彭穎,潘思軼,張德新

1(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 檢驗(yàn)學(xué)院,湖北 武漢,430065) 2(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,湖北 武漢,430070) 3(安琪酵母股份有限公司,湖北 宜昌,443003)

化橘紅(ExocarpiumcitriGrandis)是產(chǎn)于廣東省化州市(原化州縣)的化州柚,是自古應(yīng)用的特色地道藥材,因其外果皮密被茸毛,習(xí)稱毛橘紅；而柚的外果皮光滑無(wú)毛,習(xí)稱光橘紅,毛橘紅質(zhì)量?jī)?yōu)于光橘紅,明清兩代更曾列為皇室貢品[1]?；偌t在宋代以后就開(kāi)始入藥,主治風(fēng)寒咳嗽、實(shí)積暖氣及喉癢痰多等癥,作為一種藥材,化橘紅有很悠久的歷史[2],胡夢(mèng)君[3]采用醇提法提取化橘紅黃酮,發(fā)現(xiàn)化橘紅中的黃酮主要是柚皮苷和野漆樹(shù)苷,兩者占黃酮總量的84%以上,且柚皮苷含量遠(yuǎn)大于野漆樹(shù)苷,柚皮苷占2種物質(zhì)含量的72.45%,已有報(bào)道[4-6]柚皮苷具有多種生理活性,歐陽(yáng)振宇[7]以柚皮渣為原料,超聲波輔助提取柚皮苷,并用D101大孔樹(shù)脂分離富集,得到純度為83.7%的柚皮苷；柚皮苷在堿性條件下加壓并以鈀碳作為催化劑合成柚皮苷二氫查爾酮(naringin dihydrochlcone,Naringin DC),產(chǎn)率為85.2%。TANG等[8]和湯冬梅[9]以超聲波輔助乙醇提取香柚皮中的柚皮苷,并用弱極性AB-8樹(shù)脂分離純化柚皮苷,NaOH溶液作為洗脫劑,得到純度為77.26%的柚皮苷堿溶液,最后將該堿液在催化劑雷尼鎳的作用下,加氫合成Naringin DC。Naringin DC作為黃酮類甜味劑,不僅具有甜度大的特點(diǎn),還是一種強(qiáng)抗氧化劑[10-12]。

甜味是通過(guò)口腔味覺(jué)受體細(xì)胞膜上的味覺(jué)受體第一家族T1Rs識(shí)別并傳遞信號(hào)[13-15]。計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)是一種新型的虛擬藥物篩選的技術(shù),該技術(shù)成本低,不僅能降低所需的活性篩選藥物分子數(shù)量,還能提高發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)活性化合物的效率。藥效團(tuán)是對(duì)受體起作用的藥物小分子所共有的并與大分子之間起關(guān)鍵活性作用的藥效特征元素及空間結(jié)構(gòu),藥效特征元素可以是疏水基團(tuán)、化學(xué)基團(tuán)和氫鍵受體基團(tuán)等[16]。

本研究利用化橘紅提取柚皮苷單體,并催化加氫制備柚皮苷二氫查爾酮,進(jìn)一步用SYBYL-X及Discovery Studio 2.5軟件對(duì)柚皮苷二氫查爾酮的甜味機(jī)理及甜味藥效團(tuán)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正毛化橘紅,化州市平定鎮(zhèn)；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品、柚皮苷二氫查爾酮標(biāo)準(zhǔn)品,上海源葉。

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠；Niconlet6700傅里葉紅外光譜儀,美國(guó)熱電公司；JSM-IT300掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM),日本電子株式會(huì)社；CJF-0.5不銹鋼高壓反應(yīng)釜,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SYBYL-X2.0軟件,Tripos公司；Discovery Studio 2.5軟件,Accelrys公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化橘紅柚皮苷提取及水沉法純化

稱取500 g化橘紅粉末,在提取溫度57.5 ℃,液料比60.9∶1(mL∶g),乙醇體積分?jǐn)?shù)為50.8%的條件下提取化橘紅柚皮苷[17]?；偌t乙醇提取液經(jīng)過(guò)旋蒸回收乙醇,得到化橘紅浸膏,浸膏加蒸餾水調(diào)整質(zhì)量濃度為1.048 2 g/mL,10 ℃靜置12 h過(guò)濾得到純度為95.1%的化橘紅柚皮苷[18]。

1.2.2 水沉產(chǎn)物的紅外光譜分析

使用美國(guó)Nicolet6700型紅外光譜儀,采用KBr壓片法制樣,測(cè)定水沉產(chǎn)物紅外圖譜。相關(guān)參數(shù)為：KBr與樣品置于WS70-1紅外線快速干燥器烘干至少2 h；于干燥器門口取10 mg樣品與500 mg KBr于瑪瑙研缽中混合并研至顆粒細(xì)小、無(wú)反光為止；將研磨后的粉末置于壓片裝置中壓片,壓力為20～25 MPa,壓片時(shí)間為10～60 s[19]。

1.2.3 水沉產(chǎn)物的SEM分析

采用日本電子株式會(huì)社JSM-IT300型SEM設(shè)備觀察加氫產(chǎn)物形貌,加氫產(chǎn)物進(jìn)行表面噴鍍金保護(hù)層處理。SEM主要技術(shù)參數(shù)為二次電子像分辨率3.0 nm；背散射電子像分辨率4.0 nm；放大倍數(shù)范圍：300～5 000；電子槍加速電壓20 kV；圖像種類：二次電子像；標(biāo)尺長(zhǎng)度5～50 μm[20]。

1.2.4 水沉產(chǎn)物的核磁共振碳譜(13C nuclear magnetic resonance,13C NMR)分析

利用13C NMR分析水沉產(chǎn)物的碳譜,樣品的制備方法為：取20 mg水沉產(chǎn)物充分溶解于0.6 mL氘代甲醇后移入核磁管中備用。

1.2.5 加氫產(chǎn)物的制備

不銹鋼高壓反應(yīng)釜中加入1.2.1中制備的柚皮苷5.0 g,緩慢加入NaOH溶液使反應(yīng)溶液終pH值為13,加入過(guò)量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%鈀碳催化劑,壓力為1.5 MPa,溫度設(shè)為40 ℃,置于磁力攪拌器上,在反應(yīng)開(kāi)始的2 h通入氫氣,間隔1 h后關(guān)閉氫氣閥門以保持反應(yīng)速率。在12 h后結(jié)束反應(yīng),產(chǎn)物過(guò)濾回收催化劑,濾液通過(guò)732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂除去NaOH溶液,靜置過(guò)濾烘干得到加氫改性產(chǎn)物[7]。

1.2.6 加氫產(chǎn)物的紅外光譜分析

方法同1.2.2。

1.2.7 加氫產(chǎn)物的SEM分析

方法同1.2.3。

1.2.8 加氫產(chǎn)物的13C NMR分析

利用13C NMR分析加氫產(chǎn)物的碳譜,樣品的制備方法同1.2.4。

1.2.9 Naringin DC甜度測(cè)定

參照甜度的感官比較法[21],測(cè)定樣品甜度。

1.2.10 分子對(duì)接研究Naringin DC呈甜機(jī)理

G蛋白偶聯(lián)受體是認(rèn)可度較高的甜味受體,這類受體有2個(gè)與甜味相關(guān)的亞型,分別為T1R2、T1R3,用Discovery studio軟件的modeller模塊同源建模,構(gòu)建蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu),然后用autodock vina做Naringin DC與2個(gè)蛋白受體模型的分子對(duì)接,從而從生化結(jié)構(gòu)方面解釋Naringin DC呈甜原因。

1.2.11 分子對(duì)接步驟

采用ChemBioDraw Ultra 12.0畫(huà)出化合物柚皮苷二氫査爾酮的結(jié)構(gòu)(圖1),然后用ChemBio3D Ultra 12.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu),并使用MMFF94力場(chǎng)進(jìn)行優(yōu)化。人甜味受體T1R2和T1R3的三維結(jié)構(gòu)均由SWISS-MODEL同源建模得到(模板蛋白PDB ID為5K5T)。T1R2和T1R3蛋白和柚皮苷二氫査爾酮均使用AutodockTools 1.5.6轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。采用Autodock vina 1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接研究。T1R2和T1R3蛋白活性位點(diǎn)的坐標(biāo)均設(shè)置為：center_x=4.277,center_y=-16.512,center_z=-44.368；size_x=15,size_y=15,size_z=15。為了增加計(jì)算的準(zhǔn)確度,將參數(shù)exhaustiveness設(shè)置為20。除了特別說(shuō)明,其他參數(shù)均采用默認(rèn)值。選取打分值最高的構(gòu)象用PyMoL 1.7.6進(jìn)行結(jié)果分析。

圖1 柚皮苷二氫査爾酮的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of naringin dihydroderone

1.2.12 藥效團(tuán)研究加氫改性產(chǎn)物呈甜機(jī)理

1.2.12.1 小分子的準(zhǔn)備

采用ChemBioDraw Ultra 12.0畫(huà)出化合物A-J的結(jié)構(gòu)(圖2),然后用ChemBio3D Ultra 12.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu),并使用MMFF94力場(chǎng)進(jìn)行初步優(yōu)化。然后將10個(gè)小分子分別用SYBYL-X 2.0進(jìn)行優(yōu)化。使用Tripos力場(chǎng)進(jìn)行優(yōu)化,加載Gasteiger-Huckel電荷,當(dāng)能量梯度收斂達(dá)到0.005 kcal/(mol·A)或是迭代次數(shù)超過(guò)1 000,則優(yōu)化停止。

圖2 十種二氫查爾酮分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Ten molecular structures of dihydrochalcone

1.2.12.2 藥效團(tuán)的構(gòu)建

啟動(dòng)Discovery Studio 2.5,使用Common Feature Pharmacophore Generation protocol 來(lái)產(chǎn)生藥效團(tuán)。

(1)將10個(gè)化合物導(dǎo)入 Discovery Studio 2.5

(2)為10個(gè)化合物添加藥效團(tuán)參數(shù)：Principal 和 MaxOmitFeat

使用View | Data Table展示Data Table,隱藏除Name以外的數(shù)據(jù)列。選擇Data Table Name列的heading,鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊選擇Add Attributes,給分子添加Principal參數(shù),點(diǎn)擊OK。然后在Data Table中將化合物B的Principal值改為2。重復(fù)上面操作,為各小分子添加MaxOmitFeat參數(shù),點(diǎn)擊OK。最終得到3D Windows內(nèi)容。

(3)加載protocol,輸入計(jì)算參數(shù)

Ⅰ)加載protocol,雙擊Protocol Explorer窗口Pharmacophore下的Common Feature Pharmacophore Generation protocol。

Ⅱ)指定ligand：選擇All ligands from a 3D view選項(xiàng)。

Ⅲ)其他參數(shù)設(shè)置：Conformation Generation設(shè)置為Best；Number of Leads That May Miss設(shè)置為2；Advanced | Complete Misses設(shè)置為1；Advanced | Feature Misses設(shè)置為1。

(4)點(diǎn)擊Run按鈕開(kāi)始計(jì)算

雙擊Jobs Explorer 窗口中相應(yīng)的行,出現(xiàn)Common Feature Pharmacophore Generation-html window。本次計(jì)算一共產(chǎn)生了10個(gè)藥效團(tuán)模型,可以點(diǎn)擊ViewResults1.pl ViewResults10.pl依次察看各個(gè)藥效團(tuán)。

2 結(jié)果與討論

2.1 加氫改性反應(yīng)過(guò)程及機(jī)理

圖3為柚皮苷催化加氫改性反應(yīng)機(jī)理。

a-堿性開(kāi)環(huán)；b-催化加氫；c-二氫黃酮堿性開(kāi)環(huán)機(jī)理；d-Pd-C催化烯烴加氫機(jī)理圖3 柚皮苷催化加氫機(jī)理Fig.3 Catalytic hydrogenation mechanism of naringin

首先柚皮苷在堿性條件下開(kāi)環(huán)得到柚皮苷査爾酮,見(jiàn)圖3-a及圖3-b。具體反應(yīng)機(jī)理如圖3-c所示。堿拔掉羰基α-氫原子,成負(fù)離子,然后電子轉(zhuǎn)至芐位碳上,碳氧鍵斷開(kāi),成雙鍵和氧負(fù)離子。

然后柚皮苷査爾酮在Pd-C催化下,加氫得到Naringin DC,催化加氫歷程如圖3-d所示：Pd催化劑將氫和烯吸附在它的表面,這種吸附是一種化學(xué)吸附。吸附后氫分子的原子之間的σ鍵變?nèi)?氫幾乎以原子狀態(tài)被吸附在Pd催化劑表面,烯的π鍵打開(kāi),即與金屬表面成鍵,氫逐步轉(zhuǎn)到烯上,形成加成產(chǎn)物。

2.2 水沉產(chǎn)物的紅外圖譜

水沉得到的產(chǎn)物紅外光譜圖如圖4所示。

由圖4可以看出,水沉產(chǎn)物紅外特征吸收峰分析如下：1 642.88 cm-1處有強(qiáng)吸收,為羰基的伸縮振動(dòng)峰；3 393.71 cm-1處有寬而強(qiáng)的吸收峰,為羥基的伸縮振動(dòng)峰,由氫鍵締合后的羥基引起；2 919.28 cm-1為甲基不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；1 521.00 cm-1為苯環(huán)上碳碳雙健的骨架振動(dòng),符合柚皮苷的紅外圖譜[4]。

圖4 水沉產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of aqueous precipitate products

2.3 水沉產(chǎn)物SEM結(jié)果

圖5是不同視野下的水沉產(chǎn)物掃描電鏡照片,可以看出加水靜置過(guò)程中,柚皮苷以結(jié)晶的形式從水中析出。

注:a-×5 000;b-×2 000;c-×1 000;d-×500;e-×300圖5 水沉產(chǎn)物SEM照片F(xiàn)ig.5 Scanning electron microscope photographs of water settlement products

2.4 加氫改性產(chǎn)物紅外光譜結(jié)果分析

圖6 催化加氫產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of catalytic hydrogenation products

2.5 加氫改性產(chǎn)物SEM結(jié)果分析

圖7為不同視野下的柚皮苷催化加氫改性產(chǎn)物掃描電鏡圖。

注:a-×5 000;b-×2 000;c-×1 000;d-×500;e-×100圖7 加氫改性產(chǎn)物SEM照片F(xiàn)ig.7 SEM photographs of hydrogenated modified products

由圖7可以看出,干燥的加氫改性產(chǎn)物是結(jié)晶狀態(tài),與Naringin DC的狀態(tài)相同,由于在常溫水溶液中容易形成晶體析出,因此Naringin DC在常溫水溶液中的溶解度極低。

2.6 水沉產(chǎn)物13C NMR分析結(jié)果

圖8 水沉產(chǎn)物13C NMR結(jié)果Fig.8 13C NMR of water settling products

圖9 柚皮苷分子結(jié)構(gòu)式Fig.9 Molecular structure formula of naringin

由圖8可以看出：13C NMR,CD3OD,100 MHz,δ：207.04(C-3),165.44(C-7),164.65(C-5),164.61(C-9),156.49(C-13),133.85(C-10),130.37(C-11,15),116.16(C-12,14),106.89(C-4),102.50(C-1′,7′),99.36(C-6),96.28(C-8),79.09(C-2′),78.90(C-1),78.17(C-5′),74.00(C-3′),72.25(C-11′),72.16(C-8′),71.26(C-10′),69.98(C-9′),62.33(C-4′),47.58(C-6′),31.27(C-2),18.28(C-12′)。13C NMR圖譜解析結(jié)果與柚皮苷的結(jié)構(gòu)式(圖9)一致,可知水沉產(chǎn)物是柚皮苷。

2.7 加氫產(chǎn)物13C NMR分析結(jié)果

由圖10可知：13C NMR,CD3OD,100 MHz,δ：198.58(C-3),166.55(C-7),164.99(C-5),164.67(C-9),159.12(C-13),130.81(C-10),129.19(C-11,15),116.37(C-12,14),104.93(C-7′),102.58(C-1′),99.35(C-4),97.87(C-6),96.78(C-8),80.73(C-2′),79.12(C-5′),78.96(C-3′),78.13(C-11′),73.93(C-8′),72.18(C-10′),71.23(C-9′),70.02(C-4′),62.27(C-6′),44.19(C-2),43.97(C-1),18.28(C-12′)。13C NMR圖譜解析結(jié)果與柚皮苷二氫查爾酮的結(jié)構(gòu)式(圖11)一致,因此加氫產(chǎn)物是柚皮苷二氫查爾酮。

圖10 加氫產(chǎn)物13C NMR結(jié)果Fig.10 NMR results of hydrogenation products

圖11 柚皮苷二氫查爾酮分子結(jié)構(gòu)Fig.11 Molecular structure of naringin dihydrochalcone

2.8 甜度測(cè)定結(jié)果

根據(jù)1.2.9方法測(cè)定甜度結(jié)果如表1所示。

表1 甜度的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of sweetness

由表1可以看出,感官比較法測(cè)得的甜度結(jié)果為：Naringin DC樣品甜度為400；Naringin DC為400；NHDC為800；三氯蔗糖為400；糖精鈉為500；阿斯巴甜和安賽蜜為100。

2.9 Naringin DC與G蛋白偶聯(lián)受體3個(gè)亞基的結(jié)合

為了從分子水平闡明Naringin DC與人甜味受體T1R2和T1R3的作用模式,將Naringin DC分別對(duì)接至甜味受體T1R2和T1R3的活性口袋。結(jié)果如圖12所示。

Naringin DC與甜味受體T1R2的作用模式如圖12-a所示。Naringin DC末端的苯環(huán)與氨基酸殘基Ala-166和Ile-167形成疏水性相互作用。Naringin DC可以與氨基酸殘基Asp-142形成長(zhǎng)為2.3 ?的氫鍵作用。所有的這些相互作用使得Naringin DC與T1R2形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

Naringin DC與甜味受體T1R3的結(jié)合模式如圖12-b所示。Naringin DC的末端苯環(huán)可以分別與氨基酸殘基His-145和His-388形成CH-π相互作用。重要的是,Naringin DC可以分別與氨基酸殘基Thr-305和Ser-306形成長(zhǎng)為3.5和3.3 ?的雙重氫鍵作用。所有的這些相互作用使得Naringin DC與甜味受體T1R3形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

a-與T1R2活性口袋對(duì)接；b-與T1R3活性口袋對(duì)接圖12 分子對(duì)接結(jié)果Fig.12 Molecular docking results

此外,計(jì)算結(jié)果顯示,Naringin DC與人甜味受體T1R2和T1R3的結(jié)合能分別為-6.8和-7.0 kcal/mol,即Naringin DC與甜味受體親和力的順序?yàn)椋篢1R3>T1R2。推測(cè)Naringin DC極有可能是與人甜味受體T1R3結(jié)合,從而呈現(xiàn)出甜味。

總之,上述的分子對(duì)接研究對(duì)化合物Naringin DC與人甜味受體T1R2和T1R3的相互作用給予了詳細(xì)的分析,為從分子水平解釋Naringin DC的呈甜機(jī)理提供了新思路。

2.10 十種二氫查爾酮藥效團(tuán)結(jié)果

由圖13～圖14及表2可以看出,該藥效團(tuán)模型由3個(gè)藥效特征組成,即1個(gè)氫鍵供體(紫色)和2個(gè)氫鍵受體(綠色)。依次點(diǎn)擊各化合物的Name可以查看每個(gè)化合物與該藥效團(tuán)的匹配情況(圖14)。匹配程度可以用1個(gè)量化的數(shù)值Fit值來(lái)衡量,Fit值越大,該化合物分子與藥效團(tuán)模型的匹配程度就越高。10種二氫查爾酮的甜味大小為B>A>D>C>J>I>E>G>F>H即NHDC>Naringin DC>橙皮素二氫查爾酮-4’-β-D-葡萄糖苷>野黑櫻素二氫查爾酮>3’-O-乙?；ぼ?2’-O-乙酰基根皮苷>根皮苷>3-羥基根皮苷>二氫查爾酮>根皮素。

圖13 藥效團(tuán)模型Fig.13 Pharmacophore model

a-B；b-A；c-D；d-C；e-J；f-I；g-E；h-G；i-F；j-H圖14 化合物B、A、D、C、J、I、E、G、F和H與藥效 團(tuán)模型匹配情況Fig.14 Matching of compounds B,A,D,C,J,I,E,G,F and H with pharmacophore model

表2 Fit值Table 2 Fit value

3 結(jié)論

在超聲波180 W,超聲時(shí)間50 min,液料比為60.9∶1(mL∶g),提取溫度57.5 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)50.8%條件下[11],利用醇提水沉工藝純化化橘紅柚皮苷,得到純度為95.1%的化橘紅柚皮苷,不銹鋼高壓反應(yīng)釜中加入該化橘紅柚皮苷,緩慢加入NaOH溶液使終pH值為13,加入10%鈀碳催化劑,在壓力為1.5 MPa,溫度為40 ℃,反應(yīng)12 h后,反應(yīng)達(dá)到平衡,產(chǎn)物過(guò)濾回收催化劑,濾液通過(guò)732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂除去氫氧化鈉,靜置過(guò)濾烘干得到催化加氫產(chǎn)物。通過(guò)紅外光譜、SEM、液質(zhì)聯(lián)用表征產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為Naringin DC,并且其產(chǎn)率為90.3%,液相測(cè)定其純度為97%～99%。該方法簡(jiǎn)單有效,得到的Naringin DC純度高、口感清爽,甜度為400。

利用Discovery Studio軟件測(cè)得Naringin DC與人甜味受體T1R2和T1R3的結(jié)合能力分別為-6.8和-7.0 kcal/moL,即Naringin DC與甜味受體親和力的順序?yàn)椋篢1R3>T1R2。Naringin DC極有可能是與人甜味受體T1R3結(jié)合,從而呈現(xiàn)出甜味。計(jì)算10種二氫查爾酮的藥效團(tuán)得到甜度大小為NHDC>Naringin DC>橙皮素二氫查爾酮-4’-β-D-葡萄糖苷>野黑櫻素二氫查爾酮>3’-O-乙?；ぼ?2’-O-乙酰基根皮苷>根皮苷>3-羥基根皮苷>二氫查爾酮>根皮素。