譚榮榮，毛迎新，黃丹娟，王紅娟，陳 勛，王友平

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心果茶分中心，湖北 武漢 430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，湖北 武漢 430064)

茶樹輪斑病是一種半知菌亞門擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)病原菌，該屬真菌是引起多種園藝植物重要病害的病原[1-3]，侵染茶樹葉片表現(xiàn)輪斑癥狀的致病菌通常指P.Theae菌，浜屋悅次等[4]報(bào)道的P.Longiseta，以后陸續(xù)報(bào)道Pestalotiopsis屬的 9 個(gè)種如P.guepinii、P.versicolor等，以及盤單毛孢屬(Monochaetia)的 1 個(gè)種M.karstenii，也同樣能侵染茶樹葉片，并引起類似癥狀，統(tǒng)稱輪斑病[5,6]。該病主要為害成葉和老葉的葉尖、葉緣或者葉片的其他部位，也為害嫩葉和嫩梢，引起大量葉片脫落，并引起枯梢，致使樹勢(shì)衰弱，產(chǎn)量大幅度下降。中國(guó)各產(chǎn)茶省均有分布，印度、斯里蘭卡、日本及肯尼亞等東非國(guó)家均有發(fā)生。高溫高濕，排水不良，扦插苗圃或者密植園濕度大時(shí)發(fā)病嚴(yán)重；機(jī)采，強(qiáng)采，修剪及蟲害嚴(yán)重的茶園，因傷口過(guò)多，有利于病菌的侵入，因而發(fā)病也重[7]。為此開展茶輪斑病菌生物學(xué)特性研究，為茶輪斑病診斷流行學(xué)和綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

茶樹病葉及室內(nèi)離體接種葉片均采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所資源圃。

1.2 試驗(yàn)方法

將采集的茶輪斑病樣本葉片用脫脂棉蘸取酒精擦拭消毒，挑取病菌生長(zhǎng)良好的葉片，用手術(shù)刀切取病健交界處0.5 cm2組織塊，用75% 酒精漂洗3次，每次45 s，用滅菌水沖洗兩次。用牙簽置于已制備的PDA培養(yǎng)皿中，每皿3個(gè)組織塊，封口后置于25℃，光照∶黑暗=16 h∶8 h，濕度為68%(培養(yǎng)箱基本條件)的人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

挑選生長(zhǎng)良好，沒(méi)有雜菌污染的初步分離的菌，用牙簽挑取菌落邊緣處菌絲，放至PDA培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)皿長(zhǎng)出菌絲后，在邊緣挑取菌絲鏡檢。

1.3 茶輪斑病生物學(xué)特性研究

1.3.1 不同pH值對(duì)茶輪斑病菌生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量的影響 用濃鹽酸和氯化鈉粉末分別配置0.1% HCL和0.1% NaCL，用膠頭滴管添加至已制備的PDA培養(yǎng)基中，分別調(diào)至所需pH值，高溫高壓滅菌。

用滅菌打孔器打取培養(yǎng)5 d的菌落邊緣直徑為0.5 cm的菌餅，分別接種至8種不同pH值(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的培養(yǎng)基上，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，封口膜封口做標(biāo)記，置于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用十字交叉法分別測(cè)量培養(yǎng)3、5和7 d的菌落直徑，第13 d測(cè)產(chǎn)孢量。

1.3.2 不同種類培養(yǎng)基對(duì)茶輪斑病菌生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量的影響 選用6種不同的培養(yǎng)基(表1)，分別為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)、PDA+茶葉煎汁培養(yǎng)基、固體查彼培養(yǎng)基(Czapek)、麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)，用滅菌打孔器打取培養(yǎng)5 d的菌落邊緣直徑為0.5 cm的菌餅，分別接種至6種不同的培養(yǎng)基上，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，封口膜封口做標(biāo)記。置于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用十字交叉法分別測(cè)量培養(yǎng)3 d、5 d 和7 d的菌落直徑，第13 d測(cè)產(chǎn)孢量。

表1 培養(yǎng)基及配方

1.3.3 不同碳源對(duì)茶輪斑病菌生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量的影響 以固體Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等質(zhì)量碳素的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，制備不同碳源培養(yǎng)基。用滅菌打孔器打取培養(yǎng)5 d的菌落邊緣直徑為0.5 cm的菌餅，分別接種至3種不同的培養(yǎng)基上，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，封口膜封口做標(biāo)記。置于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用十字交叉法分別測(cè)量培養(yǎng)3 d、5 d和7 d的菌落直徑，第13 d測(cè)產(chǎn)孢量。

1.3.4 不同氮源對(duì)茶輪斑病菌生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量的影響 以固體Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等質(zhì)量氮素的硫酸銨、磷酸二氫銨、甘氨酸置換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鈉，配制不同氮源培養(yǎng)基。用滅菌打孔器打取培養(yǎng)5 d的菌落邊緣直徑為0.5 cm的菌餅，分別接種至3種不同的培養(yǎng)基上，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，封口膜封口做標(biāo)記。置于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用十字交叉法分別測(cè)量培養(yǎng)3、5和7 d的菌落直徑，第13 d測(cè)產(chǎn)孢量。

1.3.5 不同溫度對(duì)茶輪斑病菌生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量的影響 用打孔器在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d的菌落邊緣取菌塊，菌塊直徑0.5 cm，接種至PDA培養(yǎng)基上，分別置于22、25、28、30、32℃恒溫培養(yǎng)箱中，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，封口膜封口做標(biāo)記。置于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用十字交叉法分別測(cè)量培養(yǎng)3、5和7 d的菌落直徑，第13 d天測(cè)產(chǎn)孢量。

1.3.6 不同光照條件對(duì)茶輪斑病菌生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量的影響 用打孔器在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d的菌落邊緣取菌塊，菌塊直徑0.5 cm，接種至PDA培養(yǎng)基上，分別置于全光照、12 h光暗交替、全暗條件的培養(yǎng)箱中，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，封口膜封口做標(biāo)記。置于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用十字交叉法分別測(cè)量培養(yǎng)3、5和7 d的菌落直徑，第13 d測(cè)產(chǎn)孢量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)以“M±SD”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH對(duì)茶輪斑病菌菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

茶輪斑病菌在pH為4.5～8的范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)(表2，圖1)，其中適宜pH值為5.0。培養(yǎng)7 d時(shí)，菌落最大直徑為8.67 cm。生長(zhǎng)前期，不同pH條件下，菌絲生長(zhǎng)情況差異明顯，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)差異逐步減小。在pH為7時(shí)有最大產(chǎn)孢量。不同pH值對(duì)茶輪斑病菌菌絲的密集程度有影響，pH 6～7菌絲較密集，且輪紋狀明顯，偏酸性環(huán)境下，其菌落邊緣為波浪狀，偏堿性環(huán)境對(duì)菌落形態(tài)有很大影響。

表2 不同pH條件下菌落生長(zhǎng)情況和產(chǎn)孢量

圖1 不同 pH對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響(生長(zhǎng)7天)Fig. 1 Effect of pH on colony growth in 7 d注：第1排從左至右pH值依次為4.5、5.0、5.5、6.0；第2排從左至右pH值依次為6.5、7.0、7.5、8.0。

2.2 不同培養(yǎng)基種類對(duì)茶輪斑病菌菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

茶輪斑病菌在不同培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)情況存在差異(表3、圖2)。在不同培養(yǎng)基上菌落均為乳白色，不同培養(yǎng)基菌絲密集程度不同，PDA培養(yǎng)基菌落輪紋狀生長(zhǎng)，PDA+茶汁培養(yǎng)基上菌落呈花瓣?duì)?，Czapek培養(yǎng)基上菌落呈放射狀，PSA培養(yǎng)基和OA培養(yǎng)基上菌落呈波浪狀。培養(yǎng)3 d時(shí)菌落在各種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度為：PDA >麥芽糖瓊脂> PDA+茶汁> PSA > Czapek > OA；培養(yǎng)5 d時(shí)菌落在各種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度為：PDA >麥芽糖瓊脂> PDA+茶汁、PSA> Czapek>OA；培養(yǎng)7 d時(shí)菌落在各種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度為：OA>PDA>PSA> PDA+茶汁>麥芽糖瓊脂> Czapek。其產(chǎn)孢量為：Czapek> OA> PDA+茶汁> PDA>麥芽糖瓊脂>PSA。

表3 不同培養(yǎng)基條件下菌落生長(zhǎng)情況及產(chǎn)孢量

圖2 不同種類培養(yǎng)基對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響(生長(zhǎng)7天)Fig.2 Effect of media on colony growth in 7d注：培養(yǎng)基第1排從左至右依次為PDA、PDA+茶汁和Czapek，第2排從左至右依次為PSA、麥芽糖瓊脂和OA。

2.3 不同碳源對(duì)茶輪斑病菌菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

茶輪斑病菌在含有不同碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況和產(chǎn)孢量存在差異(表4，圖3)。茶輪斑病菌在不同碳源下菌落均為乳白色，菌落不規(guī)則。碳源為葡萄糖時(shí)菌落為輪紋狀，碳源為可溶性淀粉與蔗糖時(shí)菌落為波浪狀。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，茶輪斑病菌對(duì)各種碳源均可利用，其中菌落生長(zhǎng)速度為：蔗糖>葡萄糖>可溶性淀粉。產(chǎn)孢量為：葡萄糖>蔗糖>可溶性淀粉。

圖3 不同碳源對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)的影響(生長(zhǎng)7天)Fig.3 Effect of carbon sources on colony growth in 7 d注：碳源從左到右依次為蔗糖、可溶性淀粉和葡萄糖。

2.4 不同氮源對(duì)茶輪斑病菌菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

茶輪斑病菌在含有不同氮源的培養(yǎng)基上菌落均為白色，邊緣波浪狀，菌絲生長(zhǎng)茂盛。培養(yǎng)初期，以磷酸二氫銨為氮源的菌落生長(zhǎng)速度最快(圖4)。不同氮源對(duì)輪斑病菌菌絲密集程度和菌落形態(tài)有影響。茶輪斑病菌在含有不同氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量存在差異(表5)，不同氮源培養(yǎng)過(guò)程中菌落生長(zhǎng)速度為：磷酸二氫銨>甘氨酸>硫酸銨。產(chǎn)孢量為：硫酸銨>磷酸二氫銨>甘氨酸。

圖4 不同氮源對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響(生長(zhǎng)7天)Fig.4 Effect of nitrogen sources on colony growth in 7 d注：氮源從左到右依次為硫酸銨、甘氨酸和磷酸二氫銨。

表5 不同氮源條件下菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量

2.5 不同溫度對(duì)茶輪斑病菌菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

茶輪斑病菌在不同溫度下生長(zhǎng)情況和產(chǎn)孢量存在差異(表6，圖5)，茶輪斑病菌在不同溫度下生長(zhǎng)速度快慢順序?yàn)椋?5℃>28℃>30℃>22℃>32℃，在22～30℃之間，菌絲均可生長(zhǎng)，其中最適生長(zhǎng)溫度為25～28℃，當(dāng)溫度升至32℃時(shí)菌落生長(zhǎng)速度明顯減緩。在試驗(yàn)過(guò)程中，隨著溫度的變化，產(chǎn)孢量隨之改變，其中各溫度點(diǎn)產(chǎn)孢量變化趨勢(shì)為：28℃>22℃>30℃>25℃，當(dāng)溫度升至32℃，產(chǎn)孢量為零。溫度對(duì)茶輪斑病菌菌落形態(tài)和菌絲密集程度有關(guān)，菌落均為乳白色。在28℃條件下菌落呈輪紋狀，30℃時(shí)菌落為斑點(diǎn)狀，22℃、25℃時(shí)菌落為波浪狀，32℃沒(méi)有形成菌落。

表6 不同溫度條件下菌落生長(zhǎng)情況及產(chǎn)孢量

圖5 不同溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響(生長(zhǎng)7天)Fig.5 Effect of temperatures on colony growth in 7 d注：從左到右溫度依次為22、25、28、30和32℃。

2.6 不同光照對(duì)茶輪斑病菌菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

茶輪斑病菌在不同光照條件下生長(zhǎng)情況和產(chǎn)孢量存在差異(表7，圖6)，茶輪斑病菌在不同光照條件下菌落生長(zhǎng)快慢順序?yàn)椋喝?全光照>光暗交替，全光照條件下培養(yǎng)有最大產(chǎn)孢量。各種光照條件下，茶輪斑菌菌落均為乳白色，圓形，其中全光照培養(yǎng)菌落呈波浪狀，全暗和光暗交替條件下菌落生長(zhǎng)呈花瓣?duì)睢?/p>

表7 不同光照條件下菌落生長(zhǎng)情況及產(chǎn)孢量

圖6 不同光照對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響(生長(zhǎng)7天)Fig.6 Effect of light on colony growth in 7 d注：光照從左到右依次為全光照、全暗和光暗交替。

3 討論與結(jié)論

茶輪斑病對(duì)茶樹致病程度與環(huán)境條件有著密切的關(guān)系。光照、溫度、濕度、營(yíng)養(yǎng)、酸堿度對(duì)茶輪斑病孢子和菌絲的生長(zhǎng)有很重要的影響。不同光照條件下，菌絲均可生長(zhǎng)，全光照條件下有最大產(chǎn)孢量。在22～30℃條件下，病原菌均可生長(zhǎng)，最適合的生長(zhǎng)溫度是25～28℃。28℃時(shí)有最大產(chǎn)孢量。高溫會(huì)抑制菌絲的生長(zhǎng)和孢子的萌發(fā)，當(dāng)溫度升至32℃，產(chǎn)孢量為零。pH在5～7范圍內(nèi)病原菌分生孢子均可萌發(fā)且芽管伸長(zhǎng)較好，過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境都會(huì)抑制病原菌的萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)。其中病菌生長(zhǎng)的最適pH值為6.0，當(dāng)pH為7時(shí)可達(dá)到最大產(chǎn)孢量。最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基中，且以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基適宜菌絲的生長(zhǎng)，以磷酸二氫銨為氮源的培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng)速度快。

生產(chǎn)上捋采、機(jī)械采茶、修剪、排水不良、茶樹蟲害多以及夏季扦插苗和密植的茶園易發(fā)病[8]。茶園中，茶輪斑病主要在葉片和新梢上發(fā)生，葉肉較厚、老葉更易于茶輪斑病菌的侵染，侵染初期，病健交界不明顯且呈黑褐色壞死，而且發(fā)病后病情比較嚴(yán)重。幼葉病菌侵染速度較慢，病健交界明顯，黑褐色壞死斑明顯且周圍有輕微褪綠。輪斑病在茶園內(nèi)分布特色明顯，呈聚集分布，最適合的田間分布型調(diào)查是雙對(duì)角線抽樣法[9]。最近研究顯示50%多菌靈可濕性粉劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好[10]。