肖仔君,鐘瑞敏,陸偉東,張吉剛,林麗芳
(1.韶關(guān)學(xué)院 英東食品學(xué)院,廣東 韶關(guān) 512005;2.韶關(guān)學(xué)院 化學(xué)與土木工程學(xué)院,廣東 韶關(guān) 512005;3.麗珠集團利民制藥廠,廣東 韶關(guān) 512028;4.韶關(guān)市紫背桃源生態(tài)科技有限公司,廣東 韶關(guān) 512000)
柚子是柑橘類果實的一種,因其風(fēng)味獨特,營養(yǎng)豐富,香味清爽,口感酸甜涼潤,備受廣大消費者的喜愛.廣東省韶關(guān)市地處粵北山區(qū),土壤肥沃,具有悠久的柚子種植歷史,柚子品種繁多.其中長壩沙田柚因含糖量高,風(fēng)味濃郁,在全國各地頗受歡迎.據(jù)統(tǒng)計,目前長壩沙田柚的年產(chǎn)量已超過2 萬噸,近年來其產(chǎn)量也以每年約10%幅度增加[1].因此,發(fā)展和完善沙田柚深加工技術(shù)十分迫切.
生產(chǎn)柚子汁是沙田柚深加工的重要途徑.但柚子汁在加工過程中,柚子中的苦味物質(zhì)主要來源于柚皮、柚囊以及苦味物質(zhì)前體的釋放.現(xiàn)有的研究結(jié)果表明,柚子汁中的苦味物質(zhì)主要為以柚皮苷、新橙皮苷等為代表的黃烷酮糖苷類化合物,和以檸檬苦素、諾米林等為代表的三萜烯類化合物[1-2].這些苦味物質(zhì)是保持產(chǎn)品特有風(fēng)味所必不可少的,但苦味過強則會影響產(chǎn)品的口感、質(zhì)量和銷售,所以柚子汁脫苦是沙田柚深加工的關(guān)鍵技術(shù).
目前柑橘類果汁中苦味物質(zhì)的脫除方法主要有化學(xué)脫苦[3]、超臨界CO2脫苦[4]、酶法脫苦[5]、樹脂脫苦[6]、吸附脫苦[7]、基因工程脫苦[8]、屏蔽脫苦[9]等方法.這幾種果汁脫苦的方法中,酶法脫苦由于具有操作簡單、作用條件溫和、專一性強、脫苦效率高等優(yōu)點而成為目前最具發(fā)展?jié)摿Φ拿摽喾椒ㄖ籟10].
柚皮苷酶是一種由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成的復(fù)合酶[11],在柑橘類果汁的加工脫苦具有重要的應(yīng)用價值.據(jù)課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)商品柚皮苷酶能對柚汁進行脫苦(脫苦率為51.5%)[12].但是商品柚皮苷酶價格較高且脫苦效率偏低.為了開發(fā)新的酶制劑,本研究通過從當?shù)罔肿又蟹蛛x出黑曲霉,并利用其產(chǎn)柚皮苷酶后將所得柚皮苷酶對長壩沙田柚柚子汁脫苦,旨在為優(yōu)化粵北地區(qū)長壩沙田柚深加工提供技術(shù)支撐,促進果農(nóng)的增收.
黑曲霉從柚子中分離純化并保藏于英東食品學(xué)院實驗室備用.長壩沙田柚采摘于韶關(guān)市金柚公司果場.柚皮苷標準品(99.8%)、二甘醇、磷酸氫二鉀、無水乙醇、硝酸鉀、檸檬酸、氫氧化鈉等化學(xué)試劑均為分析純.實驗中主要使用儀器設(shè)備有可見分光光度計(721S,上海棱光)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4,常州越新儀器制造有限公司)和pH 計(pHS-3C).黑曲霉培養(yǎng)基的配制見參考文獻[13],配置完畢后用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)其pH 為6.0.柚皮苷酶粗液,自制,酶活為300 IU/mL.
柚皮苷含量和脫苦率的測定按照參考文獻[12]進行.柚皮苷酶粗液和柚皮苷酶活力的測定:按照參考文獻[13]進行測定.
柚子汁制備流程為:
柚子→去皮→破碎→榨汁→加入果膠酶→攪勻→抽濾→離心(4 000 r/min、10 min)→原果汁.1.2.1 單因素試驗設(shè)計
1.酶解時間對脫苦效果的影響
分別取4.0 mL 柚子汁裝入6 根試管中,并向各試管中添加25%的粗酶液,在40 ℃條件下分別酶解30、60、90、120、150 和180 min,酶解結(jié)束后,測定各反應(yīng)體系中柚皮苷的含量,并計算其脫苦率.
2.酶解溫度對脫苦效果的影響
分別取4.0 mL 柚汁裝入6 根試管中,并向各試管中添加25%的粗酶液,分別在20、30、40、50、60 ℃條件下酶解90 min 后,測定各反應(yīng)體系中柚皮苷的含量,并計算其脫苦率.
3.酶液量對脫苦效果的影響
分別取4.0 mL 柚汁裝入6 根試管中,并向試管中分別添加15%、20%、25%、30%和35%的粗酶液,在40 ℃溫度條件下酶解90 min,酶解結(jié)束后測定各反應(yīng)體系中柚皮苷的含量,并計算其脫苦率.
4. pH 對脫苦效果的影響
分別取pH 為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 的柚汁4.0 mL 裝入6 根試管中,并向各試管中添加25%的粗酶液,在40 ℃溫度條件下酶解90 min,酶解結(jié)束后測定各反應(yīng)體系中柚皮苷的含量,并計算其脫苦率.
1.2.2 響應(yīng)面試驗
在單因素試驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken 的中心組合試驗設(shè)計原理,選取反應(yīng)時間(A)、反應(yīng)溫度(B)和酶液量(C)為試驗因素,以柚皮苷的脫苦率為試驗指標,設(shè)計了3 因素3 水平的響應(yīng)面分析試驗,其水平編碼表見表1.
表1 響應(yīng)面試驗因素水平表
2.1.1 酶解時間對脫苦效果的影響
酶解時間對柚汁脫苦率的影響如圖1 所示.脫苦率隨著時間的延長而提高,在酶解時間為90 min 時脫苦率達到最高值.隨著酶解時間延長,脫苦率呈逐步降低趨勢.其可能原因為酶解時間較短時,底物濃度較高,限制了酶解反應(yīng)的產(chǎn)率.隨著酶解反應(yīng)時間增加,酶與底物充分接觸,酶解反應(yīng)的速率達到最大.當酶解反應(yīng)產(chǎn)率達到最大后,導(dǎo)致果汁中其他物質(zhì)轉(zhuǎn)成后苦味物質(zhì)[14],說明柚皮苷酶的酶解反應(yīng)為可逆反應(yīng),此結(jié)果與鄧媛等人的研究結(jié)論一致[15].故本研究采用的酶解較優(yōu)時間為90 min.
圖1 酶解時間對脫苦效果的影響
2.1.2 酶解溫度對脫苦效果的影響
酶解溫度對柚汁脫苦效率如圖2 所示.脫苦率隨著溫度的升高而增大.當酶解溫度達到40 ℃時脫苦率最高.繼續(xù)升高酶解溫度,脫苦率顯著降低.其主要原因為較高的反應(yīng)溫度有利于酶與底物分子碰撞次數(shù)增加,提高酶促反應(yīng)速度.但過高的反應(yīng)溫度,將嚴重抑制柚皮苷酶活性,進而降低酶促反應(yīng)的效率,脫苦效率降低[16],故較優(yōu)酶解溫度為40 ℃.
圖2 酶解溫度對脫苦效果的影響
2.1.3 酶液量對脫苦效果的影響
酶液添加量對柚子汁脫苦效率的影響如圖3 所示.在酶液量為25%時達到最大脫苦率,隨后在隨著酶用量增加有所下降.這是可能是因為酶液量不足,柚皮苷水解不能完全,脫苦率不高;若酶液量過多,底物濃度相對降低,則反應(yīng)物與酶接觸不充分,并且酶與酶之間也會產(chǎn)生競爭性抑制[17].故較優(yōu)的酶液量為25%.
圖3 酶液量對脫苦效果的影響
2.1.4 pH 對脫苦效果的影響
本研究中柚子汁的pH 與柚皮苷酶對長壩沙田柚汁脫苦效率的關(guān)系如圖4 所示.當柚子汁的pH 值不超過4 時,柚皮苷酶對柚子汁的脫苦率隨著pH 值的升高而增大.當pH 值大于4.0 后,柚皮苷酶對柚子汁脫苦與pH 值負相關(guān).其原因主要在于pH 直接影響酶蛋白的構(gòu)象,以及影響底物和酶活性中心部位基團的解離,進而影響酶反應(yīng)的速度,甚至導(dǎo)致柚皮苷酶變性而失活[18-19].故本研究中底物酶解較適pH 為4.0.
圖4 果汁的pH 對酶法脫苦的影響
2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果
采用Design-expert 8 軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計,共產(chǎn)生了17 個試驗,其中12 個試驗為析因試驗,5個為中心試驗以估計誤差.試驗方案及結(jié)果如表2 所示.
表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及試驗結(jié)果
表2 中數(shù)據(jù)進行回歸分析,相關(guān)系數(shù)R2=0.915 1,說明響應(yīng)面(脫苦率)的變化有91.51%來源于所選變量,即反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和酶液量.因此,回歸方程可以較好的描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系,可以利用回歸方程確定最佳提取工藝條件.
2.2.2 響應(yīng)面交互及優(yōu)化
通過回歸模型預(yù)測的柚皮苷酶解工藝最佳條件為:酶解溫度為40.7 ℃,酶解時間為83.7 min,酶液量26.8%.在此條件下,脫苦率理論上可以達到70.5%,考慮到實際操作的可行性,將回歸方程得到的理論值修正為:酶解溫度為40 ℃,酶解時間為85 min,酶液量為27.5%.在此酶解條件下重復(fù)3 次試驗,平均脫苦率為70.4%,與理論值相差甚微,說明采用響應(yīng)面得到的柚皮苷酶對柚子汁脫苦的工藝參數(shù)是準確可靠.此外,本研究采用的自有黑曲酶產(chǎn)柚皮苷酶顯著高于商品柚皮苷酶(600 IU/g)對長壩沙田柚子汁脫苦率(51.5%)[12],進一步提高了柚皮苷酶用于柚子汁脫苦的經(jīng)濟性,為其工業(yè)應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ).
本文通過利用黑曲霉(從柚子中分離)的柚皮苷酶對粵北長壩柚子汁進行脫苦試驗研究.響應(yīng)面優(yōu)化研究結(jié)果表明,酶液添加量為柚子汁27.5%、酶解溫度40 ℃、柚子汁pH 值為4.0、酶解時間85 min 時,柚皮苷酶對柚子汁的脫苦率達到最大值70.4%,顯著高于商品柚皮苷酶對柚子汁的脫苦效率,為粵北長壩柚子脫苦加工生產(chǎn)提供重要技術(shù)支撐.但由于本研究所采用的是粗酶液,純化后柚皮苷酶脫苦效果仍有待于進一步研究.另外,柚子果實品種繁多,柚子中所含的苦味成分以及其含量與其栽種的環(huán)境密切相關(guān).因此,黑曲霉產(chǎn)柚皮苷酶對于不同品種的柚子脫苦效果有待進一步研究.