胡 茜 顏海健

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，貴州貴陽(yáng) 550000

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）可致患者殘疾[1-3]。神經(jīng)干細(xì)胞巢中的觸液神經(jīng)元（cerebrospinal fluidcontacting neurons，CSF-CNs）的作用特殊，能通過釋放活性物質(zhì)促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[4-6]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3）是神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)劑[7-9]，但機(jī)制有待探究。本實(shí)驗(yàn)首次研究VEGFR-3 對(duì)CSF-CNs 體外增殖的影響，通過觀察VEGFR-3 對(duì)PI3K/AKT 信號(hào)通路的影響，探討其促進(jìn)脊髓修復(fù)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF 級(jí)C57 新生3 d 健康小鼠10 只，體重1.5～2.5 g，雌雄不限，雅培奶粉（雅培公司，美國(guó)）喂養(yǎng)，貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證SYXK（黔）2018-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證NO.43072621 010022871，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。DMEM 培養(yǎng)基、雷帕霉素、牛血清（武漢漢萬(wàn)科技有限公司），VEGFR-3 質(zhì)粒（上海博達(dá)有限公司），GAPDH、HRP 標(biāo)記二抗、PI3K、VEGFR-3、AKT、p-AKT（上海碧云天生物有限公司，貨號(hào)分別為AF5201、A0208、ab32089、ab182651、ab179463、ab8805）。

1.2 研究方法

1.2.1 CSF-CNs 獲取及鑒定 C57 新生3 d 鼠取頸髓組織獲得CSF-CNs，采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）鑒定CSF-CNs；利用CSFCNs 特異標(biāo)志物PKD2L1 進(jìn)一步驗(yàn)證，計(jì)算純度：CSFCNs 純度=PKD2L1 陽(yáng)性細(xì)胞/DAPI 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)[10]。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.2.2 CSF-CNs 培養(yǎng)及分組處理 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔日用含EDTA 的胰酶消化，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%，用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。取CSF-CNs 分為四組：①正常對(duì)照組，DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；②空載質(zhì)粒對(duì)照組，培養(yǎng)基中加入空載質(zhì)粒；③VEGFR-3 質(zhì)粒組，加入質(zhì)粒轉(zhuǎn)染稀釋液100 μg，Western blot 檢測(cè)正常對(duì)照組、空載質(zhì)粒對(duì)照組和VEGFR-3 質(zhì)粒組的VEG FR-3表達(dá)量，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功[11]，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次；④抑制劑組，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞加入10 μl PI3K/AKT 抑制劑LY294002，培養(yǎng)24 h。

1.2.3 神經(jīng)球數(shù)目、直徑檢測(cè) 各組培養(yǎng)24 h 后，吹打神經(jīng)球形成單細(xì)胞懸液，種植在24 孔板，每組3 個(gè)復(fù)孔。3 d 后，每組選擇4 個(gè)視野檢測(cè)神經(jīng)球個(gè)數(shù)，選擇15 個(gè)神經(jīng)球測(cè)量神經(jīng)球平均直徑，各組重復(fù)測(cè)量5 次。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.2.4 Western blot 檢測(cè) PBS 液洗滌3 次，添加細(xì)胞裂解液。各組取等量蛋白行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。配制小鼠一抗VEGFR-3、PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH 抗體（濃度分別為1∶1000、1∶200、1∶200、1∶200、1∶1000），一抗4℃孵育過夜；洗滌后，山羊抗小鼠IgG 1∶1000 室溫孵育1 h，TBST 液洗滌，壓片、照相，Image Pro Plus 7.0 進(jìn)行圖片分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)5 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSF-CNs 培養(yǎng)及鑒定

流式細(xì)胞分選獲得CSF-CNs，用NSE 進(jìn)行鑒定，見圖1。檢測(cè)標(biāo)志物PKD2L1 抗體，其純度為（90.1±1.1）%，確認(rèn)為CSF-CNs，見圖2（封三）。

圖2 PKD2L1 免疫熒光鑒定CSF-CNs（n=3）（見內(nèi)文第24 頁(yè)）

2.2 轉(zhuǎn)染效果

48 h 的VEGFR-3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率最高，見圖3A。與正常對(duì)照組、空載質(zhì)粒對(duì)照組比較，VEGFR-3 質(zhì)粒組VEGFR-3 表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖3B。

圖3 VEGFR-3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果（n=3）

2.3 VEGFR-3 過表達(dá)促進(jìn)CSF-CNs 增殖

正常對(duì)照組與空載質(zhì)粒對(duì)照組神經(jīng)球計(jì)數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；與空載質(zhì)粒對(duì)照組、抑制劑組比較，VEGFR-3 質(zhì)粒組神經(jīng)球的計(jì)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組神經(jīng)球計(jì)數(shù)比較（，n=3）

表1 各組神經(jīng)球計(jì)數(shù)比較（，n=3）

注：與正常對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與空載質(zhì)粒對(duì)照組比較，bP ＜0.05；與抑制劑組比較，cP ＜0.05。VEGFR-3：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3

2.4 各組PI3K、AKT 及p-AKT 表達(dá)水平比較

正常對(duì)照組與空載質(zhì)粒對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；與空載質(zhì)粒對(duì)照組、抑制劑組比較，VEGFR-3質(zhì)粒組PI3K、AKT及p-AKT表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖4。

圖4 各組PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表達(dá)水平（n=5）

3 討論

SCI 可進(jìn)一步破壞脊髓組織，引起腦脊液變化[12-17]。CSF-CNs 可以與腦脊液、脊髓實(shí)質(zhì)接觸，將脊髓實(shí)質(zhì)和腦脊液有效聯(lián)系在一起，在SCI 修復(fù)中有重要作用[18-20]。

本研究利用C57 新生小鼠分離CSF-CNs，將其培養(yǎng)成神經(jīng)球并觀察其增殖情況，驗(yàn)證了CSF-CNs具有神經(jīng)干細(xì)胞屬性。此外，本研究還進(jìn)一步證實(shí)CSF-CNs 能特異表達(dá)VEGFR-3，并且VEGFR-3 可以通過調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)CSF-CNs 增殖。本研究猜測(cè)CSF-CNs 在AKT 信號(hào)激活后作用于脊髓實(shí)質(zhì)，促進(jìn)脊髓修復(fù)。

VEGFR-3 與特異性配體VEGF-C 結(jié)合可激活多種信號(hào)[21-22]，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[23-25]。其中PI3K/AKT 信號(hào)通路介導(dǎo)絲裂原依賴性生長(zhǎng)和存活，是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路的激活可明顯抑制SCI 引起的細(xì)胞凋亡[26-28]。

綜上所述，在CSF-CNs 中VEGFR-3 可以調(diào)控PI3K/AKT 通路促進(jìn)細(xì)胞增殖，LY294002 能阻斷該通路抑制CSF-CNs 增殖。