袁堂國(guó),李益民,杜聰,馮延賓,范超,洪皓,袁文杰*

1(大連理工大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連,116024)2(大連醫(yī)諾生物股份有限公司,遼寧 大連,116600)

D-阿洛酮糖(D-核糖-2-己酮糖)是D-果糖的碳-3差向異構(gòu)體,是一種稀有的單糖,在自然界中天然存在[1]。D-阿洛酮糖因其特殊的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受到了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。在醫(yī)藥領(lǐng)域,其降血脂、降血糖和抗氧化的功能引起了重視[2-4]；在食品領(lǐng)域,其甜度相當(dāng)于蔗糖的70%,熱量相當(dāng)于蔗糖的0.3%,可做為一種健康、安全的甜味劑使用[5]。但D-阿洛酮糖在自然界中含量很低,采用化學(xué)法合成D-阿洛酮糖,萃取分離步驟比較復(fù)雜[6]。而生物轉(zhuǎn)化策略,是一種前景廣闊、環(huán)境友好的D-阿洛酮糖生產(chǎn)方法[7-8]。

目前,生物法生產(chǎn)D-阿洛酮糖主要是通過D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(D-allulose 3-epimerase,DAEase)家族酶轉(zhuǎn)化D-果糖生成。在重組大腸桿菌表達(dá)體系中,不同來源的DAEase轉(zhuǎn)化D-果糖生成D-阿洛酮糖的得率均不超過33%,D-阿洛酮糖與D-果糖的平衡參數(shù)從20∶80到33∶67[9]。此外,DAEase家族酶熱穩(wěn)定性較差,雖然大多數(shù)酶在低于50 ℃的條件下具有較好的熱穩(wěn)定性,但在超過50 ℃的條件下迅速失活,Clostridiumsp.來源的DAEase的半衰期僅有15 min。酶的長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定使用是阿洛酮糖生產(chǎn)中需要解決的重要問題之一。文獻(xiàn)中報(bào)道,金屬離子可以有效穩(wěn)定DAEase的構(gòu)象,且最適離子通常是Mn2+或Co2+[9-10]。

以全細(xì)胞作為生物催化劑,可以避免酶的分離純化步驟,如細(xì)胞裂解、沉淀,而且酶的熱穩(wěn)定性和對(duì)環(huán)境的抗干擾能力比自由酶更優(yōu)[11-12],適于D-阿洛酮糖的生物合成。例如,來源于Agrobacteriumtumefaciens的DAEase重組大腸桿菌表達(dá)體系在50 ℃、pH 8.0、底物質(zhì)量濃度為700 g/L的催化條件下,阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到32.9%。還有研究者將葡萄糖異構(gòu)酶和DAEase構(gòu)建到同一個(gè)表達(dá)載體中,利用重組大腸桿菌將D-葡萄糖異構(gòu)化為D-果糖,然后再將產(chǎn)物D-果糖異構(gòu)化為D-阿洛酮糖[13]。但是D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率偏低,導(dǎo)致該工藝生產(chǎn)成本仍居高不下。

底物和產(chǎn)物的純化成本較高,也是限制D-阿洛酮糖在市場(chǎng)上廣泛應(yīng)用的原因。從D-果糖中分離D-阿洛酮糖是一個(gè)復(fù)雜的過程,目前文獻(xiàn)報(bào)道的主要有3種方法：利用模擬移動(dòng)床層析和陰離子交換樹脂基質(zhì)[14-16],但需要復(fù)雜的設(shè)備和較高的設(shè)備投入;通過葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖氧化酶將D-果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸[10],通過改變物質(zhì)的物理和化學(xué)特性的差異來進(jìn)行分離;使用耐高溫的重組馬克斯克魯維酵母發(fā)酵剩余果糖來降低D-阿洛酮糖的分離難度[17]。

綜上,為進(jìn)一步提高全細(xì)胞催化果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率,并降低分離難度,本文提出了一種低成本的D-阿洛酮糖兩階段生產(chǎn)工藝。在大腸桿菌中表達(dá)了來源于Flavonifractorplautii的DAEase,使用該重組菌在添加硼酸的情況下高效轉(zhuǎn)化果糖后,利用馬克斯克魯維酵母菌Y179發(fā)酵剩余的D-果糖生產(chǎn)乙醇。本研究為D-阿洛酮糖的高效、低成本生產(chǎn)提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料和操作方法

Flavonifractorplautii來源的DAEase的基因序列(GenBank:CP048436.1),根據(jù)大腸桿菌中密碼子的偏好性進(jìn)行了優(yōu)化,由上海生工生物技術(shù)有限公司完成,連接至pET29a,構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pET29a-DAEase。

以大腸桿菌DH5α為宿主菌株進(jìn)行質(zhì)粒保存,以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌株進(jìn)行DAEase目標(biāo)蛋白表達(dá)。發(fā)酵階段利用馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus) Y179將剩余的D-果糖轉(zhuǎn)化為乙醇。

大腸桿菌重組菌株在含有50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),在37 ℃、180 r/min條件下生長(zhǎng)12 h。取5 mL菌液接種于含50 mg/L卡那霉素的250 mL三角瓶中,37 ℃,180 r/min條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)OD620值達(dá)到0.6時(shí),加入終濃度是0.04 mol/L的誘導(dǎo)劑IPTG,18 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,誘導(dǎo)DAEase的表達(dá)。通過離心(12 000 r/min,15 min,4 ℃)的方法收集菌體。

1.2 細(xì)胞干重和細(xì)胞裂解情況的測(cè)定

將誘導(dǎo)的重組大腸桿菌離心回收(12 000 r/min,15 min)獲得濕菌體,然后將離心獲得的濕菌體放入85 ℃烘箱中烘干,24 h后稱量菌體的質(zhì)量,獲得濕重與干重的關(guān)系。

本研究是利用重組大腸桿菌全細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng),為了檢測(cè)重組細(xì)胞在反應(yīng)過程中的裂解情況,通過離心收集65 ℃,60 min反應(yīng)后的上清液,使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量。將上清液中蛋白質(zhì)的含量與利用超聲破碎離心獲得的上清液蛋白質(zhì)含量的百分比來計(jì)算細(xì)胞的裂解率。

1.3 pH、溫度、金屬離子對(duì)重組全細(xì)胞催化速率的影響

為了研究重組大腸桿菌的最適反應(yīng)pH,在含有質(zhì)量濃度200 g/LD-果糖的Tris-HCl緩沖液中(不同pH)進(jìn)行反應(yīng),65 ℃條件下反應(yīng)10 min后利用金屬浴在99 ℃條件下加熱滅活10 min,測(cè)定D-阿洛酮糖的生成速率來反映重組全細(xì)胞催化活性。

對(duì)于重組大腸桿菌的最適反應(yīng)溫度的確定,通過檢測(cè)在含有200 g/LD-果糖的Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中不同溫度(50～75 ℃)條件下的催化速率,確定最佳反應(yīng)溫度,反應(yīng)10 min后加熱滅活,檢測(cè)樣品中產(chǎn)物D-阿洛酮糖的濃度。

在探究金屬離子對(duì)全細(xì)胞催化速率的影響時(shí),將重組大腸桿菌重懸在含有不同金屬離子的Tris-HCl緩沖液中,在4 ℃冰箱中孵育2 h,pH 7.5、65 ℃反應(yīng)10 min后加熱滅活,檢測(cè)產(chǎn)物D-阿洛酮糖的濃度。

為了研究溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響,考察了添加與不添加Co2+條件下全細(xì)胞催化活性。將回收的重組細(xì)胞重懸在Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中,60 ℃條件下放置2 h,在一定時(shí)間間隔下提取樣品,加入終質(zhì)量濃度200 g/LD-果糖,在pH 7.5、65 ℃條件下反應(yīng)10 min后滅活,檢測(cè)產(chǎn)物D-阿洛酮糖的濃度,確定剩余的酶催化活性。

D-阿洛酮糖濃度采用HPLC檢測(cè),使用Ca2+色譜分離樹脂交換柱,柱溫80 ℃,超純水洗脫,流速0.4 mL/min。

1.4 細(xì)胞濃度對(duì)重組全細(xì)胞催化速率的影響

將不同質(zhì)量濃度(0.3～3 g/L,細(xì)胞干重)的重組大腸桿菌細(xì)胞加到一定質(zhì)量濃度(200 g/L)的D-果糖下測(cè)定D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化結(jié)果。Tris-HCl體系中65 ℃反應(yīng)60 min,通過HPLC檢測(cè)D-阿洛酮糖的生成情況。

1.5 緩沖體系對(duì)重組全細(xì)胞催化速率的影響

將誘導(dǎo)表達(dá)的重組大腸桿菌細(xì)胞置于Tris-HCl、超純水、PBS和Glycine-NaOH緩沖液中,65 ℃反應(yīng)60 min,采用HPLC檢測(cè)D-阿洛酮糖的產(chǎn)量。

1.6 硼酸存在對(duì)重組全細(xì)胞催化速率的影響

將一定量的重組大腸桿菌細(xì)胞分別添加到含有D-果糖400 g/L、硼酸68.6 g/L溶液和含有D-果糖600 g/L、硼酸102.9 g/L的溶液中(D-果糖和硼酸的摩爾比是2∶1),用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到7.5,在65 ℃條件下反應(yīng)60 min,通過HPLC檢測(cè)產(chǎn)物D-阿洛酮糖的產(chǎn)量。

1.7 馬克斯克魯維酵母發(fā)酵剩余D-果糖

將重組大腸桿菌全細(xì)胞催化反應(yīng)后的溶液離心除去菌體,獲得混合糖溶液,在溶液中加入5 g/L的馬克斯克魯維酵母,180 r/min、37 ℃條件下發(fā)酵,消耗剩余的D-果糖,生產(chǎn)乙醇,發(fā)酵12 h后補(bǔ)充加入5 g/L的馬克斯克魯維酵母。不同時(shí)間段采集樣品,采用HPLC檢測(cè),ROA有機(jī)酸柱(300 mm×7.8 mm,Bio-Rad,Aminex,HPX-87H)進(jìn)行產(chǎn)物分析,柱溫50 ℃,流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4,流速0.5 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)基因DAEase的表達(dá)分析

通過密碼子優(yōu)化和培養(yǎng)條件優(yōu)化,在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)了DAEase的高水平表達(dá)。采用SDS-PAGE分析了DAEase的表達(dá)量和分子質(zhì)量(圖1)。結(jié)果表明,與不含有載體pET29a-DAEase的菌體比較,構(gòu)建的重組大腸桿菌在33 kDa左右出現(xiàn)了明顯的條帶,與DAEase理論值一致。誘導(dǎo)條件為37 ℃、16 h時(shí),沉淀中含有大量的不溶性包涵體,上清液中目的蛋白含量較少；誘導(dǎo)條件為18 ℃時(shí),雖然沉淀中仍有少量目標(biāo)蛋白,但上清液中的可溶目標(biāo)蛋白明顯增多。因此選擇的誘導(dǎo)條件是18 ℃、16 h。在之前的報(bào)道中,來自F.plautii的DAEase編碼基因在Corynebacteriumglutamicum和大腸桿菌中均能成功表達(dá),但在C.glutamicum中的表達(dá)量遠(yuǎn)低于大腸桿菌。在本研究中,經(jīng)過密碼子優(yōu)化后,DAEase的表達(dá)量比之前文獻(xiàn)報(bào)道的更高,保證了差向異構(gòu)化反應(yīng)更快進(jìn)行。

M-蛋白marker；1-空載的全細(xì)胞(pET29a)；2-空載的破碎沉淀(pET29a)；3-空載的破碎上清液(pET29a)；4-含目的基因的全細(xì)胞(pET29a-DAEase)；5-含目標(biāo)基因的破碎沉淀(pET29a-DAEase)；6-含目的基因的破碎上清液(pET29a-DAEase)；7-含目的基因的全細(xì)胞(pET29a-DAEase)；8-含目標(biāo)基因的破碎沉淀(pET29a-DAEase)；9-含 目的基因的破碎上清液(pET29a-DAEase)圖1 重組大腸桿菌中DAEase的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of DAEase in recombinant E.coli 注:1～6菌體的誘導(dǎo)條件是18 ℃、16 h;7～9菌體的 誘導(dǎo)條件是37 ℃、16 h

2.2 溫度、pH、金屬離子對(duì)重組大腸桿菌全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響

通過圖2-a可知,pH 7.0～8.0時(shí),全細(xì)胞催化活性保持在90%以上,最適pH是7.5。全細(xì)胞反應(yīng)的最適溫度是65 ℃(圖2-b),這些結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似。DAEase家族的反應(yīng)條件屬于弱堿性,最適反應(yīng)溫度較高。在考察金屬離子對(duì)全細(xì)胞催化活性的影響時(shí),將未添加金屬離子的對(duì)照組的催化活性設(shè)為100%,通過圖2-c可知,加入EDTA會(huì)完全抑制DAEase的活性,Cu2+和Ca2+等二價(jià)金屬離子部分抑制DAEase的活性,Co2+和Mn2+增強(qiáng)了催化活性,特別是Co2+對(duì)催化活性的提高更加明顯。

a-pH；b-溫度；c-金屬離子；d-熱穩(wěn)定性圖2 pH、溫度、金屬離子對(duì)重組全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響Fig.2 Effects of pH,temperature and metal ions on whole-cell catalytic reactions

在60 ℃下測(cè)定了添加和不添加Co2+條件下DAEase的熱穩(wěn)定性。圖2-d顯示,添加Co2+不僅增強(qiáng)了DAEase的催化活性,而且提高了熱穩(wěn)定性,添加1 mmol/L Co2+,60 ℃下孵育2 h后催化活性仍保持在80%以上。在60 ℃下不添加金屬離子,酶的半衰期為2.7 h,比文獻(xiàn)報(bào)道的其他DAEase半衰期更長(zhǎng),說明來源于F.plautii的DAEase的熱穩(wěn)定性較好,適于高溫下的催化反應(yīng)。

2.3 細(xì)胞濃度對(duì)重組全細(xì)胞催化速率的影響

不同重組細(xì)胞濃度對(duì)催化效果有明顯影響,通過圖3可知,反應(yīng)時(shí)間在10、30、60 min,催化反應(yīng)速率均隨著細(xì)胞濃度的增加而提高。當(dāng)添加的細(xì)胞質(zhì)量濃度為2.4或3.0 g/L時(shí),催化速率和轉(zhuǎn)化率幾乎一樣,反應(yīng)60 min后,轉(zhuǎn)化率均可達(dá)到33%。

圖3 細(xì)胞濃度對(duì)D-阿洛酮糖生產(chǎn)的影響Fig.3 Effect of cell concentration on the production of D-allulose

為了探究重組細(xì)胞(2.4 g/L干重)催化果糖異構(gòu)化的動(dòng)力學(xué)過程,對(duì)阿洛酮糖隨反應(yīng)時(shí)間的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行了分析。由圖4可知,催化反應(yīng)60 min后轉(zhuǎn)化率達(dá)到33%,隨時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化率沒有明顯的提高,說明在60 min時(shí)已經(jīng)達(dá)到了反應(yīng)終點(diǎn)。通過對(duì)上清液中存在的蛋白質(zhì)濃度分析可知,65 ℃下反應(yīng)60 min后,重組大腸桿菌的裂解率為16%左右。

圖4 轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.4 Change of conversion rate with reaction time

2.4 緩沖體系對(duì)重組全細(xì)胞催化速率的影響

不同緩沖體系對(duì)催化效果沒有明顯影響,通過表1可知,在Tris-HCl、PBS、Glycine-NaOH以及超純水中,阿洛酮糖的最終轉(zhuǎn)化率都可以達(dá)到33%,這為接下來的發(fā)酵階段提供了有利的條件。由于重組細(xì)胞可以將純水中的D-果糖有效的轉(zhuǎn)化成D-阿洛酮糖,可以避免額外添加各種離子,簡(jiǎn)化了生產(chǎn)步驟并降低了分離純化難度和成本。

表1 不同緩沖體系下生產(chǎn)D-阿洛酮糖Table 1 Production of D-allulose under different buffer systems

硼酸根可以與多羥基化合物結(jié)合形成絡(luò)合物,其結(jié)合能力因糖的種類不同而有所區(qū)別。D-阿洛酮糖與硼酸根結(jié)合形成的絡(luò)合物比D-果糖與硼酸根結(jié)合形成的絡(luò)合物更加穩(wěn)定,所以在催化體系中添加硼酸根有利于反應(yīng)向生成D-阿洛酮糖的方向移動(dòng),從而提高D-果糖的轉(zhuǎn)化率[18-20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在含有硼酸根的情況下,當(dāng)初始底物D-果糖的質(zhì)量濃度為600 g/L時(shí),產(chǎn)物D-阿洛酮糖的終質(zhì)量濃度可達(dá)到378 g/L(表1),轉(zhuǎn)化率達(dá)到了63%。

2.5 馬克斯克魯維酵母發(fā)酵剩余D-果糖生產(chǎn)乙醇

由于底物果糖和產(chǎn)物阿洛酮糖是同分異構(gòu)體,在現(xiàn)有技術(shù)條件下分離成本較高[21]。本研究利用馬克斯克魯維酵母將未轉(zhuǎn)化的D-果糖發(fā)酵成乙醇,降低D-阿洛酮糖分離純化難度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,初始200 g/L的D-果糖溶液,在不添加硼酸的條件下,重組大腸桿菌催化完成后,體系中剩余130 g/L的D-果糖,添加5 g/L(干重)的馬克斯克魯維酵母,可以在15 h之內(nèi)將剩余的D-果糖全部發(fā)酵生成乙醇,乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到60 g/L,而D-阿洛酮糖的量沒有變化(圖5-a)。在添加硼酸根的反應(yīng)體系中,利用重組大腸桿菌完成異構(gòu)化后,體系中剩余65 g/L左右D-果糖,發(fā)酵階段添加5 g/L馬克斯克魯維酵母,剩余D-果糖也可以全部轉(zhuǎn)化成乙醇,質(zhì)量濃度為26 g/L。雖然高濃度硼酸會(huì)抑制馬克斯克魯維酵母菌的發(fā)酵,乙醇發(fā)酵速率明顯低于不添加硼酸的發(fā)酵體系,但異構(gòu)化階段剩余的D-果糖也能在18 h內(nèi)完全發(fā)酵生成乙醇(圖5-b),發(fā)酵前后D-阿洛酮糖的濃度沒有明顯變化,兩種體系的糖醇轉(zhuǎn)化率都在0.4 g/g左右。

本研究中,將硼酸添加到反應(yīng)體系中促進(jìn)了阿洛酮糖的生成。由于D-果糖與硼酸的絡(luò)合能力弱于D-阿洛酮糖與硼酸的絡(luò)合能力,所以反應(yīng)向生成D-阿洛酮糖的方向轉(zhuǎn)移[19],D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到了63%(硼酸根與D-果糖的摩爾比1∶2),而不添加硼酸的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化率僅有33%。添加馬克斯克魯維酵母將剩余果糖用完后,可以將pH調(diào)節(jié)到酸性條件,解除硼酸根與D-阿洛酮糖的絡(luò)合,然后通過結(jié)晶的方法分離出硼酸根,實(shí)現(xiàn)硼酸的重復(fù)利用[22]。因此,兩階段生產(chǎn)D-阿洛酮糖的生產(chǎn)工藝,既可以獲得高濃度和高轉(zhuǎn)化率的D-阿洛酮糖,又可實(shí)現(xiàn)D-果糖的全部利用,降低了D-阿洛酮糖的分離純化難度和成本。

a-無硼酸根；b-添加硼酸根圖5 乙醇、D-果糖和D-阿洛酮糖的濃度隨發(fā)酵 時(shí)間的變化而變化Fig.5 Concentrations of ethanol,D-fructose and D-allulose during fermentation

3 結(jié)論與討論

D-阿洛酮糖因其在食品領(lǐng)域、醫(yī)藥領(lǐng)域特殊的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理功能而受到廣泛關(guān)注。本研究利用不同菌株的全細(xì)胞反應(yīng),將果糖異構(gòu)化階段和發(fā)酵階段分開進(jìn)行,既提高了阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率,又將剩余的D-果糖全部發(fā)酵成乙醇,降低了阿洛酮糖的分離難度。在果糖轉(zhuǎn)化的整個(gè)生產(chǎn)過程中,只需要添加重組大腸桿菌和馬克斯克魯維酵母,不需要添加額外的金屬離子和氮源。若添加適當(dāng)濃度硼酸溶液,則有高達(dá)63%的D-果糖轉(zhuǎn)化成阿洛酮糖。發(fā)酵階段利用馬克斯克魯維酵母將剩余的D-果糖全部發(fā)酵成乙醇,得率為0.4 g/g。本研究可以實(shí)現(xiàn)D-果糖的全利用,得到高濃度的不含D-果糖的高純度D-阿洛酮糖溶液和一定量的乙醇,對(duì)阿洛酮糖的低成本工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。