馬蘭芳 曹莉莉 吳章穎 汪俊濤

1.貴陽市婦幼保健院婦產科，貴州貴陽 550001；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產科，貴州貴陽 550003

子宮內膜異位癥好發(fā)于育齡期女性，是一種常見的慢性婦科疾病，簡稱內異癥，在女性人群中，發(fā)病率約為11%[1]。臨床表現為進行性加重的痛經、不孕、性交痛、盆腔粘連等[2]。給女性帶來了極大的痛苦及經濟負擔[3]。病理表現為子宮內膜（腺體及間質）生長于子宮腔以外的部位，其發(fā)病機制尚不清楚，存在多種學說[4-6]。微RNA（microRNA，miRNA）作為轉錄后水平的重要調控小分子RNA，是一類長度為19～24 bp的非編碼內源性小分子RNA，在調節(jié)細胞周期、細胞增殖分化、新陳代謝及細胞壽命等多個生物過程中發(fā)揮重要作用[7]。研究發(fā)現，內異癥患者的異位內膜、在位內膜及血清中均存在miRNA 的差異表達[8]，且miRNA參與了內異癥的病理生理過程，并且這些miRNA有望成為內異癥診斷和治療的靶點[9-10]。近年來隨著基因芯片技術的發(fā)展和大量生物信息數據庫的建立，為研究內異癥與miRNA 之間的關系提供了新的思路與方向。本研究從GEO 數據庫下載相關miRNA 芯片數據集，從生物信息學的分析視角，探討miRNA 參與內異癥發(fā)病機制的調控網絡，尋找新的診斷和治療靶點。

1 資料與方法

1.1 miRNA 表達譜的來源

本研究從美國國立生物信息技術中心（National Center for Biotechnology information，NCBI）的GEO 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“endometriosis”和“miRNA”為關鍵詞檢索獲得原始數據集GSE105765[11]。該數據集是基于平臺GPL11154 的miRNA 表達譜。該數據集包含8 個異位內膜樣本和8 個配對的在位內膜樣本。所有樣本均采用R 語言軟件進行miRNA 差異表達分析。

1.2 差異表達的miRNA 分析

運行R 語言腳本讀取從GEO 數據庫下載的數據集，同時對數據進行歸一標準化。通過R 語言函數和limma 軟件包對標準化后的芯片表達譜進行差異分析，并使用貝葉斯方法多重檢驗校正，篩選差異表達的miRNA 以|logFC|>2 和P <0.05 作為標準。對差異表達的miRNA 進行聚類分析，使用R 語言gplots 包繪制熱圖和火山圖。選取表達倍數差異最大的前6 位miRNA 進行下一步分析。

1.3 miRNA 靶基因預測

利用在線數據庫TargetScan7.2（http：//www.targetscan.org/vert_72/）、miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）和miRDB（http：//mirdb.org/）分別預測篩選出來的6 個miRNAs 的靶基因，為了提高準確性，縮小范圍，通過在線網站Bioinformatics &Evolutionary Genomics（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制維恩圖，取交集。

1.4 靶基因的功能和通路富集分析

使用DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對篩選出的交集靶基因進行數據分析，篩選條件為P <0.05。根據GO 進行基因功能注釋富集分析，通過分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular components，CC）及生物過程（biological process，BP）進行數據分析。KEGG 對交集靶基因進行注釋，主要包括基因功能、生物途徑、細胞定位、信號通路等。

1.5 靶基因蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡分析

通過STRING 數據庫（http：//string-db.org/）、Cytoscape 軟件進行靶基因PPI 分析和模塊化分析。將靶基因導入STRING 數據庫，進行PPI 分析，繼而使用Cytoscape 軟件的degree 插件對其結果進行模塊分析，并挖掘PPI 中連接最為緊密的模塊，預測靶基因編碼蛋白之間的相互作用，同時篩選出最為關鍵基因。

2 結果

2.1 差異表達miRNA 的篩選

共篩選85 個差異表達miRNAs，與在位內膜組織比較，異位內膜組織上調的miRNA 共30 個，下調的miRNA 共55 個，并將差異表達的miRNA 可視化（圖1）。由聚類分析圖可以看出，異位內膜和在位內膜形成了明顯的聚類群。其中差異最大的前6 位分別為miR-202-5p、miR-514a-3p、miR-615-3p、miR-202-3p、miR-509-3p、miR-509-3-5p（表1）。

表1 異位內膜和在位內膜組織差異表達排名前6 位的miRNA

2.2 差異表達miRNA 的靶基因交集

在線數據庫TargetScan7.2、miRWalk 和miRDB預測miR-202-5p 的交集靶基因43 個（圖2A），miR-514a-3p 的交集靶基因194 個（圖2B），miR-615-3p的交集靶基因2 個（圖2C），miR-202-3p 的交集靶基因598 個（圖2D），miR-509-3p 的交集靶基因209 個（圖2E），miR-509-3-5p 的交集靶基因556 個（圖2F）。

圖2 三個數據庫共同預測的靶基因交集的維恩圖

2.3 靶基因GO 和KEGG 富集分析結果

使用DAVID 數據庫對1602 個靶基因進行GO功能富集分析，結果顯示，在BP 中，靶基因主要參與了Ras 蛋白信號轉導、軸突生成和轉運、神經元投射導向、促進細胞分解代謝過程等；T 細胞活化的調節(jié)、調節(jié)淋巴細胞活化、體液免疫反應等過程；在CC 方面，靶基因主要富在神經元突觸、細胞質等部位；在MF方面，靶基因主要富集在SMAD 結合、Ras GTPase 結合、mRNA 3’UTR 結合、小GTPase 結合（圖3）。KEGG 信號通路富集分析提示顯著差異基因主要富集在糖代謝途徑（圖4）。GO 和KEGG 富集分析結果提示與內異癥相關的生物學功能是軸突轉運和糖代謝途徑。

2.4 PPI 網絡樞紐基因的篩選

通過STRING 數據庫和Cytoscape 軟件對篩選得到的靶基因進行PPI 分析，篩選出排名前15 位的基因定位核心基因，分析結果顯示，6 個miRNAs 靶基因的核心調控基因主要有RAC1、EP300、EGFR、CTNNB1、PIK3CA、FYN、KRAS、CUL2、ITCH、PLK1、FBXW11、PPP2CA、ATG7、RAB5C、ANAPC10（圖5），提示RAC1、EP300、EGFR、CTNNB1 蛋白與其他蛋白作用關聯較為緊密。

圖5 靶基因PPI 網絡圖

3 討論

本研究利用數據集GSE105765 分析內異癥患者異位內膜與在位內膜差異表達的miRNA 共85 個，其中上調的miRNA 共30 個，下調的miRNA 共55 個，差異顯著表達的前6 位miRNA 分別為miR-202-5p、miR-514a-3p、miR-615-3p、miR-202-3p、miR-509-3p、miR-509-3-5p。研究發(fā)現這些miRNA 生理作用大多是在腫瘤中，miR-202-5p 通過作用其靶基因抑制卵巢癌細胞及骨肉瘤細胞的遷移和侵襲[12-13]；Jin等[14]研究提出miR-514a-3p 可以抑制腎臟腫瘤細胞的生長；Wang 等[15]在胃癌細胞的研究中發(fā)現，miR-615-3p 通過作用其靶基因CELF2 促進胃癌細胞增殖和遷移，抑制凋亡；miR-202-3p 在甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)揮抑癌作用，減少細胞的遷移和侵襲[16]；Niu 等[17]研究發(fā)現miR-509-3p 能夠增強卵巢癌對鉑類化療藥的敏感性；Zhang 等[18]在2007 年發(fā)現miR-509-3-5p可以靶向PODXL 抑制胃癌侵襲和淋巴轉移，可作為新的胃癌預后指標。由此可以推測，內異癥所具有惡性生物學行為可能是通過miRNA 介導調控的，但具體調控機制尚需基礎研究證實，該結果為研究內異癥發(fā)病機制奠定了理論基礎。

內異癥典型的臨床表現為進行性加重的痛經。內異癥疼痛的病理生理過程為逆流的內膜組織或者細胞到達腹膜表面，建立血供并侵犯周圍組織，刺激感覺神經、交感神經和副交感神經，從而出現炎癥反應性疼痛。異位內膜分泌雌二醇和前列腺素E2，前列腺素E2能夠刺激疼痛纖維，通過刺激神經生長因子和其他神經營養(yǎng)因子，增強侵襲病變的神經敏感性，刺激傷害感受器，從而導致持續(xù)性炎癥疼痛并抑制神經元凋亡[2]。GO 與KEGG 的分析結果顯示，6 個miRNAs的交集靶基因與神經軸突轉運關系密切。推測miRNA可能通過靶基因介導了內異癥的神經疼痛。如果該調控機制可以被闡釋清楚的話，可能指導研究者找到內異癥疼痛的治療靶點，為尋找內異癥疼痛的治療靶點提供了新思路。

關于內異癥的發(fā)病機制需要更深入地闡明，有待于結合遺傳學、表觀遺傳學和免疫學等方面的研究成果[1]，這需要進一步的流行病學研究及更加完善的動物模型。目前所提出的學說里，尚無提及糖代謝參與內異癥的發(fā)病機制。內異癥雖是良性疾病，但轉移、侵襲、種植等能生物學特性類似于腫瘤。研究發(fā)現糖代謝途徑參與了腫瘤代謝的重塑或異常改變[19-20]。本研究中GO 與KEGG 的分析結果顯示，靶基因與糖代謝途徑關系密切，miRNA 可能靶向這些靶基因參與調節(jié)糖代謝，從而調控內異癥的這些生物學特性。這一假設的提出，有助于推進內異癥發(fā)病機制中表觀遺傳學方向的研究，為探討更多表觀遺傳學方向提供思路，同時為基礎或臨床研究提供新方向。

靶基因PPI 網絡篩選結果顯示，RAC1 及EGFR 作用最核心，這兩種基因參與細胞的多種生物學過程[21-24]。已有研究發(fā)現，卵巢子宮內膜異位囊壁組織細胞中RAC1 呈高表達狀態(tài)，它可以通過RHOGTP 酶信號級聯反應促進卵巢子宮內膜異位囊壁組織細胞的遷移[25]。Ping 等[26]通過生物信息學分析顯示，EGFR 和RAC1同為內異癥組及對照組差異表達基因，共同參與了細胞黏附、細胞骨架調節(jié)、MAPK 細胞信號通路，且RAC1還參與了轉錄因子調控。本研究結果提示，RAC1 及EGFR 在內異癥的蛋白調控網中的作用途徑可能是通過miRNA 介導的，但具體的調控網絡需要更多的研究去闡釋。

綜上所述，本研究從生物信息學的角度，揭示了miRNA 可能通過作用靶基因參與了內異癥的病理過程。本研究分析篩選的6 個miRNAs 及其對應的靶基因發(fā)現，軸突轉運及糖代謝為主要作用方式參與了內異癥的發(fā)生，從新的視角探索了內異癥的發(fā)病機制，這些miRNA 及途徑可能成為內異癥治療的潛在靶點，具有重要臨床意義。