(jìn)行[13]。

(2)

式中：R,致死率,%；C0：誘變前活菌濃度,CFU/mL；C1：誘變后活菌濃度,CFU/mL。

1.3.4.2 紫外誘變及突變菌株穩(wěn)定性測(cè)定

將紫外誘變后的菌液適當(dāng)稀釋,取200 μL涂布于1% CaCO3的MRS培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取溶鈣圈較大,菌體稠厚的菌落接種于含80 g/L NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),測(cè)定OD600值、總酸。以原始菌株為對(duì)照,對(duì)耐鹽、產(chǎn)酸量最高的乳酸菌進(jìn)行二次紫外誘變并篩選出耐鹽高產(chǎn)酸菌株,將該菌株連續(xù)培養(yǎng)10代,檢測(cè)每代耐鹽產(chǎn)酸性,并觀察其發(fā)酵穩(wěn)定性。

1.3.5 耐鹽乳酸菌的耐受性

1.3.5.1 耐酸能力的測(cè)定

活化菌株,接種5%至 pH 值為2.0、3.0、4.0 的MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)3 h,活菌計(jì)數(shù),計(jì)算存活率,即接種培養(yǎng)3 h前后活菌數(shù)的比值。

1.3.5.2 耐膽鹽能力的測(cè)定

活化菌株,接種5%于質(zhì)量濃度為 1、2、3、4 g/L豬膽鹽的MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)3 h,活菌計(jì)數(shù)。

1.3.5.3 耐人工模擬胃腸液能力的測(cè)定

參照張林奇等[14]的方法修改,活化菌株,4 ℃、8 000 r/min離心10 min,無(wú)菌生理鹽水洗滌2次,吸取1 mL菌液接種于9 mL人工模擬胃液,37 ℃培養(yǎng)2 h,活菌計(jì)數(shù),再取經(jīng)人工模擬胃液處理后的菌液1 mL接種至9 mL人工模擬腸液,37 ℃培養(yǎng)8 h,每2 h活菌計(jì)數(shù)。

1.3.5.4 耐鹽能力的測(cè)定

活化菌株,接種5%于70、80、90、100 g/L NaCl的MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)3 h,取樣活菌計(jì)數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)用“數(shù)值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 22進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽乳酸菌篩選

對(duì)耐鹽產(chǎn)酸菌株進(jìn)行初篩,挑選含溶鈣圈的菌落劃線純化,共68株菌,均為革蘭氏染色陽(yáng)性、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性菌。將68株菌分別于0～200 g/L不同NaCl質(zhì)量濃度下培養(yǎng),NaCl質(zhì)量濃度最高為70 g/L時(shí)滿足D70的菌株有14株,將14株菌分別于40～100 g/L不同NaCl質(zhì)量濃度下培養(yǎng),選擇D70含量最高的5株菌進(jìn)行復(fù)篩,菌株編號(hào)分別為L(zhǎng)-8、L-14、L-22、L-29、L-31。

對(duì)初篩得到的5株菌進(jìn)行復(fù)篩,并繪制不同菌株在70 g/L NaCl濃度下的OD600及產(chǎn)酸曲線。如圖1所示,篩選的菌株均具有良好的耐鹽產(chǎn)酸特性。其中L-14菌株與其他菌株相比,在0～10 h時(shí)菌株活力與產(chǎn)酸能力略為滯后,在12 h時(shí)與其他菌株基本持平,12 h后OD600與產(chǎn)酸能力顯著高于其他菌株(P<0.05),并于26 h進(jìn)入穩(wěn)定期,OD600最高達(dá)(1.736±0.05),總酸含量達(dá)(13.838±0.11) g/kg。這是因?yàn)樵诎l(fā)酵初期,菌株處于適應(yīng)階段,生長(zhǎng)代謝緩慢,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,迅速繁殖代謝產(chǎn)酸。不同菌株的生長(zhǎng)代謝能力不同,其中菌株L-14在70 g/L NaCl下產(chǎn)酸能力最強(qiáng),因此選擇L-14菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

a-生長(zhǎng)曲線;b-產(chǎn)酸曲線圖1 不同菌株在70 g/L NaCl濃度下的生長(zhǎng)產(chǎn)酸曲線Fig.1 Growth and acid production curves of different strains under 70 g/L NaCl

2.2 耐鹽乳酸菌的鑒定

2.2.1 生理生化鑒定

菌株生理生化結(jié)果如表1,參考《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[15],初步確定菌株L-14為植物乳桿菌屬。

表1 菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification results of strain L-14

2.2.2 16S rDNA測(cè)序

純化后的菌液送至湖南擎科生物科技測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì),MEGA8軟件中的鄰接法(neighbour-joining,NJ) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖2所示。菌株L-14與植物乳桿菌L.plantarum6641(登錄號(hào)：MT_463 849.1)相似度100%,結(jié)合生理生化鑒定和16S rDNA測(cè)序結(jié)果,進(jìn)一步確定菌株L-14為植物乳桿菌。

圖2 菌株L-14的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain L-14

2.3 耐鹽乳酸菌紫外誘變及遺傳穩(wěn)定性

2.3.1 誘變時(shí)間的選擇

菌株在30 W、30 cm條件下紫外誘變,結(jié)果如圖3所示,紫外照射20 s時(shí)出現(xiàn)90%以上的致死率。由于紫外誘變后DNA產(chǎn)生嘧啶二聚體,導(dǎo)致基因突變,根據(jù)70%～80% 致死率可提高菌株正向突變率的觀點(diǎn)[13],紫外照射15 s時(shí),菌株L-14致死率為79.05%,因此選擇15 s為紫外誘變最佳時(shí)間。

圖3 誘變時(shí)間對(duì)菌株L-14的致死率的影響Fig.3 Effect of mutagenesis time on the lethality of strain L-14

2.3.2 耐鹽乳酸菌的誘變育種

對(duì)L-14菌懸液紫外照射15 s,結(jié)果如表2所示,正向突變菌株(OD600>0.347)共計(jì)23株,在80 g/L NaCl下其產(chǎn)酸量均高于原始菌株,其中L14U1-16菌株產(chǎn)酸量最高,達(dá)8.833 g/kg,較原始菌株產(chǎn)酸量(7.770 g/kg)提高13.68%,故選擇L14U1-16進(jìn)行二輪紫外誘變。

表2 一輪紫外誘變下的突變菌株產(chǎn)酸情況Table 2 Acid production of mutant strains under one round of UV mutation

由表3可知,二輪紫外誘變的正向突變菌株(OD600>0.347)共計(jì)24株,在80 g/L NaCl下其產(chǎn)酸量均高于原始菌株,其中L14U2-3菌株產(chǎn)酸量最高,達(dá)8.989 g/kg,較原始菌株產(chǎn)酸量(7.770 g/kg)提高15.69%,較L14U1-16提高1.77%。

表3 二輪紫外誘變下的突變菌株產(chǎn)酸情況Table 3 Acid production of mutant strains under two rounds of UV mutation

續(xù)表3

2.3.3 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性

分別將L14U2-3和L14U1-16置于80 g/L NaCl條件下傳代培養(yǎng)10次,測(cè)定產(chǎn)酸穩(wěn)定性。由表4可知,L14U2-3穩(wěn)定性最好,傳代過程中產(chǎn)酸無(wú)顯著性差異,且L14U1-16呈現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05),遺傳性狀不夠穩(wěn)定,故選擇菌株L14U2-3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表4 突變菌株產(chǎn)酸穩(wěn)定性 單位：g/L

2.4 耐鹽乳酸菌耐受性測(cè)定

乳酸菌的益生功能可分為腸道功能、免疫功能、代謝功能[16]。乳酸菌在人體充分發(fā)揮益生功能的前提是其能否耐受人體胃腸環(huán)境。

2.4.1 耐酸能力測(cè)定

乳酸菌在低pH環(huán)境(pH 2～3.5)中生存是適應(yīng)人體胃液環(huán)境的必要條件之一[17],由圖4可知,2株菌均具有良好的耐酸能力,隨著pH增加,存活率均顯著增加(P<0.05),在相同pH條件下,突變菌株L14U2-3存活率均高于原始菌株L-14。其中在pH 2.0時(shí)培養(yǎng)3 h后L-14、14U2-3存活率均高于80%,分別為(81.75±2.34)%、(85.09±1.99)%,L14U2-3較L-14存活率提高4.09%,這與蒙月月等[18]的研究相似。2株菌株存活率均隨pH增大而增大,這是由于pH 較低時(shí)破壞了菌株胞內(nèi)pH的動(dòng)態(tài)平衡,使胞內(nèi)pH隨環(huán)境pH下降,從而改變細(xì)胞膜通透性,影響其對(duì)外界營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用,使其生長(zhǎng)受到抑制或延滯期延長(zhǎng),甚至死亡[19]。

圖4 乳酸菌耐酸能力的測(cè)定Fig.4 Acid tolerance of lactic acid bacteria 注:不同字母表示同一菌株組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4.2 耐膽鹽能力測(cè)定

將菌株L-14、L14U2-3分別置于含膽鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng),模擬人體小腸膽鹽濃度(0.3～3 g/L)波動(dòng)[20]。由圖5可知,菌株活菌數(shù)均隨膽鹽濃度升高而顯著降低(P<0.05),當(dāng)膽鹽質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí),活菌數(shù)均高于106CFU/mL,分別為(6.33±0.02)和(6.01±0.33)lg CFU/mL,突變菌株L14U2-3較原始菌株L-14活菌數(shù)提高5.32%,由陳儀婷等[21]篩選的植物乳桿菌YXB12在3 g/L膽鹽下活菌數(shù)為0,相比之下兩株菌株對(duì)膽鹽具有更好的耐受性?？赡茉蚴侵参锶闂U菌自身具有幾種耐受膽鹽的系統(tǒng)和機(jī)制,在膽鹽脅迫下,分子伴侶蛋白dnaK、groES等7種應(yīng)激基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),從而提高其膽鹽耐受能力[22]。

圖5 乳酸菌耐膽鹽能力的測(cè)定Fig.5 Bile salt tolerance of lactic acid bacteria

2.4.3 耐人工模擬胃腸液能力測(cè)定

將菌株L-14、L14U2-3分別置于人工模擬胃液處理2 h,再經(jīng)腸液處理8 h,結(jié)果如圖6所示,經(jīng)人工模擬胃液處理2 h,活菌數(shù)無(wú)較大變化,均高于108CFU/mL,再經(jīng)腸液處理后2 h后,活菌數(shù)顯著下降(P<0.05),但在2～8 h間活菌數(shù)均維持在106CFU/mL以上,可能原因是胃腸液中的胃蛋白酶和胰蛋白酶會(huì)抑制菌株初始被膜的形成,同時(shí)破壞成熟的被膜,從而抑制菌株生長(zhǎng)甚至造成死亡[23]?？傮w而言,L-14、L14U2-3具有較強(qiáng)的胃腸液耐受性,這與HAN等[24]的研究結(jié)果相類似。

a-耐人工模擬胃液；b-耐人工模擬腸液圖6 乳酸菌耐人工模擬胃腸液能力的測(cè)定Fig.6 Tolerance of lactic acid bacteria to artificial simulated gastrointestinal fluid

2.4.4 耐鹽能力測(cè)定

由圖7可知,原始菌株L-14培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)隨NaCl質(zhì)量濃度增大而顯著減少(P<0.05),突變菌株L14U2-3 在NaCl質(zhì)量濃度>80 g/L時(shí),活菌數(shù)顯著降低(P<0.05)。NaCl質(zhì)量濃度相同時(shí),L14U2-3活菌數(shù)均高于L-14,在80 g/L NaCl質(zhì)量濃度下活菌數(shù)分別為(8.89±0.003)和(8.20±0.118)lg CFU/mL,耐鹽能力提高8.41%,可能是植物乳桿菌的相容性溶質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)有助于應(yīng)對(duì)環(huán)境中的鹽脅迫[25],從而提高其耐受性。

圖7 乳酸菌耐鹽能力的測(cè)定Fig.7 Salt tolerance of lactic acid bacteria

3 結(jié)論與討論

程強(qiáng)等[26]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌M616在80 g/L NaCl下基本不生長(zhǎng),李靜等[27]從泡菜中篩選的植物乳桿菌LP-09在80 g/L NaCl下產(chǎn)酸量為3 g/L。本文從傳統(tǒng)辣椒發(fā)酵食品中篩選出一株耐鹽產(chǎn)酸菌株L-14,經(jīng)鑒定菌株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。對(duì)其進(jìn)行二輪紫外誘變得到突變菌株L14U2-3,其在80 g/L NaCl下較原始菌株L-14耐鹽能力提高8.41%,產(chǎn)酸量提高15.69%,達(dá)到8.989 g/L。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)突變菌株L14U2-3耐酸、耐膽鹽、耐鹽(NaCl)能力均優(yōu)于原始菌株L-14,可用于紅酸湯高鹽發(fā)酵,簡(jiǎn)化辣椒脫鹽工序,提高生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本,緩解工業(yè)化生產(chǎn)過程中紅酸湯主要原料辣椒脫鹽處理時(shí)所帶來的營(yíng)養(yǎng)成分流失和水污染問題,助力酸湯產(chǎn)業(yè)發(fā)展。