韓 穎,馬建鵬,張 靜,梁 晨,楊 斌,趙 寧,

(1.西南林業(yè)大學 生命科學學院,昆明 650224;2.大理白族自治州林業(yè)和草原有害生物防治檢疫局,云南大理 671000;3.西南林業(yè)大學 云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室,昆明 650224)

核桃是云南省大力發(fā)展的林業(yè)產(chǎn)業(yè)之一,種植規(guī)模、產(chǎn)量、產(chǎn)值均居全國首位,是林農(nóng)的致富樹,搖錢樹,為山區(qū)林農(nóng)的脫貧致富奠定了基礎(chǔ)。但是由于云南核桃種植樹種單一,管理不當,導致病蟲害頻繁發(fā)生,其中核桃叢枝病的危害較為嚴重,給種植區(qū)造成嚴重的經(jīng)濟損失。

叢枝病(witche’s broom),又稱鳥巢病,感病植株表現(xiàn)為生理紊亂、內(nèi)源激素平衡失調(diào),性狀叢枝、葉片卷曲變小、腋芽萌生、巨芽、花果畸形等[1-3]。近年來,國內(nèi)學者對各種叢枝病的病原鑒定[4-6]、發(fā)生規(guī)律、傳播途徑、防治[7-10]等進行了深入的研究。但對叢枝病植株的內(nèi)源激素含量變化的研究相對較少,對云南核桃叢枝病的研究更是未見報道。

植物感染叢枝病后體內(nèi)物質(zhì)發(fā)生明顯變化,內(nèi)源激素含量失調(diào),致使植株表現(xiàn)出病害癥狀。相關(guān)研究表明,細胞分裂素類與生長素類比值(C/A值)的變化是植原體引起泡桐等寄主表現(xiàn)叢枝病狀的生理學基礎(chǔ)[11-14]。何放亭等[13]通過研究C/A值與甘薯叢枝病癥狀的關(guān)系時發(fā)現(xiàn),癥狀的發(fā)生與細胞分裂素含量異常增高有關(guān);陳子文等[15]研究發(fā)現(xiàn)造成棗叢枝病癥狀的原因是由于病株內(nèi)源細胞分裂素異常增高和生長素含量下降所導致的;萬瓊蓮等[16]測定山黃麻叢枝病感病植株內(nèi)源激素含量發(fā)現(xiàn)內(nèi)源激素含量平衡失調(diào)。植物感染叢枝病后,觸發(fā)了植株的生理反應(yīng),加快了植株叢枝病癥狀的表型,這種生理變化是病原、內(nèi)源激素及環(huán)境因子間共同作用的結(jié)果。不同激素通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用于植物生長發(fā)育,弄清內(nèi)源激素的變化規(guī)律有助于闡述病原與寄主植物的互作關(guān)系。本研究通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法定量檢測云南核桃叢枝病植株內(nèi)源激素含量的變化,弄清感染叢枝病后寄主葉片內(nèi)源激素含量的變化,為云南核桃叢枝病的致病機理、發(fā)生規(guī)律及防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集地

樣品采自云南3個核桃主產(chǎn)區(qū),分別為楚雄大姚縣梁家山核桃基地(N25°44′47″,E101°20′16″)、大理漾濞縣馬場核桃基地(N25°39′36″,E100°00′59″)、臨滄鳳慶縣三岔河核桃基地(N24°26′13″,E99°55′22.2″)的核桃葉片,樹齡均為5齡。

1.2 樣品采集方法

每個調(diào)查點采取5點法調(diào)查取樣,每樣點隨機選取20棵核桃樹調(diào)查發(fā)病情況,共100棵,并對感病植株進行采樣[17]。采樣時,挑同一部位及同一方向的葉片進行采集。楚雄樣點共有17株核桃感病,大理10株,臨滄6株,每樣樹設(shè)3個重復(fù)采樣,同時在每個基地分別采集健康樣品3份。液氮冷凍保存帶回實驗室。

1.3 內(nèi)源激素的測定

采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法進行內(nèi)源激素含量的測定,測定激素包括脫落酸(ABA)、生長素類激素(IAA、ME-IAA、ICAId、ICA、IBA、IPA)、細 胞 分 裂 素 類CTK(cZ、t Z、tZR、IP、IPR、DZ、DHZ7G)和 赤 霉 素 類(GA1、GA3、GA4、GA7、GA9、GA15、GA19、GA20、GA24、GA53)。

1.3.1 樣本前處理 (1)取液氮保存的感病與健康樣品,用研磨儀研磨(30 Hz,1 min)至粉末狀;(2)稱取50 mg研磨后的樣品,加入內(nèi)標,用1 m LV(甲醇)∶V(水)∶V(甲酸)=15∶4∶1,進行提取;(3)提取液濃縮后用100μL 80%甲醇/水溶液復(fù)溶,過0.22μm濾膜,置于進樣瓶中,用于LC-MS/MS分析。

1.3.2 色譜質(zhì)譜采集條件 (1)色譜柱:Waters-ACQUITYUPLCHSST3C18柱(1.8μm,100 mm×2.1 mm);(2)流動相:A相,超純水(加入0.04%的乙酸);B相,乙腈(加入0.04%的乙酸);(3)梯度洗脫程序:0 min A/B為95∶5(V/V),1.0 min A/B為95∶5(V/V),8.0 min為5∶95(V/V),9.0 min為5∶95(V/V),9.1 min為95∶5(V/V),12.0 min為95∶5(V/V);流速0.35 m L/min;柱溫40℃;進樣量2μL。

1.3.3 定性與定量測定 基于植物標準品構(gòu)建MWDB(Metware Database)植物激素數(shù)據(jù)庫,對質(zhì)譜檢測的數(shù)據(jù)進行定性分析。利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式進行定量分析。獲得不同樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后,對所有目標物的色譜峰進行積分,通過內(nèi)標法進行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫落酸的含量變化

脫落酸(ABA)在植物的生長發(fā)育中起抑制作用,與促進類激素作用拮抗,促進植物器官的脫落、休眠及氣孔關(guān)閉。研究表明,植物受到逆境脅迫時ABA含量會提高,以增強植物的抗逆性[18]。表1結(jié)果顯示,ABA的含量在3個樣地的感病葉中明顯升高,且較健康葉分別升高1.21、1.23和1.18倍。同一樣地的健康葉和感病葉的ABA含量存在顯著差異,其中種植基地大理的差異最大,感病株葉片中的ABA含量比健康株葉片中的含量高189.43 ng/g,差異最小的樣品是臨滄,感病株葉片中的ABA含量比健康株葉片中的含量高148.41 ng/g。

表1 不同種植基地核桃叢枝病內(nèi)源激素脫落酸含量變化Table1 Changes of the endogenous hormone abscisic acid content of walnut witches’broom disease in different planting bases ng/g

2.2 生長素類激素含量變化

生長素(IAA)是植物生長的主要調(diào)節(jié)因子,能調(diào)節(jié)植物細胞的分裂、伸長和分化。表2為生長素類激素及衍生物的含量,除楚雄樣品的健康葉和感病葉中的ME-IAA含量及臨滄的ICAld含量無明顯差異(P＞0.05),其余樣品中的健康葉和感病葉內(nèi)的IAA、ME-IAA和ICAld的含量均存在顯著差異,且感病葉片中的含量顯著低于健康葉片(P＜0.05)。在同一樣品中IAA的含量顯著高于ME-IAA,是ME-IAA含量的10倍左右,與ICAld的含量沒有差異性。IAA含量最高的是大理的健康葉,含量為10.02 ng/g,比感病葉片的含量高89.41%。

表2 不同種植基地核桃叢枝病內(nèi)源激素生長素類含量變化Table2 Changes of endogenous hormone auxin content in different planting bases of walnut witches’broom disease ng/g

2.3 細胞分裂素類激素含量變化

細胞分裂素(CTK)是一類能促進細胞分裂、分化、促進種子和芽的萌發(fā)、解除植物頂端優(yōu)勢的植物激素,較高含量能導致植株腋芽萌發(fā),生長分化,形成叢枝[19]。表3結(jié)果顯示,7種細胞分裂素中cZ、tZ、IP、DHZ7G在感病葉中明顯升高,其中含量最高的是DHZ7G,楚雄感病葉片中的含量比健康葉片的含量高65.85%;含量最低的是cZ,臨滄感病葉片中的含量比健康葉片的含量高166.67%。另外,3種細胞分裂素tZR、IPR、DZ的含量感病葉片中明顯降低(P＜0.05),其中tZR的含量在大理感病葉片內(nèi)比健康葉片中降低22.75%。同一種植地的健康葉和感病葉中除tZ和IP外,其余激素均存在顯著性差異,不同激素在同一種植地的健康葉或感病葉中存在顯著性差異,且tZR的含量最高,顯著高于其他激素的含量(P＜0.05)。表4中感病葉C/A值均高與健康葉,趙錦等[3]的研究表明植原體侵染導致細胞分裂素含量的增加,致使植物產(chǎn)生叢枝病癥狀。

表3 不同種植基地核桃叢枝病內(nèi)源激素細胞分裂素類含量變化Table3 Changes of endogenous hormones and cytokinins in walnut witches’broom disease in different planting bases ng/g

表4 健康葉與感病葉C/A比值變化Table4 Changes in C/A ratio between healthy and diseased plants

2.4 赤霉素類激素含量變化

赤霉素(GA)能促進細胞的伸長生長,還能打破植物的休眠,促進發(fā)芽和花的形成。通過LCMS/MS共檢測出4種赤霉素(表5),3個樣地的健康葉片中均未檢出GA7,GA3在3個樣地的感病葉片和健康葉片中含量無差異(P＞0.05),GA15在3個樣地的感病葉片高于健康葉片,除大理外,另外兩地存在顯著差異,GA24在3個樣地的感病葉片中含量低于健康葉片,差異顯著(P＜0.05),在大理的健康葉片中檢出量最高為8.13 ng/g,比感病葉片高124.59%。

表5 不同種植基地核桃叢枝病內(nèi)源激素赤霉素類含量變化Table5 Changes of gibberellins content of endogenous hormones of walnut witches’broom disease in different planting bases ng/g

2.5 核桃叢枝病植物內(nèi)源激素相關(guān)性分析

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(表6),ABA與IAA及其衍生物、tZR、DZ和GA24呈顯著負相關(guān),與cZ、IP和DHZ7G呈顯著的正相關(guān)性,表明ABA抑制生長素類激素和赤霉素的合成。ABA是抑制型激素,對生長促進型激素有拮抗作用[20]。生長素和CTK通過調(diào)節(jié)細胞周期組分來協(xié)同調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育,且對GA的合成有促進作用,各自呈正向調(diào)節(jié)。云南核桃感染叢枝病后,葉片內(nèi)的脫落酸和細胞分裂素含量顯著升高,而生長素和赤霉素含量顯著下降,激素的失調(diào)致使植株不能正常生長,出現(xiàn)典型的叢枝病癥狀。

表6 不同種植基地核桃叢枝病內(nèi)源激素含量相關(guān)性分析Table6 Correlation analysis of endogenous hormones in walnut witches’broom disease

3 討論

本研究3個樣地的核桃品種不同,楚雄是三臺核桃,大理和臨滄的是大泡核桃,研究結(jié)果表明,核桃叢枝病感病植株與健康植株相比內(nèi)源激素發(fā)生了明顯變化,而且不同樣地、不同產(chǎn)品間均表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律。相關(guān)文獻報道,叢枝病癥狀的發(fā)生可能與細胞分裂素和生長素失調(diào)有關(guān)[13],感病植株的葉片內(nèi)細胞分裂素和生長素出現(xiàn)紊亂、失調(diào)的現(xiàn)象,因此叢枝的癥狀與內(nèi)源激素含量水平關(guān)系密切。

ABA能抑制植物生長,在植物受到病害等脅迫時,體內(nèi)ABA含量增高,使植物在生理生化等方面發(fā)生變化。本研究ABA的含量在感病葉中顯著高于健康葉,因此ABA的積累可能促使植株出現(xiàn)黃化、小葉、矮化等,表現(xiàn)出叢枝癥狀。杜紹華等[12]用組培苗研究棗樹感染棗叢枝病后內(nèi)源激素含量變化發(fā)現(xiàn),感病植株內(nèi)源IAA降低,GA含量升高;馮志敏等[21]對泡桐叢枝病的研究表明,植物體受逆境損傷后內(nèi)源激素比例失衡而引起組織、器官等分化異常,這與本研究的結(jié)果是相一致的。生長素含量降低,可能是健康核桃感病后使體內(nèi)的IAA氧化酶活性增高導致的,也可能是激素與氨基酸及糖等交聯(lián)作用降低了激素活性,或是過氧化氫酶的活性受到抑制降低了植物IAA的生物合成[22-24],導致核桃枝節(jié)間縮短,側(cè)芽萌發(fā)生長,出現(xiàn)典型叢枝癥狀。感病植株的CTK含量顯著高于健康植株,較高含量的CTK可能促使腋芽大量萌發(fā)、生長和分化,從而形成叢枝[25]。何放亭等[13]對甘薯叢枝病病株內(nèi)源激素含量進行分析,發(fā)現(xiàn)與健康株相比,病株的細胞分裂素一直處于較高水平,使C/A比值升高;趙錦等[3]測定棗叢枝病不同患病程度葉片中內(nèi)源激素結(jié)果表明,患病程度越重,細胞分裂素越高,C/A比值越高。本研究測試核桃葉片也發(fā)現(xiàn),感病植株的CTK含量也顯著高于健康植株,C/A值均高于健康葉。CTK含量的增加可能有利于腋芽的大量萌發(fā),側(cè)芽的生長,引起叢枝病或增值癥狀[21]。

大量的文獻證明,植物感染叢枝病后內(nèi)源激素含量會發(fā)生顯著的變化,本研究的結(jié)果也證實了這一點。本研究結(jié)果表明,云南核桃感染叢枝病后代謝失調(diào),內(nèi)源激素含量發(fā)生顯著變化,導致叢枝表型,可為云南核桃叢枝病的研究和防治提供理論依據(jù)。