黃鄭煒, 鐘子喬， 陳智偉， 謝雨珂， 王文浩

(1. 暨南大學(xué) 藥學(xué)院, 廣東 廣州 510632; 2. 中山大學(xué) 藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006)

近十年來，納米藥物(nanomedicines，NMs)發(fā)展迅猛，醫(yī)藥界逐漸將NMs應(yīng)用于不同的給藥途徑.在肺部給藥方面，吸入NMs具有應(yīng)用于包括哮喘、肺部感染和肺癌等肺部疾病的臨床治療前景[1].相比于全身化學(xué)療法及應(yīng)用傳統(tǒng)藥物的吸入療法而言，吸入NMs既可通過呼吸道將治療藥物局部地輸送到肺患病組織，避免首過消除，減少全身性不良反應(yīng)(如肝毒性[2])，又可控制藥物的釋放速度，達(dá)到緩釋的治療效果，減少給藥的頻率[3]，還可通過修飾NMs的表面基團(tuán)使NMs獲得主動(dòng)靶向性，從而實(shí)現(xiàn)被靶細(xì)胞特異性攝取[4]，優(yōu)勢(shì)顯著.

報(bào)道常見的用于肺部治療的NMs有聚合物膠束、脂質(zhì)體、金屬納米粒、高分子囊泡和樹枝狀大分子等，通過物理包埋或化學(xué)結(jié)合的方式遞送藥物.除此之外，還有聚合物-藥物綴合物，通過化學(xué)鍵共價(jià)結(jié)合作用來實(shí)現(xiàn)載體與藥物的偶聯(lián).其中，脂質(zhì)體、納米膠束和高分子囊泡生物相容性較好[5]且載藥能力較強(qiáng)[6]，研究最為廣泛.

雖然NMs優(yōu)勢(shì)顯著，但是臨床應(yīng)用中NMs很可能受到肺表面活性劑(pulmonary surfactant，PS)的影響.PS會(huì)吸附到NMs的表面(圖 1)，從而形成生物分子層，影響NMs的生物化學(xué)特性[7]，

圖1 NMs吸附PS中的脂類和蛋白質(zhì)等

使NMs的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)行為改變.本文就PS的組成和特性、PS與NMs的相互作用對(duì)PS和NMs的影響及它們相互作用的表征方法等進(jìn)行綜述，為吸入NMs的臨床應(yīng)用提供參考.

1 肺表面活性劑

PS是由10%蛋白類和90%脂類組成的一種復(fù)雜磷脂蛋白混合物，最初在肺泡腔內(nèi)的液體層中發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)其系由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞合成并分泌.PS的主要成分為表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白(surfactant-associated protein，SP)、二棕櫚酰卵磷脂(dipalmitoyl phosphatidylcholine)和其他脂類.SP約占PS的10%，包括表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白B(SP-B)、表面活性蛋C(SP-C)、表面活性蛋白D(SP-D)、表面活性蛋白G(SP-G)和表面活性蛋白H(SP-H).這6種SP在肺組織發(fā)揮生理功能中起著非常重要的作用[8].SP-A與SP-D為大分子親水性SP，主要發(fā)揮防御功能，參與呼吸道免疫調(diào)節(jié).SP-A及SP-D通過聚集、調(diào)理素和促凋亡作用，及調(diào)控炎癥反應(yīng)與活化吞噬細(xì)胞等生理機(jī)制，識(shí)別和消滅病原體[9].SP-B與SP-C是小分子疏水性SP，主要發(fā)揮調(diào)節(jié)表面張力，防止呼氣末肺泡萎縮的作用[10].SP-G和SP-H是近幾年來發(fā)現(xiàn)的新的肺表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白[11]，其兼有SP-A、SP-D和SP-B、SP-C的功能[12].二棕櫚酰卵磷脂約占PS的41%，是含量最多的組分[11].

2 肺表面活性劑與吸入納米藥物的相互作用

NMs被吸入進(jìn)肺深部遇到的一個(gè)重要的生物屏障就是PS,PS的多種成分會(huì)被吸附到NMs表面.當(dāng)NMs與PS接觸時(shí)，基于NMs的理化特性，將誘導(dǎo)不同的PS成分參與到相互作用中.這可能會(huì)干擾粒子的預(yù)期藥理作用，且會(huì)影響到PS的正常功能，從而改變NMs的生物相容性或毒性[13].

PS中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等與NMs形成絡(luò)合物，遵循由Vroman效應(yīng)定義的吸附和解吸附動(dòng)力學(xué).這一動(dòng)力學(xué)是與時(shí)間相關(guān)的過程，其中，豐度高親和力低的分子首先被吸附，然后被豐度較低親和力較高的分子替代[14-15].除了上述過程之外，高離子強(qiáng)度和PS內(nèi)的蛋白質(zhì)(主要是SP)吸附都會(huì)破壞NMs表面的穩(wěn)定性，導(dǎo)致NMs聚集體的形成.這種現(xiàn)象是否發(fā)生，既取決于蛋白質(zhì)的濃度，也取決于NMs的理化性質(zhì)[16].Ruge等[17]利用動(dòng)態(tài)光散射和透射電子顯微鏡(transmission electron microscope)來研究SP-A與甘露糖化NMs的相互作用.這項(xiàng)研究表明SP-A與甘露糖化NMs結(jié)合形成了較強(qiáng)的聚集態(tài)，且SP-A可增加巨噬細(xì)胞對(duì)NMs的攝取.NMs聚集體的形成直接影響細(xì)胞攝取率.與單個(gè)NMs相比，A549細(xì)胞對(duì)聚集的金納米粒子攝取減少了25%[18].

總而言之，NMs表面吸附有PS時(shí)，NMs的各種性質(zhì)，包括其穩(wěn)定性、疏水性、表面電荷、細(xì)胞攝取率和穿透能力等，都會(huì)發(fā)生很大的改變；同時(shí)，PS與NMs接觸后，PS的活性和壓縮性等生理功能也會(huì)受到影響.因此，深入了解PS與NMs的相互作用，減少或利用PS對(duì)NMs諸如表面吸附、細(xì)胞攝取率、疏水性和表面電荷等方面的影響，減弱NMs對(duì)PS生理功能的干擾，對(duì)推動(dòng)NMs的實(shí)際臨床應(yīng)用是非常重要的.

2.1 NMs與PS相互作用的分類

NMs與PS的相互作用是多種因素共同參與的結(jié)果(圖2).根據(jù)其中起主導(dǎo)作用的因素進(jìn)行分類，大致可分為疏水作用、靜電相互作用[19]、氫鍵和范德華力[20]等.

圖2 NMs與PS相互作用示意圖

2.2 相互作用對(duì)吸入納米藥物的影響

2.2.1 對(duì)NMs疏水性和表面電荷等的影響

與血漿等其他生物流體相比，PS的脂質(zhì)含量占比大得多，這導(dǎo)致了NMs吸附的活性物質(zhì)成分在肺部區(qū)域中與其他解剖環(huán)境中明顯不同[21].這種表面吸附物質(zhì)的結(jié)構(gòu)取決于NMs的關(guān)鍵理化性質(zhì)，如NMs的組成成分、親疏水性和表面電荷[19].已有研究證明氧化硅或氧化鋯吸入納米藥物并不直接與不含蛋白質(zhì)的純脂樣品相互作用，推測(cè)NMs-PS脂質(zhì)相互作用可能是由蛋白質(zhì)介導(dǎo)的[22].一些蛋白質(zhì)被吸附到NMs表面，如SP-D或抗菌肽，會(huì)觸發(fā)脂質(zhì)的吸附[21-23].蛋白質(zhì)的吸附會(huì)隨著NMs的濃度和表面積的增加而增加[23].

NMs的疏水性和表面電荷等理化性質(zhì)在調(diào)節(jié)粒子在PS層上的轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要的作用.Hu等[19]首次通過實(shí)驗(yàn)證明了不同疏水性的NMs對(duì)一種外源天然PS生物物理性質(zhì)的影響，同時(shí)利用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究PS單分子膜與不同理化性質(zhì)的NMs之間的相互作用機(jī)理.NMs的疏水性決定了它們?cè)谔烊籔S膜上的位移程度.親水性NMs快速穿透PS單層，而部分疏水性NMs被PS單層捕獲.而NMs的表面電荷在影響NMs跨PS單層的位移中只起次要作用.Hu等[19]還發(fā)現(xiàn)陰離子NMs選擇性地吸附SP-B，但不吸附SP-C.因此，陰離子親水性NMs可以誘導(dǎo)SP-B從PS單分子層中移出，但不能誘導(dǎo)SP-C移出.雖然陰離子疏水性NMs被PS膜捕獲，但它也選擇性將SP-B吸附到表面.這項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)表明，靜電和疏水相互作用之間的平衡是NMs移位和與PS單分子層相互作用的原因.此外，DPPC等脂質(zhì)在檸檬酸穩(wěn)定的銀NMs上的吸附已被證明可以降低這些NMs由于pH的影響而聚集的趨勢(shì)[24].

必須指出，在任何情況下，由于分子在其表面的吸附或在輸送過程中環(huán)境條件的改變而引起的NMs的電荷或聚集狀態(tài)的變化，都可能影響NMs的最終靶向部位[25].

2.2.2 對(duì)NMs細(xì)胞攝取率等的影響

進(jìn)入肺深部是NMs被肺泡上皮細(xì)胞攝取的先決條件.而NMs表面吸附PS這一現(xiàn)象已經(jīng)被證明在調(diào)控NMs轉(zhuǎn)運(yùn)過程里起著重要的作用：僅當(dāng)吸附PS后，某些NMs才可被轉(zhuǎn)運(yùn)至肺深部.例如，Tomoko等[26]向大鼠氣管內(nèi)注射卵磷脂包覆和未包覆的聚苯乙烯微球，結(jié)果顯示這兩種微球都被肺泡巨噬細(xì)胞吸收，而只有卵磷脂包覆的微球可進(jìn)入Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(圖3).

PS除了具有運(yùn)送NMs進(jìn)入肺深部的獨(dú)特能力外，還具有促進(jìn)肺泡細(xì)胞攝取NMs的能力.Yan等[27]使用一種具有代表性的霧化親水性藥物的模型納米液滴，利用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究NMs與PS層的相互作用.為了讓納米液滴的表面疏水性更強(qiáng)，他們還設(shè)計(jì)了一種脂質(zhì)包被的納米液滴.此項(xiàng)研究結(jié)果表明，裸露的納米液滴迅速黏附在PS層上，釋放出擴(kuò)散到PS層的藥物.裸露的納米液滴具有較高的表面張力，這一性質(zhì)增強(qiáng)了其跨層擴(kuò)散，但與此同時(shí)，納米液滴破壞了PS層的超微結(jié)構(gòu).通過在納米液滴上涂蓋脂質(zhì)，減少了納米液滴對(duì)PS的擾動(dòng)作用.而且脂質(zhì)包裹的納米液滴可以很容易地被PS層包裹形成泡狀結(jié)構(gòu)，這可能會(huì)促進(jìn)與細(xì)胞膜的融合，從而促進(jìn)藥物向次級(jí)器官的釋放.由此可知，PS吸附到NMs表面，或利用脂質(zhì)修飾NMs，均可改變NMs的穿透能力和被細(xì)胞攝取的能力.

近年來，PS修飾的脂質(zhì)體被提出以促進(jìn)藥物的吸收[28].De Backer等[29-30]觀察到在體內(nèi)和體外，包覆PS的比未包覆的葡聚糖納米凝膠更有效地將siRNA輸送到不同類型的細(xì)胞.PS組分以某種方式促進(jìn)了NMs在細(xì)胞內(nèi)移位到胞質(zhì)中，在胞質(zhì)里siRNA產(chǎn)生沉默.另外，提出SP-B蛋白可能是PS中影響siRNA傳遞效率的關(guān)鍵因素.近幾年來，Merckx等[31]確定SP-B是上述納米復(fù)合材料增強(qiáng)siRNA遞送效率的關(guān)鍵成分，且首次將天然SP-B與改善小RNA療法的細(xì)胞遞送聯(lián)系起來.利用小鼠脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷模型，在體內(nèi)同樣證明了SP-B促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用.

2.3 相互作用對(duì)肺表面活性劑的影響

NMs與PS的相互作用除對(duì)NMs產(chǎn)生顯著影響之外，也會(huì)導(dǎo)致PS生理功能的改變.吸入NMs與活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生有關(guān)，而ROS的產(chǎn)生會(huì)直接導(dǎo)致Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的損傷.肺泡上皮細(xì)胞的損傷和炎癥會(huì)進(jìn)一步影響PS的合成、組成、結(jié)構(gòu)、代謝和功能等[32].

PS由脂質(zhì)和多種蛋白組成，它們的協(xié)同作用在PS行使正常生理功能中起關(guān)鍵作用.因此，如果某些組分被移除或破壞，PS的生理功能可能會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p害.而由于NMs理化性質(zhì)的特點(diǎn)，它會(huì)選擇性吸附PS的某些成分，導(dǎo)致PS成分的缺失[13].疏水性SP的缺失將導(dǎo)致PS表面活性的抑制.例如，當(dāng)SP-B或SP-C被NMs吸附時(shí)，它們會(huì)從PS膜中除去，從而導(dǎo)致PS活性抑制.SP-B或SP-C含量降低到一定水平以下會(huì)導(dǎo)致PS在氣液界面的吸附減少，從而限制其降低表面張力的能力以及其壓縮性[31].親水性SP也可能吸附于NMs表面，導(dǎo)致PS生理功能受損.例如，單壁碳納米管在動(dòng)物模型上可以吸附SP-A和SP-D[33].金屬氧化物納米顆粒傾向于吸附SP-A，金納米顆粒傾向于吸附SP-D[24].這兩種蛋白的完全或部分缺失也與肺先天免疫防御受損有關(guān)[34].

親疏水性不同的NMs也會(huì)對(duì)PS產(chǎn)生不盡相同的影響.在Langmuir-Blodgett槽中進(jìn)行的研究表明，疏水NMs能夠與PS發(fā)生相互作用，聚集在脂質(zhì)凝聚域周圍，使其變得更小，從而使界面膜流態(tài)化[23].而利用親水性聚合物NMs的研究證實(shí)，它們可以保留在PS單分子層中形成聚集體，干擾亞相物質(zhì)的相變和再吸附，并增加膜的可壓縮性[19, 23].盡管它們?cè)黾恿藟嚎s性，抑制了相變，增加了最小表面張力，但實(shí)際影響并不明顯.

此外，不同尺寸的NMs會(huì)對(duì)PS產(chǎn)生不同程度的影響.Dwivedi等[35]考察了不同粒徑的疏水NMs對(duì)PS薄膜的影響，觀察到12 nm和20 nm的NMs對(duì)PS薄膜的影響不大.然而，在原子力顯微鏡(atomic force microscopy)下觀察到，136 nm NMs增加了模型PS薄膜的壓縮性，這是由于形成了多層凸起結(jié)構(gòu)，阻礙了最小表面張力的獲得，引發(fā)PS功能障礙.這項(xiàng)研究得出的結(jié)論是，136 nm NMs對(duì)PS產(chǎn)生的影響比12 nm NMs更為顯著(圖4).

圖4 不同尺寸的NMs對(duì)模型PS薄膜的影響

本文所涉及的NMs與PS相互作用的研究及其相應(yīng)體系如表1所示.

表1 NMs與PS相互作用Table 1 Summary of the interaction between PS and NMs

3 肺表面活性劑與吸入納米藥物相互作用的表征方法

一方面，NMs在被吸入后，部分NMs與PS之間的相互作用將導(dǎo)致NMs的性質(zhì)變化.另一方面，此相互作用可能會(huì)影響PS系統(tǒng)的正常功能.因此，有必要研究NMs與PS的相互作用，以確定NMs的生物相容性，并幫助追蹤這些NMs對(duì)肺部生理活動(dòng)的影響.目前常用的NMs與PS相互作用的表征方法如圖5.

圖5 NMs與PS相互作用的表征方法

在對(duì)表面吸附有PS的NMs進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究時(shí)，一般會(huì)采用透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡來進(jìn)行表征.Hatami等[36]利用透射電子顯微鏡觀察單寧酸-肺液復(fù)合體形成的聚合物形態(tài)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)單寧酸-肺液配合物可自組裝為球形顆粒，粒徑<30 nm.

為了分離鑒別NMs與PS之間的相互作用后NMs表面所吸附的蛋白，通常會(huì)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(polyacrylamide gelelectrophoresis)、體積排阻色譜法(size exclusion chromatography)、流體動(dòng)力相互作用色譜法(hydrodynamic interaction chromatography)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法(liquid chromatograph-mass spectrometer)等[37-38].Tenzer等[39]用該方法鑒定出了硅納米給藥系統(tǒng)表面吸附了300余種不同的蛋白成分.

在檢測(cè)PS與NMs結(jié)合后所產(chǎn)生的構(gòu)象變化時(shí)，通常使用的是圓二色光譜(circular dichroism)、傅立葉變換紅外吸收光譜儀(fourier transform infrared)和表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced raman spectroscopy)等譜學(xué)表征方法.此外，熒光相關(guān)光譜法(fluorescence correlation spectroscopy)適用于分析NMs和蛋白的結(jié)合力以及蛋白分子層的厚度.Hatami等[36]利用該法，通過熒光淬滅來描述單寧酸與肺液的絡(luò)合過程.

對(duì)NMs與PS的生物物理作用進(jìn)行定性和定量分析時(shí)，可以采用基于耗散監(jiān)測(cè)石英晶體微平衡法(quartz crystal microbalance).Wan等[40]通過Langmuir吸附方程分析石英晶體微平衡法研究數(shù)據(jù)，確定了動(dòng)力學(xué)和平衡參數(shù)，闡明了NMs和由脂質(zhì)體組成的PS之間的相互作用的性質(zhì).

為了可視化NMs與PS之間的相互作用，可考慮粗?；姆肿觿?dòng)力學(xué)模擬方法.用這一方法進(jìn)行表征的好處在于模型中保留了PS體系中必要的化學(xué)結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)信息，定量地描述分子相互作用所造成的影響.焦鳳軒等[41]應(yīng)用這一方法研究了NMs與肺泡表面磷脂膜相互作用的力學(xué)機(jī)理.

4 結(jié)論與展望

NMs具有諸多優(yōu)勢(shì)，其應(yīng)用于肺部疾病治療的優(yōu)越性能也越發(fā)受到人們關(guān)注，然而目前鮮有上市產(chǎn)品.究其原因，主要是NMs進(jìn)入肺深部后其與PS的相互作用機(jī)制尚不明了.為此，近年來很多研究對(duì)NMs與PS相互作用過程進(jìn)行了深入探究，加深了NMs與PS的相互作用對(duì)NMs的體內(nèi)命運(yùn)及PS生理功能影響的認(rèn)知，這為研究具有不同生物效應(yīng)的NMs的設(shè)計(jì)制備和實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).同時(shí)，許多表征NMs與PS相互作用的方法被提出，為從微觀水平上闡明NMs與PS的相互作用提供了更為豐富的條件.

盡管如此，掌握NMs表面吸附PS形成相互作用復(fù)合物的作用機(jī)制仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù).探索NMs與PS的相互作用是NMs的生物化學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)研究的一個(gè)非常重要組成部分.闡明NMs與PS相互作用的機(jī)制及影響因素，構(gòu)建NMs與PS相互作用的分子模型，進(jìn)而主動(dòng)對(duì)NMs表面進(jìn)行修飾，使其主動(dòng)吸附PS的某些組分而具有靶向特定細(xì)胞的能力，或者規(guī)避PS的吸附而提高NMs體內(nèi)命運(yùn)的可預(yù)測(cè)性，這是推動(dòng)NMs臨床轉(zhuǎn)化的潛在研究方向，有待進(jìn)一步探索.

作者貢獻(xiàn)聲明

黃鄭煒：提出研究方向，撰寫文章并對(duì)擬發(fā)表文章作最后審閱及定稿；鐘子喬：整理文獻(xiàn)資料，制作圖表及撰寫文章“相互作用對(duì)吸入納米藥物的影響”部分；陳智偉：撰寫文章“相互作用的表征方法”部分及修改論文；謝雨珂：撰寫文章“相互作用對(duì)肺表面活性劑的影響”部分及修改論文；王文浩：確定研究?jī)?nèi)容及修改文章.

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助且不存在潛在利益沖突.