劉正平 曹 釙 鐘 劍 魏 宇 王世東 史月欣

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院腎病科，北京 100700

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一。研究顯示，2019 年全球約4.63 億成人患糖尿病，預(yù)計(jì)到2045 年將達(dá)到7 億[1]。隨著糖尿病患病率的增加，DN 患病人數(shù)也在逐年上升，并且DN 已經(jīng)成為終末期腎病的主要原因[2]。但目前西醫(yī)尚無(wú)阻止DN 進(jìn)展的特效治療方法。針對(duì)這一現(xiàn)狀，中醫(yī)藥領(lǐng)域進(jìn)行了大量的探索性研究，證實(shí)中醫(yī)藥可以通過(guò)改善腎循環(huán)、減少尿蛋白來(lái)延緩DN 進(jìn)展[3]。中醫(yī)學(xué)中一般將DN 歸為“消癉”“腎消”“水腫”等范疇[3]。DN 的病機(jī)為虛、瘀、濁，而虛為發(fā)病的基本條件。虛證又以氣虛為核心，并見(jiàn)陽(yáng)氣、氣血、氣陰的虧虛，故治療補(bǔ)虛以補(bǔ)氣為首要任務(wù)[4]。黃芪-黨參是臨床上常用的補(bǔ)氣藥對(duì)，黨參偏于陰而補(bǔ)中氣，黃芪偏于陽(yáng)而實(shí)衛(wèi)表之氣，二藥相和，一表一里，一陰一陽(yáng)，相輔相成，共奏補(bǔ)氣扶正之效[5]。臨床研究證實(shí)黃芪-黨參藥對(duì)配伍的復(fù)方治療DN 能明顯降低尿蛋白，具有很好的保護(hù)腎功能的作用[6]，但其治療DN 的作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索該藥對(duì)治療DN 的作用機(jī)制，為后續(xù)臨床治療及實(shí)驗(yàn)研究提供理論基礎(chǔ)和研究思路。

1 資料與方法

1.1 黃芪-黨參有效成分及作用靶點(diǎn)的收集

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)檢索黃芪、黨參的化學(xué)成分，根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，將口服生物利用度≥30%及類藥性≥0.18 作為篩選條件，獲取黃芪、黨參藥物有效成分，并收集相應(yīng)的作用靶點(diǎn)。通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將作用靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為基因靶點(diǎn)。

1.2 藥物有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將基因靶點(diǎn)和有效成分導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1 軟件，構(gòu)建藥物有效成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 DN 相關(guān)靶點(diǎn)的收集

通過(guò)檢索詞“diabeticnephropathy”，分別檢索OMIM、DisGeNET、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)收集相關(guān)靶點(diǎn)，合并去重后得到DN 的疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將基因靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1 平臺(tái)，取交集后將其上傳至STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）及京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）通路富集分析

將交集靶點(diǎn)上傳至Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO及KEGG 通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 有效成分及作用靶點(diǎn)的收集

經(jīng)過(guò)檢索和篩選后共得到黃芪-黨參藥對(duì)有效成分34 個(gè)（表1），獲得基因靶點(diǎn)221 個(gè)。

表1 黃芪-黨參藥對(duì)有效成分信息

2.2 藥物有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape 3.8.1 軟件，構(gòu)建了有257 個(gè)節(jié)點(diǎn)、638 條邊的藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。節(jié)點(diǎn)的度值越大，提示其在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要。由此篩選出黃芪-黨參重要有效成分包括槲皮素、山柰酚、木犀草素等。

圖1 黃芪、黨參有效成分-靶點(diǎn)圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

經(jīng)檢索和篩選獲得1466 個(gè)疾病靶點(diǎn)，與基因靶點(diǎn)取交集獲得100 個(gè)交集靶點(diǎn)。將其上傳至STRING 11.0 平臺(tái)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。采用Cytoscape 軟件計(jì)算PPI 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的度值，取前15 個(gè)作為核心靶點(diǎn)，按度值大小排序依次為AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、TP53、CASP3、MAPK1、JUN、MMP9、MAPK8、PTGS2、EGF、CCL2、CXCL8、EGFR。

圖2 疾病-藥物的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO 及KEGG 分析結(jié)果

GO 分析結(jié)果顯示：交集靶點(diǎn)涉及的生物過(guò)程有凋亡信號(hào)通路、活性氧代謝過(guò)程、細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激等；根據(jù)P 值大小取前20 作圖，見(jiàn)圖3。KEGG 分析結(jié)果顯示：交集靶點(diǎn)涉及的通路主要有AGE-RAGE、IL-17、MAPK、NF-κB、VEGF、JAK-STAT等信號(hào)通路。借助imageGP 在線作圖工具，根據(jù)P 值大小取前20 繪制氣泡圖，見(jiàn)圖4（封三）。

圖3 黃芪-黨參藥對(duì)作用于糖尿病腎病靶點(diǎn)的基因本體分析

圖4 黃芪-黨參藥對(duì)作用于糖尿病腎病靶點(diǎn)的京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)分析（見(jiàn)內(nèi)文第122 頁(yè)）

3 討論

DN 早期病理主要表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)率增加、腎小球系膜區(qū)增寬和腎小球毛細(xì)血管基膜增厚，后期表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)率下降，腎小球、腎小管間質(zhì)纖維化[7]。而DN 的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，目前認(rèn)為與遺傳因素、代謝機(jī)制紊亂、血流動(dòng)力學(xué)改變、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等相關(guān)[7-8]。

本研究篩選出黃芪-黨參藥對(duì)重要的有效成分是槲皮素、山柰酚、木犀草素等。槲皮素、山柰酚、木犀草素均具有抗炎、抗氧化、保護(hù)腎臟的作用[9-11]。研究表明，槲皮素可以通過(guò)激活海馬通路抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖[12]、拮抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β1的活性來(lái)對(duì)抗腎小球基底膜增厚[13]，從而保護(hù)腎功能。山柰酚可以通過(guò)抑制RhoA/Rho 激活[14]、抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，改善腎損傷和纖維化。Zhang 等[15]認(rèn)為木犀草素可以通過(guò)抑制STAT3 通路激活來(lái)抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，從而減少腎纖維化，延緩DN 進(jìn)展。

通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)AKT1、IL-6、TNF等為治療DN 的核心靶點(diǎn)。AKT 可在人體組織中廣泛表達(dá)。石明雋等[16]研究發(fā)現(xiàn)，AKT 可能通過(guò)TGF-β1激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，促使細(xì)胞增殖、分化，加重腎臟肥大和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化。IL-6、TNF是目前研究最廣泛的參與DN 炎癥機(jī)制的細(xì)胞因子[17-19]。IL-6 可以通過(guò)與系膜細(xì)胞受體結(jié)合刺激腎小球系膜增殖，改變腎小球系膜結(jié)構(gòu)[20]；還能通過(guò)激活JAK2/STAT3 通路促使腎臟足突細(xì)胞肥大[21]，多途徑造成DN 的發(fā)生、發(fā)展。張國(guó)艷等[22]認(rèn)為T(mén)NF-α 可以直接誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致腎小球血管壁的改變，從而增加白蛋白的通透性，產(chǎn)生蛋白尿。由PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示的核心靶點(diǎn)涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等方面，直接或間接作用于腎小球系膜細(xì)胞、足突細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及腎小管等部位，從而參與DN 的發(fā)生、發(fā)展。

在KEGG 分析結(jié)果中，黃芪-黨參藥對(duì)治療DN相關(guān)通路主要有AGE-RAGE、IL-17、MAPK、NF-κB、VEGF 等信號(hào)通路。研究顯示，AGEs 與其受體RAGE結(jié)合后，可以通過(guò)增加細(xì)胞因子的釋放和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球肥大、硬化[23]。此外，AGERAGE 信號(hào)通路的激活引起細(xì)胞內(nèi)多種通路的激活，如PI3K/AKT、p38MAPK、VEGF 等信號(hào)通路[24-25]。IL-17 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路均為重要的炎癥信號(hào)通路，能增加TNF-α、IL-6、TGF-β1 等促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而加快DN 的發(fā)生及發(fā)展[26]。由此可以推測(cè)，黃芪-黨參藥對(duì)通過(guò)多條通路抑制腎臟細(xì)胞異常增殖、減輕體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)來(lái)治療DN。

本研究結(jié)果顯示，黃芪-黨參的主要有效成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素等，核心作用靶點(diǎn)以AKT1、IL-6、TNF、VEGFA 等為主，并通過(guò)調(diào)節(jié)AGE-RAGE、IL-17、MAPK、NF-κB、VEGF、JAK-STAT 等信號(hào)通路發(fā)揮治療DN 的作用。