劉曉明 李芮 高善語

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)為發(fā)病原因不明的間質(zhì)性肺疾病，目前臨床缺乏特效的治療藥物且無有效治療方法。中醫(yī)學(xué)常將其歸入“肺痹”的范疇。其中，細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積是肺纖維化的主要病理改變[1]，而細(xì)胞自噬正是保護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要途徑。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)與肺纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，其通過參與成纖維細(xì)胞活化、肌成纖維細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積等途徑促進(jìn)肺纖維化[1-4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，阻斷IL-17A的活性，可激活細(xì)胞自噬的發(fā)生，進(jìn)一步阻止中晚期膠原蛋白的異常沉積。因此，通過阻斷IL-17A靶向調(diào)控自噬有望成為肺纖維化診療的新靶點(diǎn)和方向[5-6]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用補(bǔ)腎活血方對(duì)造模后的人胚肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)治療，旨在觀察IL-17A的含量，探討補(bǔ)腎活血方在肺纖維化中的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株、主要試劑和儀器 人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；MEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO)；胎牛血清 FBS (Gibco, 10099-141)(賽默飛世爾科技有限公司)；雙抗：(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；TGF-β1細(xì)胞因子(派普泰克生物科技有限公司)；CCK8(日本同仁化學(xué)研究所)；定量PCR試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；二甲亞砜(DMSO) (Aladdin，B1328005)(西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，批號(hào)：RNBJ1841)。1640 培養(yǎng)液(Gibco,1171219)(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，磷酸緩沖液 PBS(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化SW-CJ-IFD)；RE200A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；HERACELL 150i二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO)；IX73顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；臺(tái)式低速離心機(jī)(中國(guó)上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter)；SYNERGY4酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek)；EPS-300水平電泳儀(上海天能科技有限公司)；VE-186蛋白轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)；VE-180蛋白電泳儀(上海天能科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

1.3.1 補(bǔ)腎活血方血清制備 ①補(bǔ)腎活血方中藥湯藥制備：根據(jù)人的用藥量(人參9 g，黃芪30 g，熟地黃15 g，山茱萸9 g，麥冬15 g，五味子6 g，當(dāng)歸15 g，丹參15 g，黃芩12 g，川貝母6 g，虎杖12 g，炙甘草6 g)，結(jié)合人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比值表分別計(jì)算。將8倍新西蘭兔等效劑量的中藥準(zhǔn)確稱取，加入8倍量的水浸泡后煎煮，水沸后小火煎煮約30 min后濾出藥液；然后，再次加入6倍量的水繼續(xù)煎煮20 min濾出藥液。將兩次藥液合并后過濾濃縮，濃度為3 g/mL，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂谥苽溥^程：健康新西蘭兔隨機(jī)分為含藥血清組和正常血清組。給予8倍新西蘭兔等效劑量的中藥灌胃，給藥量為56 g/kg(生藥量)，灌胃前禁食不禁水12 h，每天1次，連續(xù)給藥7天后，第7天灌胃1次，給足1天劑量。末次給藥后1 h在家兔自然清醒狀態(tài)下，以1%利多卡因5 mL腹腔內(nèi)注射麻藥后從腹主動(dòng)脈采血。血液于37℃下靜置1 h，待凝血后以5000 r/min離心10 min，常規(guī)分離血清，并將同組家兔的血清合并，56℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，用0.22 μm醋酸纖維素膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?。正常血清組：以生理鹽水灌胃，相同方法釆血制備血清。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的培養(yǎng) 使用含10%的牛胎血清的不完全DMEM培養(yǎng)基，置入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%左右時(shí)，用胰酶消化傳代，選擇第 3～4 代細(xì)胞用于下述實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù) 參照文獻(xiàn)[7-8]，確定TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化的最佳濃度及時(shí)間，TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化的最佳濃度為5 ng/mL，最佳刺激時(shí)間為48 h。

實(shí)驗(yàn)分組一：對(duì)照組，含藥血清(1倍)組，含藥血清(1/2倍)組，含藥血清(1/4倍)組，含藥血清(1/8倍)組，含藥血清(1/16倍)組，含藥血清(1/32倍)組，含藥血清(1/64倍)組，含藥血清(1/128倍)組。

實(shí)驗(yàn)分組二：空白組(A組)，TGF-β1造模組(B組)，TGF-β1處理+最佳濃度含藥血清干預(yù)1 h組(C組)，TGF-β1處理+shRNA-IL-17A組(D組)，TGF-β1處理+最佳濃度含藥血清干預(yù)1 h+IL-17A過表達(dá)質(zhì)粒組(E組)。

1.3.4 MTT法測(cè)定不同濃度含藥血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的抑制情況 將細(xì)胞隨機(jī)分為正常組(正常DMEM培養(yǎng)基)及不同稀釋濃度(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)含藥血清干預(yù)組等9組，每組8個(gè)復(fù)孔。置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中，于培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，培養(yǎng)板每孔加入20 μL MTT液，培養(yǎng)箱中孵育4 h后，吸棄 MTT液，加入DMSO，震蕩搖勻后在避光孵育15 min，選擇波長(zhǎng)490 nm處，酶標(biāo)儀讀取各孔OD值并記錄。統(tǒng)計(jì)每組OD值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次。

1.3.5 觀察各組細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化 熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.6 CCK8法檢測(cè)含藥血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響 將人胚肺成纖維細(xì)胞以1×105/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞貼壁后，各干預(yù)組加入不同溶液，空白對(duì)照組加入等量PBS溶液，作用24 h，吸去上清，除空白對(duì)照組外，每孔加入TGF-β1繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后將96孔板中對(duì)應(yīng)孔更換100 μL新的培養(yǎng)基，分別加入10%的CCK8，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后取出，放入酶標(biāo)儀中，450 nm測(cè)OD值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率公式如下：細(xì)胞抑制率=[(模型對(duì)照組OD值-干預(yù)組OD值)/模型對(duì)照組OD值]×100%。

1.3.7 RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)含藥血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞中IL-17A含量的影響 用超純RNA提取試劑盒提取樣本中總RNA，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參基因。引物序列見表1～2。

表1 IL-17A引物序列

表2 COL-Ⅰ引物序列

1.3.8 Western blot檢測(cè)COL-Ⅰ、IL-17A含量的變化 抽提總蛋白，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。最后按照1∶1的比例將ECL發(fā)光液中的A液和B液混合，將膜正面朝上平放(避免氣泡)，均勻滴加顯色液，放入凝膠成像儀中顯影。

2 結(jié)果

2.1 最佳濃度含藥血清的選擇

2.1.1 各組含藥血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞的抑制情況 與對(duì)照組相比，隨含藥血清作用濃度的升高，對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞均有明顯的抑制作用，抑制程度逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)含藥血清的藥物濃度達(dá)0.0625倍(1/16)時(shí)，使細(xì)胞抑制率達(dá)到10.06%，該藥物劑量下，細(xì)胞抑制率較低，對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞損傷小，藥物濃度相對(duì)安全，可以考慮將含藥血清濃度稀釋16倍后的濃度定為該實(shí)驗(yàn)的藥物最大無毒濃度，見圖1。

圖1 不同濃度含藥血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的抑制情況

2.1.2 Western blot法檢測(cè)不同藥物濃度作用后各組COL-Ⅰ 蛋白含量情況 人胚肺成纖維細(xì)胞加入含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)COL-Ⅰ蛋白含量比對(duì)照組明顯降低，且具有劑量依賴性，提示含藥血清有一定降解膠原蛋白的作用或者對(duì)細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白的沉積/降解過程有一定的調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)細(xì)胞的降解膠原蛋白的能力。組間分析顯示，最大無毒濃度組(a)降低最明顯，見圖2。

圖2 同濃度含藥血清對(duì)細(xì)胞內(nèi)COL-Ⅰ蛋白含量的影響

2.2 含藥血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響 與A組比較，B組的人胚肺成纖維細(xì)胞增殖水平顯著增加(P<0.01)，增殖率為15.21%。與B組比較，C組和D組胞增殖水平降低(均P<0.01)，C組與D組之間細(xì)胞增殖率無明顯差異(P>0.05)；而E組細(xì)胞增殖水平與B組相似，兩組無明顯差異(P>0.05)，見表3。

表3 含藥血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響

2.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)觀察 與A相比，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后的B組的人胚肺成纖維細(xì)胞增殖明顯提升，B組和E組的細(xì)胞形態(tài)由較大的梭形或不規(guī)則星形轉(zhuǎn)變成較為扁平的梭形結(jié)構(gòu)。而C、D組與A組的細(xì)胞增殖及形態(tài)變化相似,見圖3。

圖3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)觀察

2.4 各組人胚肺成纖維細(xì)胞中膠原蛋白COL-Ⅰ、IL-17A蛋白表達(dá)情況 TGF-β1處理組的膠原蛋白COL-Ⅰ蛋白表達(dá)量較空白組明顯增多，而含藥血清組的膠原蛋白COL-Ⅰ蛋白表達(dá)量較TGF-β1處理組明顯降低，見圖4。TGF-β1處理組的IL-17A蛋白表達(dá)量較空白組明顯增多，而含藥血清組及基因敲減組的COL-Ⅰ蛋白表達(dá)量較TGF-β1處理組及質(zhì)粒過表達(dá)組明顯降低，見圖5。

圖4 各組溶液對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞內(nèi)COL-Ⅰ蛋白表達(dá)量的影響

圖5 各組溶液對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞內(nèi)IL-17A蛋白表達(dá)量的影響

2.5 各組人胚肺成纖維細(xì)胞中IL-7AmRNA的表達(dá)量 與A組人胚肺成纖維細(xì)胞中的IL-17AmRNA表達(dá)量相比，B組顯著升高(P<0.05)；與B組人胚肺成纖維細(xì)胞中的IL-17AmRNA表達(dá)量比較，C組明顯降低(P<0.05)；D組人胚肺成纖維細(xì)胞中的IL-17AmRNA表達(dá)量顯著低于B組(P<0.05)；E組人胚肺成纖維細(xì)胞IL-17AmRNA表達(dá)量顯著高于C組(P<0.05)，見表4。

表4 各組人胚肺成纖維細(xì)胞中IL-7AmRNA的表達(dá)量

3 討論

肺間質(zhì)纖維化的形成與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子異常釋放、免疫系統(tǒng)失調(diào)、微循環(huán)障礙及細(xì)胞增殖、重構(gòu)等有關(guān)，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積,其主要成分是由不溶性纖維蛋白組成[9]。因此，維持肺組織細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、降解膠原蛋白可能成為攻克IPF的關(guān)鍵之一。有研究發(fā)現(xiàn)阻斷IL-17A的活性，激活細(xì)胞自噬的發(fā)生，進(jìn)一步阻止中晚期膠原蛋白的異常沉積[10]。因此，靶向調(diào)控IL-17A有可能成為肺纖維化的診療新靶點(diǎn)。

2010年,有研究[11]發(fā)現(xiàn)白介素17A型細(xì)胞因子(Interlukine-17A,IL-17A)可促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生,而敲除IL-17A的受體則可以改善由博萊霉素(Bleomycin,BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化發(fā)生。IL-17A可通過TGF-β1依賴及TGF-β1非依賴兩種途徑誘導(dǎo)肺纖維化的發(fā)生。TGF-β1可促進(jìn)膠原的轉(zhuǎn)錄,增加膠原的表達(dá),IL-17A可激活TGF-β1促進(jìn)膠原的表達(dá)。同時(shí),IL-17A還可以通過非TGF-β1依賴途徑抑制由饑餓誘導(dǎo)的自噬活化,抑制經(jīng)自噬-溶酶體途徑導(dǎo)致的膠原降解[12-15]。因此,調(diào)節(jié)IL-17A引起的免疫反應(yīng)有可能成為治療肺纖維化疾病的潛在靶點(diǎn)。

本課題組在傳統(tǒng)中醫(yī)理論指導(dǎo)下，結(jié)合肺纖維化的臨床特征及病理變化、病程進(jìn)展，應(yīng)用李芮教授治療肺纖維化的經(jīng)驗(yàn)方 “補(bǔ)腎活血方”(人參、熟地黃、山茱萸、黃芪、麥冬、五味子、當(dāng)歸、丹參、黃芩、川貝母、虎杖、炙甘草)進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)研究。方中以人參、熟地黃為君，補(bǔ)氣益肺、滋補(bǔ)腎陰；山茱萸補(bǔ)益肝腎，黃芪、麥冬健脾補(bǔ)中、補(bǔ)益肺氣、養(yǎng)陰生津，五味子上斂肺氣、下滋腎陰，四者共為臣藥；佐以當(dāng)歸、丹參活血行氣以化瘀毒，黃芩、川貝母清泄肺熱化痰、潤(rùn)肺止咳以化痰毒，虎杖、炙甘草清熱解毒、化痰止咳以祛毒熱之邪；炙甘草兼為使藥，調(diào)和諸藥。中藥復(fù)方“補(bǔ)腎活血方”具有扶助正氣、化痰祛瘀、泄?jié)峤舛局?，?duì)正氣虧虛、水津不布、瘀毒壅塞引起的痰瘀毒聚具有明顯的改善作用，在間質(zhì)纖維化的臨床應(yīng)用中具有顯著的臨床療效[16-19]。

通過測(cè)定不同濃度含藥血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的抑制情況，最終選出含藥血清的最大無毒濃度。而人胚肺成纖維細(xì)胞加入含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)COL-Ⅰ蛋白含量表達(dá)比對(duì)照組明顯降低，且具有劑量依賴性，提示含藥血清有一定降解膠原蛋白的作用或者對(duì)細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白的沉積/降解過程有一定的調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)細(xì)胞的降解膠原蛋白的能力。組間分析結(jié)果提示，考慮選定含藥血清(1/16倍)濃度為該實(shí)驗(yàn)的最佳有效濃度，即稀釋16倍的含藥血清濃度為該實(shí)驗(yàn)的最佳有效濃度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中含藥血清均應(yīng)用該濃度進(jìn)行。

B組人胚肺成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖率明顯高于A組，且B組細(xì)胞中COL-Ⅰ的蛋白表達(dá)量明顯高于A組，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，說明應(yīng)用TGF-β1作用于人胚肺成纖維細(xì)胞造模成功。

與B組比較，C組和D組細(xì)胞增殖水平降低(均P<0.01)，C組與D組之間細(xì)胞增殖率無明顯差異(P>0.05)；而E組細(xì)胞增殖水平與B組相似，兩組之間無明顯差異(P>0.05)。同時(shí)與B組比較，C組和D組細(xì)胞中膠原蛋白COL-Ⅰ的蛋白表達(dá)量均明顯降低，而E組細(xì)胞中的膠原蛋白含量較C組明顯增多。這提示含藥血清能夠明顯降低人胚肺成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的含量，其作用途徑可能與阻斷IL-17A通路有關(guān)。

在各組IL-17AmRNA表達(dá)量及IL-17A蛋白含量比較中發(fā)現(xiàn)，B組較A組IL-17AmRNA表達(dá)量及IL-17A蛋白含量明顯增多，而C組的表達(dá)量較B組明顯減少，且D組的表達(dá)量也較B組明顯減少(P<0.05)。E組與C組比較，明顯增多(P<0.05)。進(jìn)一步印證補(bǔ)腎活血方治療肺纖維化通過阻斷IL-17A通路而實(shí)現(xiàn)。

在治療肺間質(zhì)纖維化方面，臨床應(yīng)用療效確切的補(bǔ)腎活血方主要是通過阻斷IL-17A通路、降解膠原蛋白而實(shí)現(xiàn)的。許多研究發(fā)現(xiàn)，阻斷IL-17A能夠抑制Vps34(Ⅲ型磷酸肌醇3-激酶，PI3K)，進(jìn)而通過GSK3β信號(hào)通路激活抑制性蛋白Bcl-2的ser70位的磷酸化，抑制Bcl-2與Beclin-1結(jié)合，最終促進(jìn)自噬活化，增加膠原蛋白的降解。LAMP-1是溶酶體的表面標(biāo)志，通過檢測(cè)LC3+LAMP-1+ 自噬溶酶體，可評(píng)價(jià)自噬活性[20-23]。目前已在進(jìn)一步完善該實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行細(xì)胞的GSK3β信號(hào)通路及LC3自噬小體的實(shí)驗(yàn)研究，因此補(bǔ)腎活血方具體通過阻斷IL-17A的哪條信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)降解膠原蛋白，以及膠原蛋白如何進(jìn)行降解，目前正在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步予以研究和驗(yàn)證。

4 結(jié)論

補(bǔ)腎活血方能有效降解人胚肺成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的含量，具有較強(qiáng)的降纖作用，且主要是通過阻斷IL-17A通路降解膠原蛋白而起到抗纖維化作用。