劉奕， 肖力， 曹佩琳， 李雪*

(1. 電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院∥四川省人民醫(yī)院 口腔科， 四川 成都 610072；2.加拿大英屬哥倫比亞大學(xué) 牙學(xué)院 口腔生物醫(yī)學(xué)科學(xué)系，加拿大 溫哥華BC V6T1Z3)

口腔潛在惡性病變(oral potentially malignant disorders，OPMDs)是一類被歸為具有癌變潛能，發(fā)生在口腔黏膜的疾病總稱[1]，具體包括：口腔白斑(oral leukoplakia, OLK)、口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)、口腔黏膜下纖維化(oral submucous fibrosis, OSMF)、口腔紅斑(oral erythroplakia)、尼古丁口炎(nicotine stomatitis)、吸煙相關(guān)的口腔黏膜角化(tobaccopouch keratosis)等[1].其中大約有5%～18%的OPMDs可轉(zhuǎn)變?yōu)榭谇击[狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinomas，OSCCs)，且若伴有中重度異常增生，病變癌變的可能性更高[2].雖然OPMDs演變?yōu)镺SCC的確切機(jī)制尚不明確，但目前有一個相對一致的認(rèn)識：它的發(fā)生和發(fā)展是一個多階段、多步驟、多種因素變化的復(fù)雜病理過程，且臨床尚無有效的預(yù)防和阻斷方法.因此，OPMDs的早期評估和診斷，持續(xù)監(jiān)測與及時干預(yù)對于降低口腔黏膜上皮癌變的發(fā)病率有重要的臨床意義.

目前診斷OPMDs的金標(biāo)準(zhǔn)仍是活檢，在沒有分子標(biāo)記使臨床醫(yī)生能夠區(qū)分病變是否可能進(jìn)展的情況下，上皮異常增生的程度仍然是口腔潛在病變進(jìn)展的最佳指南，上皮發(fā)育不良被認(rèn)為更有可能在以后發(fā)展為癌癥[3-4].基于組織學(xué)層面分析，在OPMDs向OSCCs發(fā)展的期間，往往將上皮細(xì)胞異常增生視為高風(fēng)險影響因素，但某些OPMDs，諸如OLP，其組織學(xué)分析檢查結(jié)果雖然顯示常未合并上皮異常增生現(xiàn)象，但OLP仍具有惡變潛能，其癌變率為1%～5.3%[5-6].目前對這些上皮異常增生的組織學(xué)表現(xiàn)評價還缺乏客觀指標(biāo)，故迫切需要尋找有效的生物學(xué)標(biāo)記物來評判OPMDs患者的惡變潛能和風(fēng)險度，從而對OPMDs進(jìn)行預(yù)后判斷及對口腔癌的發(fā)生進(jìn)行風(fēng)險評估[7].

由腫瘤間質(zhì)及各類鄰近組織細(xì)胞、免疫分子、多種免疫細(xì)胞、微血管構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境，是腫瘤細(xì)胞生活的獨(dú)特環(huán)境[6-8].本課題組分析，當(dāng)OPMDs中異常增生細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變時，免疫系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子可能會感受到這一變化，并對細(xì)胞這一轉(zhuǎn)變做出反應(yīng).在本研究中，課題組采用回顧性分析法從組織學(xué)角度著手分析在口腔黏膜不同狀態(tài)，以及在OPMDs的各階段時，CD8、Foxp3以及CD1a的表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析免疫細(xì)胞在口腔潛在惡性病變中上皮異常增生的不同發(fā)展階段時的變化情況，OPMDs階段相同時各免疫細(xì)胞間的相互關(guān)系，以及各變化與主要臨床因素之間的相互關(guān)系，分析免疫細(xì)胞在口腔黏膜癌變期間的表達(dá)與其臨床價值，為OPMDs與OSCC的預(yù)防和早期治療研究給予有關(guān)的理論指導(dǎo).

1 資料和方法

1.1 病例收集

本研究所選用的甲醛固定石蠟包埋(formalinfixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)活檢標(biāo)本來自于加拿大溫哥華總醫(yī)院病理科數(shù)據(jù)庫(1996-2015)，共計(jì)57例OPMDs患者(女27名，男35名)的62例標(biāo)本.所有選定的患者在最初診斷后均至少有5年的觀察期，標(biāo)本均嚴(yán)格遵循病例納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，患者其他部位無腫瘤病史[4].本研究的審批機(jī)構(gòu)為加拿大UBC倫理委員會(H17-02031)、四川省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會[編號：倫審(研)2017年第178號].

1.2 主要試劑與儀器

一抗Foxp3 (236A/E7)購自英國Abcam公司，一抗CD8 (C8/144B)和CD1a(010)和二抗均購自丹麥DAKO公司，Pannoramic MIDI切片掃描儀和Panoramicviewer分析軟件均購自匈牙利3D Histech公司，顯微鏡(BH2-RFCA型)購自日本Olympus公司.

1.3 研究方法

1.3.1 樣本制備和染色分析

借助組織微陣列技術(shù)(tissue microarray，TMA)制備OPMDs的FFPE樣本(圖1)，固定好石蠟塊后，用直徑為2 mm的中空細(xì)針在石蠟塊所選主要病變區(qū)域打孔，將細(xì)針切取下來的實(shí)驗(yàn)樣本轉(zhuǎn)移到新的石蠟塊上按一定順序排成陣列，再對TMA石蠟塊行切片處理，所得切片控制為4 μm的厚度，且各蠟塊標(biāo)本皆切取4張切片，通過常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色方法進(jìn)行染色分析，病變發(fā)展區(qū)域的選擇及病理檢查診斷的結(jié)果均由兩名高年資病理科醫(yī)生來確認(rèn)完成，實(shí)驗(yàn)分組結(jié)果如下：上皮組織增生17例為上皮增生組，OLP 21例為OLP組，輕度上皮異常增生(mild epithelial dysplasia)15例為D1組，中度上皮異常增生(moderate epithelial dysplasia)9例為D2組[4].

1.3.2 研究病例臨床資料分組

研究病例的病理分型依據(jù)染色分析結(jié)果進(jìn)行分組，臨床資料按年齡、性別、病變部位、飲酒史、吸煙史、病理分型進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)，分組情況詳見表1.

表1 研究病例臨床資料Table 1 Clinical pathological information of study cases

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測CD8、Foxp3和CD1a的表達(dá)情況

對TMA石蠟切片進(jìn)行脫蠟后水合處理(二甲苯2×15 min, 100%乙醇25 min, 95%乙醇×5 min，85%乙醇×5 min，85%乙醇×5 min，75%乙醇×5 min，蒸餾水洗×5 min)，切片置于裝滿枸櫞酸鈉抗原修復(fù)緩沖液(pH=9.0)中，100 ℃水浴20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，再放入0.5%過氧化氫溶液中作用5 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，10%山羊血清封閉切片10 min，滴加一抗抗體(不同抗體按不同比例稀釋，實(shí)驗(yàn)條件詳見表2)孵育，之后在室溫中對HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的二抗實(shí)施孵育處理，計(jì)時40 min.玻片置于pH為7.4的PBS(磷酸鹽緩沖液)中，搖床上晃動洗滌脫色3次，每次5 min.每張切片上皆滴加即時制備的DAB顯色液(0.04%)，借助光學(xué)顯微鏡管理組織顯色，若顯示棕黃色，即為陽性，自來水沖洗切片終止顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片.此項(xiàng)研究的陽性對照為正常的扁桃體組織染色，PBS取代一抗當(dāng)作研究中的陰性對照.Pannoramic MIDI切片掃描儀對免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry，IHC)切片進(jìn)行掃描分析，Panoramic viewer軟件進(jìn)行分析[4].

IHC染色結(jié)果的判讀方法：定位區(qū)域出現(xiàn)的棕黃色或黃色顆粒被判定為陽性細(xì)胞，不著色則被評判為陰性細(xì)胞.同時在顯微鏡(BH2-RFCA型)下觀察上皮內(nèi)及上皮下固有層2個區(qū)域[4].采用雙評分半定量積分法對IHC染色結(jié)果進(jìn)行評分：即根據(jù)染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占比例計(jì)分判斷.借助高倍鏡(×400)，隨機(jī)確定5個視野，各視野細(xì)胞量≥100個，基于染色強(qiáng)度計(jì)分：若未見染色，為0分；若顯示淡黃色，為1分；若顯示棕黃色，為2分；若顯示深棕色，為3分，若評分>0，那么判定染色陽性；按陽性染色細(xì)胞比例的平均值分為4個等級：0分-陽性細(xì)胞≤10%，1分-11%～30%，2分-31%～60%，3分-陽性細(xì)胞≥60%[4].結(jié)果評定由2名高年資的病理科醫(yī)師在獨(dú)立條件下進(jìn)行.

表2 抗體的基本信息和實(shí)驗(yàn)條件

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多樣本組間比較采用單因素方差分析，兩組樣本間檢測則采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

請論文通信作者或第一作者在《南方能源建設(shè)》、《廣東電力》、《浙江電力》、《內(nèi)蒙古電力技術(shù)》網(wǎng)站或郵箱(如下)注冊和投稿，投稿時選擇“綜合能源系統(tǒng)規(guī)劃與運(yùn)行”欄目或備注。作為專題稿件，各刊會加速審稿，縮短周期；不收取任何版面費(fèi)和審稿費(fèi)，發(fā)表后根據(jù)文章質(zhì)量以及基金支持情況支付較高稿費(fèi)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果和IHC染色結(jié)果分析

圖2為OPMDs各組的HE和IHC染色結(jié)果，HE染色結(jié)果中可清楚地見到OLP組織的固有層中密集的淋巴細(xì)胞浸潤帶.基于細(xì)胞染色分值和染色陽性率來統(tǒng)計(jì)分析CD8、Foxp3和 CD1a的IHC染色結(jié)果，分別對各細(xì)胞在OPMDs不同階段中的陽性染色率進(jìn)行組間比較，具體結(jié)果詳見表3.

圖2 CD8、Foxp3和CD1a在各病理組織中的染色圖片(×200)

表3 CD8、Foxp3和CD1a在OPMDs組織間的表達(dá)Table 3 Expression of CD8, Foxp3 and CD1a in different pathological tissues of OPMDs

(1)CD8 CD8在OPMDs各組中的IHC染色分析結(jié)果顯示：CD8+染色定位在細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞顯示較深染色，絕大部分陽性染色處于上皮下固有層內(nèi)，在D2組與OLP組內(nèi)表達(dá)量升高，細(xì)胞染色陽性率表現(xiàn)出顯著不同(P=0.007 6<0.05)；在上皮內(nèi)僅有OLP組和D2組中低表達(dá)CD8，細(xì)胞染色陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.056 0>0.05).

(2)Foxp3 Foxp3染色陽性細(xì)胞呈圓形，散在于淋巴細(xì)胞中，表達(dá)主要集中在上皮下固有層內(nèi)，上皮增生組、OLP組、D1組及D2組的Foxp3陽性染色率分別為17.65%、61.90%、13.33%、77.78%，其中，上皮增生組與D1組內(nèi)顯示Foxp3弱陽性表達(dá)，但在OLP組與D2組內(nèi)表達(dá)量升高，表現(xiàn)出顯著區(qū)別(P=0.000 5<0.05).

(3)CD1a CD1a染色陽性細(xì)胞主要集中上皮內(nèi)，僅少量表達(dá)于在上皮下，不規(guī)則的細(xì)胞形態(tài)呈長短不一的樹枝狀突起.在上皮內(nèi)，上皮增生組和D2組中CD1a的表達(dá)呈強(qiáng)陽性，且染色陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023 5<0.05)；而在上皮下固有層內(nèi)，CD1a在D2組中表達(dá)增強(qiáng)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.281 3>0.05).

經(jīng)過分析可知：從OPMDs的輕度上皮異常增生發(fā)展到中度上皮異常增生的階段，CD8和CD1a在上皮內(nèi)的染色陽性率均增加，但在上皮下組織內(nèi)，所有免疫細(xì)胞(CD8、Foxp3和CD1a)的陽性表達(dá)率均出現(xiàn)不同程度的上升.另外，OLP組雖然上皮異常增生率低，但在上皮下組織中，相較上皮增生組和D1組，所有免疫細(xì)胞(CD8、Foxp3和CD1a)在OLP組中的染色陽性率均明顯增高，和在D2組中的表達(dá)趨勢一致.

2.2 免疫細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)與臨床資料的關(guān)系

同樣，依據(jù)CD8、Foxp3和CD1a在上皮內(nèi)和上皮下的染色分值和染色陽性率結(jié)果，對其陽性表達(dá)水平與不同臨床資料的組間分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CD8陽性表達(dá)與主要臨床因素(年齡、性別、部位、吸煙飲酒史)均無相關(guān)性(P>0.05，表4)；Foxp3陽性表達(dá)和性別因素存在相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039 7<0.05，表5)；定位于上皮內(nèi)的CD1a陽性表達(dá)與病變部位相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008 4<0.01，表6).

表4 CD8表達(dá)與OPMDs患者臨床資料的關(guān)系Table 4 Comparison of CD8 expression in the patients with OPMDs of different demographic and clinical characteristics

表5 Foxp3表達(dá)與OPMDs患者臨床資料的關(guān)系

3 討論

OSCCs是人類頭頸部最常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率，并且5年生存率很低，每年全球有50萬新發(fā)病例，中國是OSCCs高發(fā)國家之一[9-10].OPMDs是發(fā)生在口腔黏膜、具有癌變潛能的疾病總稱，其組織學(xué)表現(xiàn)譜內(nèi)最末端是原位癌，只是此類癌細(xì)胞被局限于基底膜，沒有出現(xiàn)侵犯，但實(shí)際上已出現(xiàn)了癌變.所以，對于原位癌需考慮如下問題：上皮異常增生組織癌變究竟開始于何時[11]？目前，針對這方面的研究存在一定的困難，因此，在缺乏特異性分子標(biāo)記物的情況下，研究上皮異常增生的變化對研究OPMDs的進(jìn)展具有重要的指導(dǎo)作用.常見的口腔黏膜疾病OLP也歸屬于OPMDs范疇，研究者發(fā)現(xiàn)OLP是研究慢性炎癥和癌癥之間的關(guān)系的一種良好模型，且到目前為止，尚無預(yù)防OLP惡變的方法[12-13].因此，如果可挖掘出更為可靠、靈敏的新型生物標(biāo)志物，借助分子生物學(xué)檢查為及時評估OPMDs惡變潛能開辟新路徑，初期實(shí)施OPMDs的形成與惡性轉(zhuǎn)化測定，在臨床中會極大有助于降低OPMDs的癌變率與OSCCs的發(fā)病率[6].

加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)牙學(xué)院Dr. Poh Catherine實(shí)驗(yàn)室提供的OPMDs和OSCCs的冷凍和存檔手術(shù)樣本包含了疾病從正常到上皮異常增生再到癌變的多個階段的變化，利于分析口腔上皮細(xì)胞及其在腫瘤進(jìn)展過程中的免疫微環(huán)境的空間(腫瘤內(nèi)位置)和時間(從癌變前到癌變)的動態(tài)變化.由于這項(xiàng)研究的樣本量有限，課題組仍在繼續(xù)收集OPMDs和OSCCs標(biāo)本并對研究病例進(jìn)行隨訪，以進(jìn)一步確認(rèn)免疫生物標(biāo)志物在OPMDs和OSCCs進(jìn)展中的診斷和預(yù)后作用.由于實(shí)驗(yàn)中所使用的石蠟標(biāo)本保存時間長達(dá)二十年之久，樣本組織小，獲取困難，故課題組使用了傳統(tǒng)的免疫組化單染技術(shù)，免疫組化單染法靈敏性和染色結(jié)果較強(qiáng)，結(jié)果判讀容易.近些年來免疫組化雙染技術(shù)被逐漸推廣，染色結(jié)果背景清晰且色彩對比鮮明，良好的雙染結(jié)果有利于病理醫(yī)師對腫瘤組織學(xué)結(jié)構(gòu)的判讀，進(jìn)行對比性、相關(guān)性觀察，從而得到更加客觀和準(zhǔn)確的診斷結(jié)果.因此在后續(xù)的研究中，課題組擬采用雙重和多重標(biāo)記免疫組化染色技術(shù)對免疫細(xì)胞在OPMDs和OSCCs組織中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行進(jìn)一步的研究，現(xiàn)今課題組經(jīng)由預(yù)實(shí)驗(yàn)持續(xù)總結(jié)經(jīng)驗(yàn)、完善與改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，從而充分保障IHC雙染以及多重染色的質(zhì)量[14].

在CD4+T細(xì)胞中，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有重要作用，能夠預(yù)防自身免疫性疾病，抑制機(jī)體過度的免疫反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)病變[18-20].現(xiàn)今認(rèn)為，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠經(jīng)由T細(xì)胞間的互作、生成抑制性細(xì)胞因子、抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)修飾、細(xì)胞間的直接接觸等釋放免疫抑制作用[21].大部分研究證實(shí)，產(chǎn)生的細(xì)胞因子促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)-β與白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-10是其釋放效能的主要途徑[22].Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞除了參與腫瘤免疫外，亦可發(fā)揮腫瘤抑制基因的功能[23-24].本研究通過免疫組化檢測口腔潛在惡性病變組織中Fox3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Foxp3陽性細(xì)胞分散于淋巴細(xì)胞中，其表達(dá)主要集中在上皮下固有層內(nèi)，F(xiàn)oxp3基本不在上皮內(nèi)表達(dá).Foxp3在OLP組和D2組中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，即說明隨著上皮異常增生程度越高，F(xiàn)oxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)增加.本研究的發(fā)現(xiàn)表明Foxp3的陽性表達(dá)增加發(fā)生在OLP組和D2組，正如CD8的陽性表達(dá)趨勢，本課題組推測Tregs可能抑制由細(xì)胞因子(例如IL-6)產(chǎn)生的炎癥的促腫瘤作用，但是，它們可能相反地抑制局部病變中CD8+的過度浸潤，以保持CD8+和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間的平衡.IL-10主要發(fā)生在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制固有免疫系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞的過程中，其主要作用就是抑制APC功能[25].通過相關(guān)技術(shù)去除TGF-β、IL-10后將能使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制活性得到一定提升[26].本課題現(xiàn)今只經(jīng)由IHC測定Fox3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)，存在一定的局限性，后續(xù)研究將分析不同病人外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的比例，進(jìn)一步確定CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在作為評估口腔粘膜組織惡性轉(zhuǎn)化潛能的指標(biāo)的可行性.此外，已有研究證實(shí)，在維持外周細(xì)胞CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖與免疫抑制活性方面，IL-2起著關(guān)鍵作用，作為IL-2的受體，IL-2受體α鏈(IL-2Rα)，也有“CD25分子”，經(jīng)由IL-2/IL-2R轉(zhuǎn)導(dǎo)信號極大有助于Treg細(xì)胞生長發(fā)育[27].

DCs對腫瘤抗原具準(zhǔn)確識別能力，同時向免疫細(xì)胞傳遞信息，其抗腫瘤免疫反應(yīng)的核心機(jī)制是DCs產(chǎn)生以CD8+T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，這也是DCs作為免疫治療手段的基礎(chǔ).DCs與T細(xì)胞對細(xì)胞異常增生和口腔黏膜白斑病和腫瘤的惡變的應(yīng)答，提示異常增生的上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞得到免疫激活[28-29]，然后腫瘤相關(guān)的抗原特異性CD8+T細(xì)胞識別并消除癌細(xì)胞[25].與這些數(shù)據(jù)相一致，本課題組最近證明，與上皮增生組和D1組相比，OLP組和D2組中CD1a的陽性表達(dá)升高.

本研究提示：總體來說，當(dāng)癌變風(fēng)險隨上皮異常增生程度增高而升高時，幾乎所有免疫細(xì)胞(CD8、Foxp3和CD1a)的陽性表達(dá)率均出現(xiàn)不同程度的上升，這表明這些免疫細(xì)胞作為評價惡變轉(zhuǎn)化潛能的指標(biāo)具有一定的指導(dǎo)意義.但是，因本研究入選病例數(shù)限制以及缺少重度上皮異常增生或口腔鱗狀細(xì)胞癌組織，對于這些免疫細(xì)胞作為評價惡變轉(zhuǎn)化潛能的指標(biāo)的臨床指導(dǎo)價值還需要更深入的研究探討.關(guān)于免疫細(xì)胞在OPMDs癌變過程中的作用，仍然存在許多懸而未決尚難解決的問題，我們希望通過了解口腔癌和癌前組織內(nèi)的免疫特征，找到潛在的重要標(biāo)志物，探尋口腔癌中免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間如何發(fā)生相互作用的機(jī)制，以期能明確鑒定出將發(fā)展為癌癥的高風(fēng)險癌前病變狀態(tài)；并在現(xiàn)有的影像技術(shù)檢測之前明確需要其他輔助療法的侵襲性腫瘤并預(yù)測淋巴結(jié)受累情況，評估腫瘤對免疫療法可能發(fā)生的反應(yīng)，以減少口腔中的復(fù)發(fā)和/或第二原發(fā)腫瘤.通過現(xiàn)成的價格便宜的分子診斷方法及明確的術(shù)語和分類，或許可闡明OPMDs和OSCCs的關(guān)系，并了解更多有關(guān)上皮角化、伴發(fā)或未伴發(fā)上皮的異常增生、不同程度的上皮異常增生、原位癌及浸潤癌的基因組序列改變的信息，為臨床提供更好的干預(yù)措施依據(jù)以降低OSCCs的發(fā)病率和死亡率，并最終為患者帶來更好的管理.

致謝

特別感謝加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)牙學(xué)院Dr. Poh Catherine實(shí)驗(yàn)室提供病理標(biāo)本以及實(shí)驗(yàn)上的幫助.

作者貢獻(xiàn)聲明

劉奕：協(xié)助提出研究思路和框架，收集資料文獻(xiàn)，實(shí)施實(shí)驗(yàn)，撰寫及修改論文；肖力：參與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，修改論文；曹佩琳：協(xié)助參與實(shí)驗(yàn)的實(shí)施以及分析數(shù)據(jù)；李雪：提出研究思路和框架，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，修改實(shí)驗(yàn)方案，分析數(shù)據(jù)，修改論文.

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突.