王定鋒，李良德，李慧玲，李金玉，吳光遠

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福州 350013)

簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats, SSR)分子標(biāo)記，又稱為微衛(wèi)星(Microsatellite)、短串聯(lián)重復(fù)(Short Tandom Repeats)或簡單序列長度多態(tài)性(Simple Sequence Length Polymorphism)，是指生物體中以少數(shù)幾個核苷酸(通常為1～6個)為單位的多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，其具有共顯性、多態(tài)性豐富、數(shù)量多且分布均勻、易檢測和無放射性等優(yōu)點[1-2]，已成為當(dāng)前最流行的分子遺傳標(biāo)記之一。微衛(wèi)星標(biāo)記已被廣泛運用于昆蟲種群遺傳結(jié)構(gòu)、昆蟲生態(tài)習(xí)性和定位昆蟲特定基因等的研究中[3]。Kim等[4]用7個多態(tài)性SSR位點分析了來自美國9個州10個地區(qū)的595個玉米根蟲個體來研究其種群的遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，所有種群表現(xiàn)出高度的遺傳多樣性，等位基因多樣性從7.3到8.6，期望的雜合度從0.600到0.670。采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對平泉縣5個油松毛蟲亞居群進行遺傳多樣性和遺傳分化研究，結(jié)果表明天然油松純林居群內(nèi)雜合度要比其他居群高，且亞居群間已發(fā)生明顯的遺傳分化[5]。Trontti等[6]用SSR標(biāo)記分析了一夫多妻的螞蟻(Plagiolepis pygmaea)3個種群的交配、擴散模式和血緣關(guān)系。Zheng等[7]在岡比亞按蚊染色體上發(fā)現(xiàn)了3個與吞噬瘧原蟲有關(guān)的數(shù)量性狀位點(QTL)，其中一個為主效QTL，另兩個為微效的QTL。

灰茶尺蠖Ectropisgrisescens，又稱灰茶尺蛾，屬鱗翅目尺蛾科，是一種重要的茶樹害蟲，在我國主要產(chǎn)茶區(qū)均有分布。其以幼蟲咬食茶樹葉片為害，爆發(fā)成災(zāi)時能在短時間內(nèi)快速吃光整片茶園嫩葉、嫩莖和老葉，嚴重影響樹勢和茶葉的產(chǎn)量。寄主有茶、油茶等[8]。該蟲地理分布廣，利用SSR標(biāo)記來研究其不同地理種群遺傳多樣性情況具有重要的意義。盡管如此，當(dāng)前還未見從灰茶尺蠖開發(fā)出微衛(wèi)星標(biāo)記的報道。隨著新一代高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展和測序成本的大幅下降，越來越多物種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)被測序出來，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)相應(yīng)的SSR標(biāo)記的方法也越來越成熟。羅梅等利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從扶桑綿粉蚧28120條unigenes中初步發(fā)掘出1228對微衛(wèi)星引物[9]。陳小紅等[10]以6份不同地理來源的糜子資源為材料，從糜子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中開發(fā)了一批(80對)多態(tài)性好的SSR引物。黎東海等[11]從齒緣刺獵蝽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選的2395個微衛(wèi)星位點中隨機選取的54對引物對9個不同地理種群進行分析，結(jié)果表明，有16對引物能較好地擴增出目的片段。冷春蒙等[12]用MISH軟件從梨小食心蟲幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)12690個SSR位點。本研究通過對灰茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組中SSR位點進行統(tǒng)計分析，首次明確灰茶尺蠖SSR位點組成、分布和特征，大規(guī)模發(fā)掘出的SSR標(biāo)記，將為灰茶尺蠖種群生態(tài)學(xué)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試蟲RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

灰茶尺蠖采自福建省福安市社口鎮(zhèn)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗茶園(作為第1代)，于24±1℃，RH 75%，12L∶12D條件下采集新鮮茶梢室內(nèi)供養(yǎng)。將第2代茶尺蠖的卵進行收集、分離，使第2代室內(nèi)供養(yǎng)昆蟲在卵期保持同步。試驗設(shè)置5個處理，處理1(卵塊)、處理2(1、2和3齡幼蟲混合樣，每個齡期5頭)、處理3(4和5齡幼蟲混合樣，每個齡期5頭)、處理4(蛹，雌雄各5頭)和處理5(成蟲，雌雄各5頭)，每個處理2次重復(fù)。取樣后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

利用EastepTMTotal RNA Extraction Kit(Promega公司)提取總RNA，RNA樣品檢測由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成，利用1%瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop超微量分光光度計和安捷倫2100生物分析儀，分別檢測RNA的降解程度及是否有污染情況、檢測RNA 的純度、濃度和完整性。結(jié)果符合建庫后委托北京諾禾致源科技股份有限公司進行cDNA文庫構(gòu)建以及Illumina HiSeq 4000測序。

1.3 SSR位點鑒定

采用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html，默認參數(shù))對獲得的灰茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行SSR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰茶尺蠖總RNA質(zhì)量的檢測

總RNA電泳圖中可以看出28S和18S條帶完整清晰，表明獲得的RNA質(zhì)量良好，未發(fā)生降解和污染(圖1)。RNA 的純度、濃度以及RNA的完整性檢測結(jié)果顯示，OD260/OD280為2.06～2.17，OD260/OD230為1.84～2.27，RNA完整性為7.80～9.40(表1)。以上結(jié)果表明，獲得的總RNA符合建庫要求。

圖1 灰茶尺蠖總RNA的瓊脂糖電泳檢測圖Fig.1 Agarose electrophoresis of total RNA in E. grisescens注：M:Trans 2K Plus；1-10分別為樣品卵-1、卵-2、幼蟲小-1、幼蟲小-2、幼蟲大-1、幼蟲大-2、蛹-1、蛹-2、成蟲-1和成蟲-2。

表1 灰茶尺蠖總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果

2.2 灰茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組中SSR的數(shù)量

對灰茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組測序denovo組裝，總共獲得66468條unigenes，N50為2143bp，注釋出37483個基因，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)未發(fā)表。利用MISA軟件對灰茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組66468條unigenes的進行檢索，檢測堿基85225911bp，共找到18339個SSR位點，出現(xiàn)頻率(出現(xiàn)頻率=SSR數(shù)目/總unigenes數(shù)目×100%；)為27.59%，平均每4.65 kb有一個SSR位點。18339個SSR位點分布在13465條unigenes中，分布頻率(發(fā)生頻率=含有SSR的unigenes數(shù)目/總unigenes數(shù)目×100%)為20.26%；其中，3217條unigene包含有1個以上SSR位點，1188條unigene具有復(fù)合型SSR。

2.3 SSR基元分布特點

灰茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型豐富，包含1～6種核苷酸重復(fù)類型；出現(xiàn)頻率大小依次是單核苷酸(68.14%)>二核苷酸(16.25%)>三核苷酸(13.40%)>四核苷酸(1.82%)>五核苷酸(0.23%)>六核苷酸(0.14%)(表2)?；也璩唧掇D(zhuǎn)錄組中18339個SSR位點中共發(fā)現(xiàn)84種重復(fù)基元。在單核苷酸重復(fù)里包含A/T和C/G兩種類型，其中A/T為主要類型，占了總量的65.47%。二核苷酸重復(fù)里包含AC/GT、AG/CT、AT/AT和CG/CG 4種類型，其中AT/AT為主要類型，占了總量的4.86%。三核苷酸重復(fù)里包含AAC/GTT、AAG/CTT和AAT/ATT等10種類型，其中CCG/CGG為主要類型，占了總量的3.44%。四核苷酸重復(fù)里包含AAAC/GTTT、AAAG/CTTT和AAAT/ATTT等24種類型，其中ACAG/CTGT為主要類型，占了總量的0.68%。五核苷酸重復(fù)里包含AAAAC/GTTTT、AAAAT/ATTTT和AAACG/CGTTT等23種類型，其中AAATG/ATTTC為主要類型，占了總量的0.04%。六核苷酸重復(fù)里包含AAAAAC/GTTTTT、AAAAAT/ATTTTT和 AACGCC/CGTTGG等21種類型，其中CCCGCG/CGCGGG為主要類型，占了總量的0.02%(表3)。灰茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布在5～91次之間。其中5～9次重復(fù)的有5236個SSRs，占28.55%；10～14次重復(fù)的有11659個SSRs，占63.57%；15及以上次重復(fù)的有1444個SSRs，占7.87%(圖2)。

表2 基于重復(fù)單元數(shù)目中SSRs在灰茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組中的出現(xiàn)頻率

圖2 SSRs重復(fù)次數(shù)分布Fig.2 Distribution of numbers of repeated SSRs

表3 基于基序類型中SSRs在灰茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組中的出現(xiàn)頻率

(接表3)

(接表3)

3 討論與結(jié)論

大量研究表明，不同物種中SSR出現(xiàn)頻率與物種特異性、數(shù)據(jù)庫大小和SSR搜索標(biāo)準等存在較大關(guān)系[13-15]。本研究從灰茶尺蠖中共找到18339個SSR位點，出現(xiàn)頻率為27.59%。SSR出現(xiàn)頻率與星天牛(25.31%)[14]相當(dāng)，低于大墊尖翅(44.17%)[16]，但遠高于東方粘蟲(11.50%)[15]、荔枝蒂蛀蟲(15.25%)[17]、黑翅土白蟻(9.98%)[18]、扶桑綿粉蚧(6.33%)[9]、煙粉虱(5.07%)[19]和橘小實蠅(4.23%)[20]。

前人研究表明，存在大量短重復(fù)基序的物種具有相對較高進化水平[21]，而長重復(fù)基序占優(yōu)勢的物種往往突變頻率較低或進化時間較短[22]。本研究結(jié)果表明，灰茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)類型豐富，其中最主要重復(fù)類型是單核苷酸重復(fù)(68.14%)，這與東方粘蟲[15]、扶桑綿粉蚧[9]等研究結(jié)果一致；但不同于橘小實蠅[20]、褐飛虱[23]和二點委夜蛾[24]等昆蟲中SSR主要的重復(fù)類型是三核苷酸重復(fù)。灰茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組中短重復(fù)基序(單核苷酸重復(fù)占68.14%，二核苷酸16.25%，三核苷酸13.4%)占絕對優(yōu)勢，表明其處于較高的生物分類階層中，具有較高的進化水平。

在灰茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組中挖掘SSR標(biāo)記發(fā)現(xiàn)單堿基重復(fù)基元中，優(yōu)勢重復(fù)基元為A/T(65.47%)，遠遠超過其它重復(fù)類型。該結(jié)果與其它多種昆蟲如扶桑綿粉蚧[9]、印度谷螟[27]和褐飛虱[28]等的研究結(jié)果相似；這一現(xiàn)象也符合前人研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)物種的SSR重復(fù)基序中A/T發(fā)生較普遍，而G/C一般頻率低。這可能與打破A/T的2個氫鍵較打破G/C的3個氫鍵容易有關(guān)[25-26]。