柳 聰，周 欣，羅進(jìn)旭，夏民權(quán)，李小萌，王 晨，蔡朝霞,,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 教育部環(huán)境食品學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蛋品加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心, 湖北武漢 430070；2.高郵市秦郵蛋品有限公司, 江蘇揚(yáng)州 225000）

我國(guó)是禽蛋生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，禽蛋產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的40%以上，已連續(xù)多年居世界第一。禽蛋是人類優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)攝取的重要來(lái)源，具有營(yíng)養(yǎng)豐富、配比均衡、價(jià)廉易得等優(yōu)點(diǎn)，尤其是蛋黃中富含卵黃免疫球蛋白（immunoglobulin Y, IgY）、卵黃高磷蛋白（phosvitin, PV）、磷脂（phospholipids, PL）等功能活性組分。IgY的結(jié)構(gòu)和功能均與哺乳動(dòng)物免疫球蛋白（immunoglobulin G, IgG）相似，可通過(guò)特異性抗原免疫雞以產(chǎn)生特異性IgY來(lái)對(duì)抗多種疾病[1]，且在藥物、功能性食品和食品保藏等領(lǐng)域均有重要應(yīng)用[2-3]。PV是蛋黃中主要的磷酸化蛋白，含有30%～50%的磷酸化絲氨酸，具有良好的表面活性[4-5]、抗氧化活性、抗癌活性和抗菌活性，PV因其高附加值而被廣泛用于化妝品、營(yíng)養(yǎng)品、食品和制藥工業(yè)[6]。PL約占蛋黃油脂總量的33%，主要由80.5%磷脂酰膽堿（phosphatidyl choline, PC）和11.7%磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PE）組成，被廣泛用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，以及食品、藥物和化妝品行業(yè)中的高效乳化劑和潤(rùn)滑劑[7-9]。

蛋黃是禽蛋中營(yíng)養(yǎng)豐富的組分，具有高蛋白和高脂質(zhì)的特點(diǎn)，蛋白和脂質(zhì)分布在漿質(zhì)和顆粒中。漿質(zhì)中含有85%的低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）和15%的IgY[4]。顆粒中有70%的高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）和16%的PV，它們通過(guò)磷鈣橋連接。從鮮蛋黃中分離和純化IgY的主要障礙是存在不溶于水的成分，如脂蛋白[10]。蛋黃中磷脂含量較高，占蛋黃質(zhì)量的16%，在IgY分離過(guò)程中可自發(fā)形成雙層納米囊泡[11-12]，是IgY純化步驟的主要障礙之一，為了解決這一問(wèn)題，可采用水稀釋法進(jìn)行分離[13-14]。目前最常用的方法有卡拉膠[10,15]、辛酸[16]、酸性蒸餾水稀釋[17]，卡拉膠的去脂效果較好，但對(duì)蛋黃顆粒部分的物質(zhì)提取有影響，不利于蛋黃的綜合利用。REN等[18]比較了各種方法對(duì)IgY的提取效果，認(rèn)為酸性條件下的水稀釋法是一種綠色環(huán)保、極具成本效益的方法。親和色譜法和離子交換色譜法可獲得高純度、低得率的IgY[19-21]。另外，單一沉淀劑如聚乙二醇[22]和硫酸銨[10,19]已用于進(jìn)一步純化IgY。盡管在這些條件下得率很高，IgY的純度約為80%。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的研究，硫酸銨和氯化鈉共同使用可以使IgY的純度提高到90%[23]。PV主要以高密度脂蛋白-卵黃高磷蛋白復(fù)合物的形式存在于不溶性組分中。己烷、氯仿、乙醚等[24-25]可提取蛋黃中殘留的脂質(zhì)，但有機(jī)溶劑殘留等問(wèn)題難以解決，進(jìn)而限制其應(yīng)用范圍[26]。為了進(jìn)一步純化PV，采用NaCl從蛋白混合物中釋放PV，后調(diào)節(jié)pH并加熱[27-29]。傳統(tǒng)的PL提取方法有很多缺點(diǎn)，超臨界二氧化碳萃取法和亞臨界丙烷萃取法已廣泛應(yīng)用于去除中性脂質(zhì)以獲得PL，這些方法不僅昂貴、難以大規(guī)模生產(chǎn)且產(chǎn)品純度很低[30-32]。目前的研究多集中在丙酮、石油醚、氯仿等多溶劑萃取體系上，但殘留的有毒化學(xué)試劑對(duì)人體有潛在危害[33]。最近，WANG等[9]發(fā)現(xiàn)用乙醇制得的PL純度和得率均較高。對(duì)蛋黃的單一蛋白或脂質(zhì)組分進(jìn)行分離純化普遍存在副產(chǎn)物多、原料利用率低等問(wèn)題，造成了極大的浪費(fèi)，而采用綠色高效的方法對(duì)蛋黃中多種活性物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合提取可有效避免此類問(wèn)題并提高蛋制品的附加值。

本文主要研究蛋黃中活性蛋白質(zhì)和磷脂的提取工藝，擬開(kāi)發(fā)一種使用綠色溶劑聯(lián)合提取IgY、PV和PL的方法，同時(shí)避免使用非食品級(jí)溶劑，能夠工業(yè)化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)蛋黃功能性成分的充分利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 湖北省武漢市洪山區(qū)九峰新躍養(yǎng)雞場(chǎng)提供；PEG 6000 分析純，上海默克化學(xué)有限公司；正己烷 色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)R250、考馬斯亮藍(lán)G250 武漢市谷歌生物有限公司；標(biāo)準(zhǔn)IgY、PV、PC、PE 美國(guó)Sigma公司；Toyopearl DEAE-650M填料 日本TOSOH公司；所有分離用試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

3-30K離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Alpha1-4LD冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司；Waters 2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；TSK-GEL G2000SWXLcolume凝膠色譜柱 日本TOSOH公司；Gel DOC 2000凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)BIO-RAD公司；Agilent 7890B氣相色譜儀、Agilent 5977A質(zhì)量選擇檢測(cè)器、DB-23毛細(xì)管柱 加拿大Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋黃生物活性化合物提取、純化工藝

1.2.1.1 工藝流程 先將蛋黃用4 ℃去離子水稀釋，離心后得到水溶性組分（water soluble fraction,WSF）和脂蛋白。首先通過(guò)鹽析從WSF提取IgY，并用PEG 6000進(jìn)一步純化。其次，用乙醇從脂蛋白中提取蛋黃油；剩余的沉淀物為PV和一些脂質(zhì)。用乙醇和乙酸乙酯作為復(fù)合溶劑，分離PV和脂類。最后，將所有蛋黃油收集在一起。再加入乙酸乙酯進(jìn)一步提取PL。提取純化工藝流程如圖1所示。

圖1 純化工藝流程Fig.1 Scheme of the purification process

1.2.1.2 IgY的提取與純化 分別將蛋黃用6、7、8、9、10、11倍體積的4 ℃去離子水稀釋，并用1 mol/L HCl將pH調(diào)至5.5，在4 ℃條件下保存過(guò)夜，經(jīng)10000 r/min，4 ℃離心15 min后得到WSF（上清液）和脂蛋白（沉淀）。采用Bradford法測(cè)定WSF中蛋白質(zhì)含量。先向WSF中加入固定濃度（1.0%）的NaCl和不同飽和度（30%、35%、40%、45%、50%）的（NH4）2SO4，優(yōu)化出最佳飽和度的（NH4）2SO4，后通過(guò)最適飽和度（35%）的（NH4）2SO4和不同濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）的NaCl得到最佳的IgY分離條件。在4 ℃下8000 r/min離心15 min后收集沉淀物，用10倍體積的去離子水溶解。通過(guò)不同濃度（8%、10%、12%、14%）的PEG 6000再次使懸浮液沉淀，以提高純度。在4 ℃、8000 r/min離心15 min后，收集沉淀物并用去離子水溶解，放入8～14 kDa透析袋中透析脫鹽，后進(jìn)行冷凍干燥。

1.2.1.3 PV的提取與純化 將1.2.1.2中的脂蛋白與乙醇以0.8（w/v）的比例均質(zhì)5 min，并在4 ℃下10000 r/min離心10 min。分別收集沉淀物A和上清液A。將沉淀物A與助溶劑（乙醇:乙酸乙酯=2:1，v/v）以1:9（w/v）的比例混合，然后在30 ℃條件下磁力攪拌90 min。通過(guò)Whatman濾紙過(guò)濾混合溶液，得到沉淀物B，所得濾液為殘留的蛋黃油。將沉淀物B以1:10（w/v）的比例懸浮在10%NaCl中，將懸浮液分成等分試樣。分別將試樣調(diào)節(jié)pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在90 ℃下磁力攪拌30 min，優(yōu)化出最佳pH；后將試樣在最適pH 5.0和不同溫度（70、75、80、85、90、95 ℃）條件下磁力攪拌30 min，得到最佳的PV分離條件。10000 r/min離心10 min，收集上清液，通過(guò)透析脫鹽，冷凍干燥后分離出PV。

1.2.1.4 蛋黃油的提取 用乙醇和乙酸乙酯以不同比例（乙醇/乙酸乙酯，v/v=1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4）處理沉淀A，確定復(fù)合溶劑（乙醇和乙酸乙酯）的比例后，沉淀A與復(fù)合溶劑的添加量在1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11（w/v）范圍內(nèi)優(yōu)化。將混合物在20 °C下磁力攪拌90 min。過(guò)濾懸浮液，在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液，除去乙醇和乙酸乙酯后得到蛋黃油1。同時(shí)，將乙醇提取的餾分上清液A在-20 ℃結(jié)晶3 h，然后在4 ℃于4000 r/min離心2 min后分離出上清液B和沉淀C。提取的乙醇餾分（上清液B）包含蛋黃油的主要部分，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40 ℃）除去乙醇，收集蛋黃油2。將剩余蛋白和部分蛋黃油組成的沉淀C轉(zhuǎn)移到30 ℃中水浴10 min，在4 ℃下4000 r/min離心2 min得到蛋黃油3。將多個(gè)提取過(guò)程得到的油脂收集在一起即為蛋黃總脂，對(duì)冷凍干燥的脂質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.2.1.5 PL的提取 將1.2.1.4中獲得的總蛋黃油溶解于不同體積（w/v=1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7）的乙酸乙酯中，并在不同溫度（0、4、-20 ℃）結(jié)晶2 h。在4 ℃下4000 r/min離心2 min后收集沉淀物，冷凍干燥。

1.2.2 SDS-PAGE分析 采用周欣[34]的實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)SDS-PAGE分析所得IgY和PV樣品。具體條件為：12%分離膠，4%濃縮膠，pH為8.6的Trisglycine電極緩沖液。當(dāng)樣品在80 V電壓下遷移到濃縮膠和分離膠界面時(shí)，調(diào)節(jié)電壓至120 V，直至樣品移動(dòng)至底部。電泳完成后，取出膠，使其在固定液（冰醋酸/乙醇/水，v/v/v=1/5/4）中固定30 min，隨后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min，最后使用脫色液（冰醋酸/乙醇/水，v/v/v=8/25/67）脫色，每小時(shí)換一次脫色液，脫色4～5次至凝膠背景顏色褪成無(wú)色。

1.2.3 純度測(cè)定 采用美國(guó)Waters 2695高效液相色譜儀，用SEC-HPLC法測(cè)定PV和IgY的純度。樣品用流動(dòng)相溶解，使?jié)舛冗_(dá)到1 mg/mL。用TSKGEL G2000SWXL柱在含有0.2 mol/L NaCl（pH7.0）的0.1 mol/L PBS中于214 nm處檢測(cè)分析PV的純度。通過(guò)TSK-GEL G3000SWXL柱在含0.05%NaN3、0.1 mol/L Na2SO4（pH6.6）的0.1 mol/L PBS中 以0.9 mL/min的速度于280 nm處檢測(cè)分析IgY的純度。高效液相色譜中IgY和PV峰面積占總峰面積的百分比即為IgY和PV的純度。PL純度測(cè)定參見(jiàn)GB/T 5537-2008中鉬藍(lán)比色法。

1.2.4 得率和產(chǎn)率的測(cè)定 IgY和PV的得率為最終樣品冷凍干燥后總質(zhì)量與原料蛋黃體積之比。蛋黃油產(chǎn)率為最終得到蛋黃油質(zhì)量與咸蛋黃中理論蛋黃油質(zhì)量之比。具體計(jì)算公式如下：

得率（mg/mL蛋黃）=最終樣品冷凍干燥后總質(zhì)量/原料蛋黃體積

式中：0.34為蛋黃中蛋黃油的理論量[35]。

1.2.5 脂肪酸成分分析 精確稱取20 mg油樣于10 mL具塞試管，加入4 mL NaOH-MeOH（0.1 mol/L）溶液，通入氮?dú)夂竺芊猓瑴u流振蕩15 s后于65 ℃水浴皂化40 min至油滴消失，冷卻后加入3 mL BF3-MeOH（14%）溶液，65 ℃加熱20 min。流動(dòng)水冷卻，加入2 mL正己烷和2 mL 0.88% NaCl溶液，渦旋15 s，3000 r/min離心5 min。取正己烷（AR）層，加少量無(wú)水硫酸鈉吸收殘余水分，氮?dú)鉂饪s后用1 mL正己烷復(fù)溶，0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行GCMS分析。

進(jìn)樣口溫度250 ℃，MS檢測(cè)器溫度280 ℃，分流比10:1，進(jìn)樣體積1 μL。升溫程序：150 ℃保持0 min，以10 ℃/min升溫至230 ℃并保持15 min。離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，溶劑延遲時(shí)間2.5 min，開(kāi)始時(shí)間3.0 min，結(jié)束時(shí)間60.0 min。脂肪酸相對(duì)含量的確定采用面積歸一化法計(jì)算。

1.2.6 薄層色譜分析 蛋黃PL提取物中含有PC、PE和少量脂肪等多種成分，參考劉穎等[36]的方法采用薄層層析法能夠有效地鑒定蛋黃PL的成分。展開(kāi)劑配比為V （氯仿）:V （甲醇）:V （水）=65:25:4。取硅膠G板活化、密閉冷卻、點(diǎn)樣、展開(kāi)，展開(kāi)10 cm左右，取出吹干，碘蒸氣顯色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010分析數(shù)據(jù)。使用SAS 9.1軟件通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）比較平均值之間的差異。P＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 IgY的提取與純化

采用水稀釋法對(duì)IgY進(jìn)行粗提取。如圖2所示，當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到1:10時(shí)，蛋白質(zhì)含量的上升趨勢(shì)減緩，可能是因?yàn)镮gY為可溶性蛋白，其表面具有有較多的親水基團(tuán)，當(dāng)其與水接觸后會(huì)迅速吸水溶解，在稀釋倍數(shù)為1:10時(shí)大多數(shù)可溶性蛋白質(zhì)已被水溶解完全，少數(shù)處于蛋黃顆粒部分的蛋白質(zhì)難以溶解，故蛋白質(zhì)含量上升減緩。

圖2 水稀釋倍數(shù)對(duì)WSF中蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of dilution times on the content of proteins in WSF

IgY是一種水溶性蛋白質(zhì)，常用鹽析法從WSF中提取。當(dāng)單獨(dú)使用（NH4）2SO4時(shí)，上清液中仍有大量IgY[19]。對(duì)不同濃度（NH4）2SO4和NaCl組合對(duì)IgY粗提效率的影響進(jìn)行了分析。如圖3A所示，當(dāng)NaCl濃度為1.0%，（NH4）2SO4的濃度由30%增加到50%時(shí)，提取過(guò)程中IgY的純度顯著下降（P＜0.05），而得率則呈相反趨勢(shì)。圖3B顯示，1.0% NaCl與固定濃度（35%飽和度）（NH4）2SO4相結(jié)合時(shí)，IgY的純度最低。而當(dāng)NaCl濃度增加至1.0%（w/v）時(shí)，IgY的得率最高。之后隨著NaCl濃度的增加，IgY的得率緩慢下降。這一現(xiàn)象可能是由于高鹽濃度下其他蛋白質(zhì)的共沉淀作用導(dǎo)致的，這與AKITA等[17]的結(jié)果一致。綜合考慮純度和得率，選擇35%飽和（NH4）2SO4和0.5% NaCl（w/v）組合從蛋黃中粗提IgY。有研究表明在20%飽和（NH4）2SO4和15% NaCl（w/v）條件下，IgY的純度和產(chǎn)率分別提高到98.7%和80.9%。NaCl濃度為0.16 mol/L（0.94%）～1.5 mol/L（8.8%）時(shí)，漿質(zhì)蛋白抑制了蛋黃顆粒的分離效果，加入高濃度的NaCl有利于IgY的沉淀[23]，而本研究在提取IgY過(guò)程中NaCl的使用量大大降低。

圖3 （NH4）2SO4濃度（A）和NaCl濃度（B）、PEG 6000濃度（C）對(duì)IgY純度和得率的影響Fig.3 Effect of the concentrations of （NH4）2SO4 （A）, NaCl（B） and PEG 6000 （C） on the purity and yield of IgY

采用PEG 6000（w/v）純化IgY的結(jié)果如圖3C所示。當(dāng)PEG 6000濃度為8%時(shí)，IgY的純度最高，得率最低，純度和得率分別為97.38%和6.15 mg/mL蛋黃。由圖4A可以看出，在用35%（NH4）2SO4和1.0%氯化鈉（w/v）沉淀后，泳道3中在33 kDa附近仍然存在大量蛋白質(zhì)，但用8% PEG 6000（w/v）進(jìn)一步處理后，泳道4中的雜蛋白明顯減少，表明PEG 6000有助于IgY的有效分離。HPLC結(jié)果（圖4B）顯示，鹽析后IgY的純度為87.46%，經(jīng)過(guò)PEG沉淀后純度提高到97.38%，表明鹽析和PEG的組合可有效純化IgY。

圖4 純化IgY樣品的SDS-PAGE圖譜（A）和HPLC圖譜（B）Fig.4 Diagram of SDS-PAGE （A） and HPLC （B） of purified IgY sample

2.2 PV的提取條件選擇

沉淀物B中PV主要通過(guò)磷鈣橋以卵黃高磷蛋白-高密度脂蛋白復(fù)合物的形式存在[7]。10% （w/v）NaCl通常用于破壞HDL和PV之間的磷鈣橋[28,37]。本文研究了pH對(duì)PV提取的影響。結(jié)果如表1所示，在pH5.0條件下，分離效果最好（PV純度為78.63%±0.88%，得率為10.17±0.29 mg/mL），這與REN等[38]的研究結(jié)果一致。當(dāng)pH為5.0時(shí)，部分HDL析出，而PV仍存在于上清液中。隨著pH逐漸升高，偏離等電點(diǎn)，分子間靜電斥力增加，溶解度升高，故上清液中HDL含量增加，使得PV的分離效果下降。

PV有較好的耐熱性，極易溶于水，因此將鹽析和加熱處理結(jié)合可提高其純度[27,37]。由表1可知，當(dāng)溫度從70 ℃升至80 ℃，PV純度由66.47%±4.01%顯著提高到78.08%±0.16%（P＜0.05）。而隨著溫度由80 ℃升至95 ℃，PV純度保持穩(wěn)定，90 ℃時(shí)PV的純度最高。主要是因?yàn)殡S溫度升高，部分雜蛋白逐漸變性析出，從而提高了PV純度。

表1 pH和溫度對(duì)PV純度的影響Table 1 Effects of pH and temperature on the purification of PV

由圖5A可以看出，泳道2上的PV樣品與泳道1上的PV標(biāo)準(zhǔn)品基本一致，與JIANG等[38]的結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)HPLC分析（圖5B），所得PV的純度為78.72%，得率為10.14 mg/mL。

圖5 純化PV樣品的SDS-PAGE圖譜（A）和HPLC圖譜（B）Fig.5 Diagram of SDS-PAGE （A） and HPLC （B） of purified PV sample

2.3 蛋黃油的提取條件選擇

鑒于蛋黃油由極性脂質(zhì)和非極性脂質(zhì)組成，因此本研究選擇極性和非極性溶劑（乙醇/乙酸乙酯）的組合來(lái)更好地提取沉淀A中的剩余脂質(zhì)。圖6A表明，乙醇/乙酸乙酯比例為1:2（v/v）時(shí)產(chǎn)率最高，主要原因是蛋黃油含有約62%的中性脂質(zhì)和33%的極性脂質(zhì)[39]。據(jù)相似相溶原理，中性脂質(zhì)在乙酸乙酯中有較好的溶解性，而PL較易溶于乙醇溶液中，因此當(dāng)乙醇與乙酸乙酯的比例達(dá)到1:2時(shí)，恰好與蛋黃油中中性脂質(zhì)與極性脂質(zhì)的比例相同，從而使蛋黃油的產(chǎn)率達(dá)到最大。如圖6B所示，在相同的添加量下，通過(guò)乙醇溶劑提取的蛋黃油的產(chǎn)率明顯低于復(fù)合溶劑。在最佳條件下，本研究中蛋黃油產(chǎn)率最高為88.09%，得率為30.10 mg/mL，高于NIELSEN用乙醇提取所得結(jié)果[40]，表明新型混合溶劑乙醇/乙酸乙酯具有較高的提取效率。KOVALCUKS等[41]采用溶劑混合物乙醇/氯仿和2-丙醇/己烷進(jìn)行蛋黃油的提取，得率分別為29.91 mg/mL和27.29 mg/mL。

圖6 蛋黃油產(chǎn)率的優(yōu)化Fig.6 The optimization of egg yolk oil yield

2.4 PL的提取條件選擇

在提取蛋黃油的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用乙酸乙酯從蛋黃總脂中沉淀出PL。乙酸乙酯是一種非極性溶劑，具有價(jià)格低廉、低毒性、易揮發(fā)等特點(diǎn)。結(jié)果表明，溫度對(duì)PL提取率的影響較大，如圖7A所示，在-20 ℃下蛋黃總脂中PL的含量（the content of PL in lipids, CPLL）為31.43%，可能是因?yàn)榈蜏貢?huì)降低PL的溶解度。而在-20 ℃下PL的純度為56.4%，遠(yuǎn)低于4 ℃和0 ℃下的純度，可能是中性脂質(zhì)在-20 ℃下共沉淀的結(jié)果。綜合考慮CPLL和純度，選擇0 ℃條件下沉淀PL。

圖7 PL提取效率的優(yōu)化Fig.7 The optimization of PL extraction efficiency

圖7 B為乙酸乙酯對(duì)CPLL和PL得率的影響。所得PL的純度（約85.94%）與乙酸乙酯濃度沒(méi)有顯著差異。隨著蛋黃油中乙酸乙酯（w/v）比例的增加，CPLL顯著增加（P＜0.05）。在0 ℃，蛋黃油/乙酸乙酯為1:6（w/v）條件下，PL樣品的純度為85.94%，CPLL為35.18%。WANG等[9]用95%乙醇提取PL，最終純度為80%，表明乙酸乙酯提取可獲得純度較高的PL。結(jié)果表明，用乙酸乙酯提取PL具有較好的效果。PL樣品的薄層色譜分析如圖7C所示，表明所獲得的PL主要由PC和PE組成，且PC占了樣本的大部分。

2.5 脂肪酸組成分析

進(jìn)一步對(duì)蛋黃總脂和PL中脂肪酸組成進(jìn)行氣相色譜分析，結(jié)果如表2所示。由表2可知，兩種樣品中都存在8種脂肪酸。蛋黃總脂的脂肪酸組成具有最高的油酸含量（C18:1），其次是相同比例的飽和棕櫚油酸（C16:0）。脂肪酸含量由高到低依次為：?jiǎn)尾伙柡椭舅幔╩onounsaturated fatty acid, MUFA）＞飽和脂肪酸（saturated fatty acid, SFA）＞多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid, PUFA）。PC的脂肪酸含量由高到低依次為：SFA＞MUFA＞PUFA，飽和脂肪酸含量由12.67%上升到24.41%，而總單不飽和脂肪酸含量明顯下降，可能是由于油酸（C18:1）含量的下降。PUFA/SFA比值和n-6/n-3比值都是人體營(yíng)養(yǎng)膳食的重要誘導(dǎo)因子。已有研究表明，建議膳食中PUFA/SFA的比值大于0.4，n-6/n-3的比值不大于4[42-43]。表2中的數(shù)據(jù)表明PL具有合適的PUFA/SFA比值（0.70），蛋黃總脂和PL的n-6/n-3比值分別為12.6和5.37。本方法提取的PL樣品含有豐富且平衡的脂肪酸成分，是為人類營(yíng)養(yǎng)提供平衡膳食的良好添加劑。

表2 蛋黃總脂和PL的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid compositions of total egg yolk lipids and phospholipids

3 結(jié)論

在不使用有毒溶劑的前提下，從新鮮的雞蛋黃中依次分離出IgY，PV和PL。采用了鹽析和PEG結(jié)合的新方法從WSF中純化IgY，以此獲得高得率、高純度的IgY樣品；用乙酸乙酯和乙醇作為復(fù)合溶劑，同時(shí)提取了PV和蛋黃油。在最佳條件下，PV和蛋黃油可以得到更大程度的分離；用冷凍非極性溶劑乙酸乙酯處理蛋黃總脂，得到了大量高純度的PL，且PL具有良好的PUSA/SFA比值，可作為食品工業(yè)添加劑。結(jié)果表明，本研究通過(guò)綠色高效連續(xù)分離技術(shù)能夠獲得純度、得率較高的IgY、PV和PL組分，該方法便捷、高效，在工業(yè)化生產(chǎn)中具有很大的應(yīng)用潛力。