孫 凱 陳榮彬 楊英東 李 勇

1.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院骨三科，廣東珠海 519000

絕經(jīng)后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指絕經(jīng)后女性雌激素水平下降導致骨脆性增加的一種代謝性骨病[1]，其患病率在>50 歲女性人群中高達67.30%[2]。該病導致了骨折危險性迅速上升，給個人及社會帶來了嚴重的精神、經(jīng)濟負擔[3]。目前西藥能有效緩解絕經(jīng)后骨量丟失，但長期使用不僅費用昂貴，而且并發(fā)癥多[4]。而中醫(yī)藥治療作為一種經(jīng)濟有效的療法，在治療該病方面前景廣闊[5]。滋陰通絡方是廣東省中醫(yī)藥珠海醫(yī)院用于治療PMOP 的經(jīng)驗方，具有補益肝腎、滋陰活血通絡之效，前期研究證實滋陰通絡方聯(lián)合西藥可有效抑制骨吸收，改善骨代謝[6]，提高骨密度[7]。本研究旨在探討滋陰通絡方對去卵巢骨質疏松大鼠骨代謝及骨密度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級3 月齡雌性SD 大鼠60 只，體重200～230 g，購自南方醫(yī)科大學動物科技發(fā)展有限公司，并在廣東省中醫(yī)院大學城實驗動物中心飼養(yǎng)，生產許可證號：SCXK（粵）2016-0041，使用許可證號：SYXK（粵）2018-0094，合格證號：44002100022874。廣東省中醫(yī)院大學城動物試驗中心倫理委員會審查批號：2019044。

1.1.2 藥物 滋陰通絡方：熟地10 g、麥冬10 g、牛膝10 g、女貞子10 g、當歸10 g、白芍10 g、蜈蚣2 條、桑寄生15 g、黃芪10 g、烏梢蛇10 g、防風10 g、雞血藤15 g、白術10 g、甘草3 g（江陰天江藥業(yè)有限公司生產，顆粒劑）。阿侖膦酸鈉片（海南全星制藥有限公司生產，H20150109）；阿法骨化醇軟膠囊[廣州白云山星野（藥業(yè)）股份有限公司生產，H20100159]。

1.1.3 主要試劑及設備 Ⅰ前膠原氨基端原肽（procollagen ⅠN-terminal propeptide，PⅠNP）檢測試劑盒（H-285）、Ⅰ型膠原氨基末端端肽（N-terminal telopeptide of type Ⅰcollagen，NTX）檢測試劑盒（H368-1）、Ⅰ型膠原C 末端肽（C-telopeptide of type Ⅰcollagen，CTX-Ⅰ）檢測試劑盒（H-287）（均來源于南京建成生物工程研究所）；micro-CT 儀：比利時生產，型號：Bruker skyscan 1172，掃描參數(shù)：電流為88 μA，電壓為80 kV，分辨率為9 μm，單次掃描時間為54 min。

1.2 研究方法

1.2.1 模型制備及干預方法 將50 只大鼠利用隨機數(shù)字表法分為模型組，西藥組，滋陰通絡方低、中、高劑量組，每組10 只。另取10 只大鼠作為假手術組。所有大鼠在3 ml/kg 水合氯醛全身麻醉下進行絕經(jīng)后骨質疏松造模。其中假手術組僅摘除卵巢附近脂肪，保留卵巢，其他組均進行雙側卵巢摘除。術后所有大鼠肌注青霉素+0.9%氯化鈉溶液（4 萬U/ml）抗感染，每天注射1.5 ml，連續(xù)3 d。所有去卵巢大鼠每日進行陰道上皮細胞涂片分析，連續(xù)5 d 觀察到白細胞證明卵巢摘除成功[8]。造模12 周后，六組大鼠均予灌胃操作，灌胃劑量根據(jù)第4 版《藥理實驗方法學》[9]中實驗動物體表面積換算，其中西藥組予阿侖膦酸鈉10.51 mg/kg（1 次/周）和骨化三醇丸0.075 μg/kg（1 次/d）灌胃，滋陰通絡方低、中、高劑量組分別予滋陰通絡方1.34、2.68、4.02 g/kg（1 次/d）進行灌胃，假手術組與模型組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃12 周。

1.2.2 骨密度及骨顯微結構觀察 治療結束后，將大鼠股骨固定于micro-CT 專用掃描墊上，掃描股骨頭至股骨中段，每次掃描的旋轉角度為0.4°，總共旋轉180°掃描，9 μm 為一斷層，拍攝2 張圖像。使用儀器自帶軟件行三維重建，并采用CTan 軟件對選定區(qū)域骨密度（bone mineral density，BMD）和骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量、骨小梁分離度、骨小梁模式因子及結構模型指數(shù)等骨小梁參數(shù)進行分析。

1.2.3 血清骨代謝指標檢測 治療結束后，禁食水，行腹主動脈采血，全血靜置2 h，3000 r/min（離心半徑為8 cm），離心10 min。吸取血清，嚴格按照PⅠNP、NTX 及CTX-Ⅰ檢測試劑盒說明書操作，采用酶聯(lián)免疫吸附法計算血清骨代謝指標PⅠNP、NTX、CTX-Ⅰ含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 滋陰通絡方對各組大鼠BMD 的影響

模型組BMD 低于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。滋陰通絡方各劑量組BMD 均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。滋陰通絡方不同劑量組BMD 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 滋陰通絡方對各組大鼠BMD 的影響（g/cm3，）

表1 滋陰通絡方對各組大鼠BMD 的影響（g/cm3，）

注：與假手術組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。BMD：骨密度

2.2 滋陰通絡方對各組大鼠骨微結構的影響

模型組股骨骨小梁間隙增大，排列稀疏，而西藥組及滋陰通絡方各治療組均可不同程度地改善大鼠股骨骨小梁顯微結構（圖1～2）。模型組骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量低于假手術組，骨小梁分離度、骨小梁模式因子、結構模型指數(shù)高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；滋陰通絡方各劑量組的骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量高于模型組，骨小梁分離度、骨小梁模式因子、結構模型指數(shù)則低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；滋陰通絡方不同劑量組骨小梁參數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 滋陰通絡方對各組大鼠骨小梁參數(shù)的影響（）

表2 滋陰通絡方對各組大鼠骨小梁參數(shù)的影響（）

注：與假手術組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05

圖1 各組大鼠股骨二維結構圖

圖2 各組大鼠股骨三維結構圖

2.3 滋陰通絡方對各組大鼠骨代謝指標的影響

模型組血清CTX-Ⅰ、NTX 高于假手術組，PⅠNP水平低于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；滋陰通絡方各劑量組大鼠血清CTX-Ⅰ、NTX 含量低于模型組，PⅠNP 水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；滋陰通絡方中不同劑量組CTX-Ⅰ、NTX及PⅠNP 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表3。

表3 滋陰通絡方對各組大鼠骨代謝指標的影響（）

表3 滋陰通絡方對各組大鼠骨代謝指標的影響（）

注：與假手術組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。PⅠNP：Ⅰ前膠原氨基端原肽；NTX：Ⅰ型膠原氨基末端端肽；CTX-Ⅰ：Ⅰ型膠原C末端肽

3 討論

女性絕經(jīng)后雌激素水平下降，導致骨吸收大于骨形成，骨代謝失衡，造成骨量丟失，最終誘發(fā)骨質疏松[10]。去卵巢骨質疏松大鼠模型造模技術成熟，是研究PMOP的常用模型[8]。阿侖膦酸鈉可有效抑制骨吸收，阿法骨化醇可促進小腸對鈣的吸收，兩藥聯(lián)用可有效改善骨代謝，提高BMD，改善骨顯微結構[11]，故將其選為陽性對照組。BMD 是PMOP 診斷的金標準[12]，常用評估抗骨質疏松療效，結果顯示，模型組BMD 較假手術組降低，表明造模成功[8]，而服用滋陰通絡方后，去卵巢大鼠骨密度顯著增加，提示滋陰通絡方可增加去卵巢大鼠BMD。但BMD 在評估骨微結構方面具有一定的局限性[13]。而骨微結構與骨折發(fā)生息息相關，是抗骨質疏松治療效果評價中的重要組成部分[14]，micro-CT 可全面、精確、無創(chuàng)了解骨小梁變化[15]。當發(fā)生骨質疏松時，骨小梁間隙增加，網(wǎng)狀結構受到破壞，增加了骨折危險性[16]。本研究結果顯示模型組骨小梁間隙增加，排列稀疏，骨微結構破壞嚴重，而經(jīng)滋陰通絡方灌胃治療后，骨小梁間隙減小，排列更為緊密，骨微結構得到改善。而滋陰通絡方各劑量組骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度等骨小梁參數(shù)較模型組增加，骨小梁分離度、骨小梁模式因子、結構模型指數(shù)較模型組下降（P ＜0.05），提示不同劑量滋陰通絡方可增加去卵巢骨質疏松大鼠骨小梁數(shù)量，提高骨小梁厚度，減小骨小梁分離程度，進而改善骨顯微結構。

NTX 與CTX-Ⅰ是Ⅰ型膠原的降解產物，是評價骨吸收的敏感標志物，PⅠNP 可反應Ⅰ型膠原蛋白合成水平，是評價骨形成的標志物[17]，因而臨床將這三種指標作為評估骨代謝的常用標志物[18]。研究結果顯示，切除卵巢后，大鼠PⅠNP 下降，NTX 與CTX-Ⅰ含量上升，而服用滋陰通絡方后，去卵巢大鼠血清PⅠNP水平上升，NTX 與CTX-Ⅰ含量降低，提示滋陰通絡方可有效促進骨形成，抑制骨吸收，改善骨代謝。

中醫(yī)認為PMOP 多以肝腎虧虛所致，因而臨床常以補益肝腎法治療PMOP[19]。滋陰通絡方中熟地、女貞子共為君藥，可滋補肝腎，益精填髓。桑寄生、麥冬、牛膝、白芍、當歸、烏梢蛇、雞血藤、蜈蚣滋陰補腎，填精壯骨，活血通絡，共為臣藥。佐以黃芪、白術、防風，增強脾胃吸收能力，以防君臣之藥滋補太過。甘草為使藥，調和諸藥。諸藥相合，共奏補益肝腎，滋陰活血通絡之功?，F(xiàn)代藥理學研究證明[20]，補益肝腎中草藥可通過多種途徑來影響骨代謝。而滋陰通絡方中含有的熟地[21]、女貞子[22]、牛膝[23]等補益肝腎類中藥，可能對骨代謝起到調節(jié)作用。

PMOP 的發(fā)生是多因素、多環(huán)節(jié)、多靶點共同作用的結果[24]，而中藥治療PMOP 具有“多組分、多途徑”的優(yōu)勢[25]。本實驗結果初步顯示了滋陰通絡方能夠通過促進骨形成、抑制骨吸收，從而提高去卵巢大鼠骨密度并改善骨組織微結構，達到防治骨質疏松癥的作用。