喬智灝， 李嘉瑩， 劉昶

(1.南方醫(yī)科大學 第七附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學科, 廣東 佛山 528300； 2.廣東同江醫(yī)院 藥劑科， 廣東 佛山 528300； 3.廣東同江醫(yī)院 重癥醫(yī)學科， 廣東 佛山 528300)

真菌感染不斷增加，對生命和健康構成巨大威脅[1].侵襲性念珠菌感染(invasive candida infection，ICI)是臨床上常見的感染類型[2].統(tǒng)計顯示ICI是血液感染的第4大原因之一，并且每年有超過25萬人因ICI致病，并且致死率高達40%[3].作為共生微生物，白色念珠菌主要定植于多個黏膜部位，包括口腔、胃腸道和泌尿生殖道，在健康個體中無癥狀[4].但是在易感染人群中，白色念珠菌可進入血液并引起經(jīng)常致命的播散性感染[5].然而ICI后無明顯的臨床特征，并且常規(guī)的檢測方法靈敏度不高[6],這就導致臨床上易出現(xiàn)漏診，延誤最佳治療時機.因此亟需尋找一種有效、準確的ICI診斷標志物來提升診斷水平.

microRNA(miR)是一種長度約18～24nt的非編碼RNA，是非編碼RNA家族重要成員[7-8].miR可通過與下游靶向mRNA互補序列配對，起到調(diào)節(jié)下游mRNA表達的作用[9].研究顯示，miR參與了人類多種急性與慢性病、炎癥、癌癥、感染及器官損傷[10-11].miR-140-3p是人們早期發(fā)現(xiàn)的一種miR，位于人16q22.1染色體上[12].目前關于miR-140-3p的研究主要以腫瘤為主.例如miR-140-3p靶向PD-L1抑制大腸癌細胞生長和誘導細胞凋亡，miR-140-3p靶向FOXQ1抑制膀胱癌細胞增殖和侵襲[13].但是，近年來研究發(fā)現(xiàn)miR-140-3p可通過調(diào)節(jié)下游基因參與細菌感染，并具有抑制細胞炎癥反應的作用[14].miR-140-3p在ICI中是否具有同樣作用仍不明確.Muhammad等[15]在miR表達譜分析中發(fā)現(xiàn)ICI患者中miR-140-3p表達降低，這說明miR-140-3p可能參與了ICI的發(fā)生.

本研究旨在探究miR-140-3p在ICI患者中的診斷意義以及預后價值，為臨床診斷與預后觀察提供潛在觀察標志物.

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2021年1月至2021年6月在廣東同江醫(yī)院確診治療的60例侵襲性念珠菌感染患者作為本研究實驗組，另收集同期在廣東同江醫(yī)院進行體檢的正常人50例作為對照組.本研究獲得該院醫(yī)學倫理委員會的批準.

1.2 納入排除標準

1.2.1 納入標準

患者符合2020年制定的《中國成人念珠菌病診斷與治療專家共識》[16].患者血培養(yǎng)白念珠菌均為陽性，臨床癥狀符合真菌感染.患者在本研究前并未進行過針對性治療.

1.2.2 排除標準

單純口腔、泌尿系統(tǒng)、陰道念珠菌感染患者，器官移植患者、粒細胞缺乏患者、免疫抑制患者、合并腫瘤患者及對本次藥物不耐受患者.

1.3 治療方案

實驗組患者采用卡泊芬凈降階梯治療，具體方案如下：注射用醋酸卡泊芬凈(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司；國藥準字H20193172)每日400 mg靜脈滴注，共5 d，隨后改用氟康唑膠囊(上海健坤制藥有限公司；國藥準字H20073022)每日200 mg口服，根據(jù)患者的臨床癥狀、影像學表現(xiàn)，血、痰和肺灌洗液等真菌連續(xù)培養(yǎng)陰性>1周，作為停藥指標.

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測

使用TRIzol試劑對收集到的血清進行總RNA提取，采用PrimeScriptTMRT試劑盒對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，收集cDNA為擴增準備.采用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒與ABI 7500 PCR儀進行PCR擴增.反應體系與反應條件按照試劑盒說明書進行配置.miR-140-3p采用U6作為內(nèi)參，使用2-ΔΔ的Ct方法用于計算相對mRNA表達[17].每個實驗進行3次.miR-140-3p上游引物5’-GCGCGTACCACAGGGTAGAA-3’，下游引物5’AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’，U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’.

1.5 觀察指標

觀察實驗組與對照組血清中miR-140-3p表達水平和診斷價值.觀察患者治療前與治療后(2周)miR-140-3p表達變化水平.分析影響ICI預后的危險因素.收集患者治療前血清1-3-β-D葡聚糖數(shù)據(jù)，采用logistic回歸對miR-140-3p與血清1-3-β-D葡聚糖進行預測得到聯(lián)合診斷數(shù)據(jù)，采用ROC曲線分析聯(lián)合檢測價值.

觀察治療前后miR-140-3p與患者臨床療效之間的關系.

1.6 療效評估

按衛(wèi)生部頒發(fā)的抗感染藥物臨床研究指導原則[18]進行評價，療效分為痊愈、顯效、進步、無效 4個級別.(1)痊愈：侵襲性真菌感染的相關癥狀、體征、實驗室檢查、影像學檢查及病原學檢查全部恢復正常; (2)顯效：病情明顯好轉(zhuǎn)，但上述癥狀、體征、實驗室檢查、影像學檢查及病原學檢查中有1項未完全恢復正常;(3)進步：用藥后病情有好轉(zhuǎn)，但不明顯;(4)無效：用藥后病情大改善或加重者.

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，采用Graphpad 8繪制結(jié)果圖形；計數(shù)資料采用卡方檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差的形式表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗；采用Logistic回歸分析對患者預后進行評估；采用受試者工作曲線(ROC)分析miR-140-3p在ICI患者中的診斷價值；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用四分位數(shù)表示，采用非參數(shù)檢驗；對多因素Logistic回歸有意義指標進行ROC曲線繪制；分析這些指標在預測臨床療效中的價值.P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 基線資料比較

兩組的臨床基線資料顯示，實驗組與對照組患者年齡，性別，體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)，既往病史，吸煙史，均不存在統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1.

2.2 miR-140-3p在ICI中的表達與診斷價值

本研究通過qRT-PCR檢測了ICI患者中血清中miR-140-3p相對表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，實驗組患者血清中miR-140-3p表達水平明顯降低，存在統(tǒng)計學差異(P<0.001)；與對照組相比，實驗組患者血清中1-3-β-D葡聚糖濃度水平明顯上升，存在統(tǒng)計學差異(P<0.001).此外，繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，miR-140-3p在診斷ICI的曲線下面積為0.834，特異度為73.46%，靈敏度78.33%，約登指數(shù)51.08%，Cut-off值為0.938.1-3-β-D葡聚糖在診斷ICI的曲線下面積為0.755，特異度為100.00%，靈敏度68.33%，約登指數(shù)68.33%，Cut-off值為65.34.而兩者聯(lián)合檢測曲線下面積為0.924，特異度為83.33%，靈敏度91.83%，約登指數(shù)75.17%，Cut-off值為0.437，見圖1.

表1 兩組臨床資料比較Table 1 Comparison of patient clinical data n(%)

1)P<0.001

2.3 治療前后miR-140-3p在ICI中的表達

與治療前相比治療后患者血清中miR-140-3p表達水平出現(xiàn)上升，兩組間比較存在顯著差異(P<0.01)，見圖2.

2.4 miR-140-3p在ICI預后良好組中的表達

本研究進一步分析了治療前后患者血清中miR-140-3p表達與臨床療效的關系.患者通過治療后痊愈26例、顯效10例、進步13例、無效11例.比較4組人群治療前后血清中miR-140-3p表達發(fā)現(xiàn)，治療前miR-140-3p表達隨著療效程度惡化表達逐漸升高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，而治療后miR-140-3p表達隨著患者臨床療效的改善逐步降低，存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，此外，根據(jù)療效分組發(fā)現(xiàn)，預后良好組患者治療前血清中miR-140-3p的表達明顯低于預后一般組，存在統(tǒng)計學差異(P<0.01)，見圖3.

1)P<0.05

1)P<0.05;2)P<0.01

2.5 ICI預后危險因素分析

用單因素Logistic回歸分析判斷影響ICI預后的危險因素，以預后良好作為自變量(Y)，收集到的因素作為因變量(X)，見表2.結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-140-3p、年齡、糖尿病是ICI患者預后危險因素(P<0.05).隨后，對單因素分析存在差異的指標進行多因素向后LR回歸分析，發(fā)現(xiàn)miR-140-3p、年齡、糖尿病是ICI患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表3.為了驗證這些因素對ICI患者預后的預測價值繪制了ROC曲線,表明miR-140-3p在ICI患者預后的預測價值較高，見圖4，表4.

表2 ICI預后因素的賦值表Table 2 Assignment table for prognostic factors

表3 ICI預后危險的多因素Logistic回歸分析Table 3 Logistic regression analysis of prognostic risk of ICI

A:年齡因素;B:糖尿病因素;C:miR-140-3p因素.A:Age factor; B:Diabetes factor; C:miR-140-3p factor.

表4 預后因素的ROC參數(shù)Table 4 ROC parameters for prognostic factors

3 討論

在美國的流行病調(diào)查中顯示ICI是美國第4大血行感染疾病[19].并且近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ICI在發(fā)展中國家的感染趨勢逐漸嚴重[20].由于實驗室真菌培養(yǎng)時間較長，確診后患者可能錯過了最佳的治療時間[21].而病理檢測作為有創(chuàng)檢測可能會增加患者感染的可能[22].這就導致ICI患者早期診斷非常困難.因此，尋找檢測時間短，檢出率高的生物標志物就顯得尤為重要.

miR是一種內(nèi)源性小型RNA分子，可以調(diào)節(jié)信使RNA(mRNA)的豐度以及蛋白質(zhì)的表達，還可以有多個甚至上百個mRNA靶標來結(jié)合，對于各種生物學過程可能均具有一定參與性[23].據(jù)報道有許多致病物種通過miR改變宿主的細胞反應，miR現(xiàn)在被認為是細胞機制的主要調(diào)節(jié)因子[24].miR-140-3p與miR-140-5p同屬于miR-140家族.早期的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-140-3p在腫瘤、炎癥和免疫調(diào)節(jié)中起到了重要作用[25].Muhammad等[15]的研究中發(fā)現(xiàn)miR-140-3p在ICI患者血液分離出的白色念珠菌中低表達，這說明miR-140-3p可能參與了ICI的發(fā)生.研究表明真菌細胞壁中含有大量1-3-β-D葡聚糖成分，1-3-β-D葡聚糖濃度的上升可反應ICI病情的嚴重程度，是診斷ICI的重要手段[26].本研究通過對ICI患者血清中miR-140-3p與1-3-β-D葡聚糖的表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-140-3p在ICI患者中的表達要遠低于正常人群，而ICI患者中1-3-β-D葡聚糖表達遠高于正常人群.ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-140-3p在診斷ICI中的曲線下面積>0.8，而1-3-β-D葡聚糖在診斷ICI中的曲線下面積<0.8，但是兩者聯(lián)合檢測ICI的曲線下面積為0.924，這說明miR-140-3p低表達可以提升1-3-β-D葡聚糖在診斷ICI中診斷價值，提高其靈敏度.提示miR-140-3p可能是ICI的潛在的生物診斷標志物.

卡泊芬凈作為抗真菌藥物，通過抑制1-3-β-D葡萄糖合成破壞真菌細胞壁[27].1-3-β-D葡萄糖作為真菌細胞壁的抗原成分，在真菌結(jié)構完整中起到重要作用，一定程度上可以促進宿主體內(nèi)炎癥反應發(fā)生[28].研究發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈在體外和體內(nèi)對念珠菌表現(xiàn)出極好的活性，它們具有殺滅活性、低耐藥性和更高的安全性[29]，因而其迅速成為治療念珠菌血癥和其他形式的侵襲性念珠菌感染的首選藥物.本研究觀察卡泊芬凈治療后患者血清中miR-140-3p的表達變化，發(fā)現(xiàn)血清中miR-140-3p的表達明顯上升.早期研究發(fā)現(xiàn)miR-140-3p在PC12細胞的氧糖剝奪再灌注模型中表達明顯降低，而通過上調(diào)減輕炎癥的發(fā)生[30]，這說明miR-140-3p可能參與了機體炎癥反應.真菌感染會引起患者出現(xiàn)感染性休克，內(nèi)毒素入侵使機體中炎癥細胞釋放大量炎癥因子[31].因此推測患者采用卡泊芬凈治療后，念珠菌中1-3-β-D葡萄糖合成受到抑制，細胞壁受到破壞，導致患者體內(nèi)炎癥減輕，從而使得患者體內(nèi)的miR-140-3p表達降低.

最后，本研究小組對患者治療后的療效進行了評估，根據(jù)臨床療效不同，比較了患者治療前后血清中miR-140-3p表達與臨床療效的關系，結(jié)果顯示患者血清中miR-140-3p隨著患者臨床療效的惡化逐漸降低.進一步分組比較發(fā)現(xiàn)治療前miR-140-3p表達水平在預后良好組中表達高于預后一般組.這說明miR-140-3p可能是ICI患者的預后預測指標.為了驗證此項推測，我們進行了Logistic回歸分析，結(jié)果證明，治療前miR-140-3p，低表達是影響ICI患者預后的獨立危險因素，并通過ROC曲線分析驗證其價值.

綜上所述，本研究初步確定了miR-140-3p在ICI中的診斷與預后價值.miR-140-3p在侵襲性念珠菌患者中低表達，可提升1-3-β-D葡聚糖對ICI的靈敏度，并且與患者預后密切相關，有望成為潛在的預后觀察指標.但是本研究還存在一定的局限.首先，樣本收集時間較短，患者人數(shù)較少，并且并未對患者進行長期的隨訪；其次，關于卡泊芬凈具體是通過何種機制調(diào)節(jié)miR-140-3p改善ICI進程仍不明確；最后，本研究樣本單一，僅對患者血清中miR-140-3p的表達進行檢測，miR-140-3p在ICI患者外泌體、外周血單個核細胞是否同樣存在表達，還需進一步驗證，望在后續(xù)的研究中開展更多的臨床與基礎實驗，來完善研究結(jié)論.

作者貢獻聲明

喬智灝:提出研究思路和框架，實驗操作，撰寫并修改論文；李嘉瑩:指導實驗，指導數(shù)據(jù)分析；劉昶:數(shù)據(jù)收集及分析.

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突.