張朝正，李 意，趙 華

（天津科技大學生物工程學院, 天津 300457）

甲殼素（Chitin）是地球上僅次于纖維素，第二豐富的生物聚合物。其來源非常廣泛，常存在于昆蟲和無脊椎動物的外骨骼和甲殼動物的殼肥料中，在食品、農業(yè)、廢水處理、紡織工業(yè)、納米技術、醫(yī)療材料等方面被廣泛使用[1-2]。但是，甲殼素由于缺乏溶解度和高度有序的晶體結構等原因，其應用受到限制。甲殼素解聚之后得到殼聚糖，殼聚糖在醫(yī)藥、化妝品、紡織印刷、食品等各個領域也都有廣泛的應用[3-4]。但是由于殼聚糖的分子量大，溶解性差和溶液黏度大等問題，限制了其在一些方面的應用，殼聚糖和甲殼素均有溶解性差且不易被人體吸收的缺點，不過殼寡糖卻克服了這些缺點[5-7]，因此開發(fā)一種成本低、可工業(yè)化和高效生產殼寡糖的工藝，是當前研究的重點。

如今，傳統(tǒng)工藝制備殼寡糖均存在過程難以控制和無特異性等缺點，且會對環(huán)境造成一定程度的污染。利用酶降解法制備殼寡糖具有污染小[8-9]、過程易控、反應條件溫和、得率高等優(yōu)點[10]，但由于目前殼聚糖酶的價格較高，因此得到一株高產殼聚糖酶的菌株是制備殼寡糖的首要任務。大量的研究已經篩選到很多可以產殼聚糖酶的菌株，但這些野生菌株的殼聚糖酶產量均偏低，難以實現(xiàn)工業(yè)生產[11-12]。如今，大量研究利用基因工程技術對不同菌株的殼聚糖酶基因進行異源表達，宿主基本為大腸桿菌和酵母[13-16]。

常溫常壓等離子體誘變（Atmospheric and Room Temperature Plasma， ARTP）是一種在大氣壓條件下，利用非平衡放電等離子體源的技術[17-18]。利用ARTP處理，DNA會被化學活性物質破壞，而非高溫、紫外線、帶電粒子或強電場[19-20]。ARTP是一種新型物理誘變技術，具有比傳統(tǒng)誘變更高的突變率[21]，多樣性誘變體和無污染等特點[18,21-24]，同時還能保持較低的處理溫度。因此，在微生物突變中的使用越來越廣泛[25-26]。

本文采用ARTP誘變野生型菌株蠟狀芽孢桿菌提高殼聚糖酶酶活，較基因工程技術具有操作簡便、突變率高、無污染等優(yōu)點，是一種新型的物理誘變技術。本研究通過測其生長曲線先確定蠟狀芽孢桿菌對數期中后期的時間，再測定ARTP的最佳致死率時間，對蠟狀芽孢桿菌進行誘變，篩選酶活提高的菌株。經穩(wěn)定性驗證后，再通過電鏡觀察誘變菌株的形態(tài)變化，為以后的實際應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷酸氫二鉀、氯化鈉、葡萄糖 分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；吐溫-80 分析純，天津市大茂化學試劑廠；酵母浸粉 生物試劑，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀、硫酸鎂 分析純，天津市化學試劑一廠；蛋白胨 生物試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司；酒石酸鉀鈉 分析純，天津市百世化工有限公司；亞硫酸鈉、3,5-二硝基水楊酸溶液 化學純，國藥集團化學試劑有限公司；苯酚 分析純，天津市光復精細化工研究所。

ARTP-II常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng) 北京思清源生物科技有限公司；Bioscreen-C全自動生長曲線分析儀 芬蘭OY Growth Curves；場發(fā)射掃描電子顯微鏡， FEI Apreo HIVac，Czech；ELX800酶標儀基因有限公司；ZWYR-D2401恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 培養(yǎng)基和溶液

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 為6.5，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉16 g/L，葡萄糖11.5 g/L，吐 溫-80 1.2 g/L，K2HPO41.4 g/L，MgSO4·7H2O 1.2 g/L， KH2PO40.6 g/L，NaCl 5 g/L，pH為 6.5,121 ℃滅菌20 min。

1% 膠體殼聚糖溶液：量取1 g殼聚糖粉末（脫乙酰度≥90%）于燒杯中，取20 mL蒸餾水倒入燒杯，室溫靜置2 min使其溶脹，然后倒入30 mL 0.2 mol/L的醋酸溶液中，攪拌至透明后，再加入0.2 mol/L的醋酸鈉溶液，調節(jié)pH至5.5，再用蒸餾水定容至100 mL。

3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：甲液：稱取 6.9 g結晶苯酚溶解于 15.2 mL 10%的 NaOH 溶液中，稀釋至 69 mL，在此溶液中加入 6.9 g亞硫酸鈉。乙液：稱取 255.0 g 酒石酸鉀鈉，加到 300 mL 10%的NaOH 溶液中，再加入 1% 的3,5-二硝基水楊酸溶液880 mL。將甲乙溶液混合，棕色瓶中室溫下暗處放置一周后使用。

As為內參物對照品s的峰面積，Cs為內參物對照品s的質量濃度，Ai為某待測成分對照品i的峰面積，Ci為某待測成分對照品i的質量濃度

1.3 實驗方法

1.3.1 蠟狀芽孢桿菌生長曲線的測定 為得到處于對數生長中后期的菌株種子發(fā)酵液，將保藏在天津科技大學微生物菌種保藏管理中心，編號為：TCCC 150018 的蠟狀芽孢桿菌接種到50 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔1 h，測定種子液的OD600nm。

1.3.2 菌懸液的制備 將在4 ℃冰箱平板上保存的菌株活化后，再接入50 mL種子培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)6 h，在8000 r/min條件下，離心5 min，去除上清液，收集菌體，生理鹽水清洗2～3次后，再用生理鹽水稀釋菌液濃度為106～108CFU/mL，用平板計數法測定菌液濃度。

1.3.3 菌株誘變 吸取10 μL 1.3.2所制菌液，均勻涂于載片表面，利用無菌鑷子將載片放于ARTP系統(tǒng)操作室的旋轉臺上的對應孔位，調整照射距離2 mm，氣流量10 L/min，輸出功率為100 W，進行誘變，分別處理0、10、20、30、40、50、60和70 s，誘變結束后，將載片放置于裝有1 mL無菌生理鹽水的1 mL離心管中，劇烈振蕩，將菌液洗脫下來，稀釋適當的倍數，分別取200 μL涂布于種子液固體培養(yǎng)基上，每個梯度做三個平行，進行活菌計數，計算致死率，并獲取致死曲線，致死率公式如下[27]：

式（1）中：T為ARTP處理0 s時的菌落數（未處理的的總菌落數）；A為ARTP處理后存活的菌落數。

1.3.4 誘變菌株的篩選 根據致死率曲線選擇最佳照射時間進行試驗[28]，將誘變后的菌液載片置于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中搖勻，接于兩塊100孔微孔板中，每孔接200 μL，將微孔板置于全自動生長曲線分析儀中[29]，培養(yǎng)48 h，選擇OD600nm差值大的微孔，吸取100 μL，按照1.3.5所示的方法測量所選擇微孔的酶活，得到酶活/OD600nm較高的孔。

將酶活較高的微孔中剩余的100 μL菌液，均勻涂布于種子培養(yǎng)基的平板上，30℃培養(yǎng)24 h，再根據平板上菌落的形態(tài)大小，挑選一些單個菌落保存，然后對所挑選菌株，再次進行酶活驗證實驗，利用發(fā)酵培養(yǎng)基，160 r/min，30 ℃搖瓶培養(yǎng)72 h，得到高產酶活的菌株。

1.3.5 殼聚糖酶活力的測定方法 空白組：將0.9 mL緩沖液和0.1 mL上清酶液混合在沸水浴中10 min進行滅酶處理，然后加入1 mL 1%膠體殼聚糖放在35 ℃水浴15 min，

反應組：將0.9 mL緩沖液、0.1 mL上清酶液和1 mL 1%膠體殼聚糖放在35 ℃水浴15 min，然后沸水浴中10 min，

1.3.6 酶活標準曲線的繪制 蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液以8000 r/min離心5 min去除菌體，取上清液即發(fā)酵粗酶液，按照1.3.5的方法，取稀釋后的0.1 mL發(fā)酵粗酶液測定發(fā)酵液的酶活力。測量反應組和空白組OD490nm，通過計算差值，根據氨基葡萄糖標準曲線計算還原糖，再根據酶活力定義[31]，測定發(fā)酵粗酶液的酶活力，從而繪制酶活的標準曲線[32-33]。

1.3.7 穩(wěn)定性驗證實驗 將篩選得到的高產菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)6代，對該突變株進行遺傳穩(wěn)定性分析，并將各代進行相應的種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，通過比較每代殼聚糖酶酶活力變化，測定菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.8 菌株電鏡觀察 為觀察單個突變菌株和原始菌株在形態(tài)大小方面的差異，需使用電鏡觀察其形態(tài)結構。操作方法如下：將突變株和原始菌株在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，在8000 r/min下，離心5 min，收集菌體，使用無菌水清洗3 次以上，再使用25%的戊二醛固定菌體，在4 ℃冰箱中放置4 h。再使用酒精進行梯度洗脫，先使用30%、50%和70%的酒精各浸泡10 min，離心，再使用80%和90%的酒精浸泡8 min，離心，最后使用100%的酒精浸泡5 min，將菌懸液滴至蓋玻片（4～6 mm2）上，揮發(fā)干燥后，最后噴金使用電鏡觀察。

1.4 數據處理

各實驗設置三個平行，數據以“平均值±標準偏差”表示，試驗數據采用 Microsoft Excel 2019數據處理系統(tǒng)進行整理及分析。

2 結果與分析

2.1 酶活的標準曲線

根據上述1.3.5和1.3.6的方法以酶活Act為縱坐標，OD490nm值為橫坐標，繪制標準曲線，并進行回歸分析，得到如圖1所示的回歸方程和R2，R2=0.9994＞0.999，所以此回歸方程可用于測定溶液中的酶活。

圖1 酶活的標準曲線Fig.1 The standard curve of enzyme activity

2.2 蠟狀芽孢桿菌生長曲線

蠟狀芽孢桿菌的生長曲線如圖2所示， 前8 h是對數生長期，8～12 h 是生長周期的穩(wěn)定期，其中6～8 h是對數生長的中后期， ARTP誘變需要收集處于對數期中后期的菌液，6～8 h的菌液符合對數期中后期要求，因此，選擇第6 h的菌液作為ARTP實驗對象。

圖2 蠟狀芽孢桿菌生長曲線Fig.2 Growth curve of Bacillus cereus

2.3 致死率曲線

利用ARTP誘變蠟狀芽孢桿菌致死率曲線如圖3所示，隨著誘變時間的增加，菌株致死率逐漸上升。當菌株在照射時間為30 s和50 s時，出現(xiàn)致死率下降的現(xiàn)象，推斷原因可能是菌體自身的修復機制作用，使菌體修復了ARTP所造成的損傷[34]。當照射時間為60 s時，菌株的致死率達到85%左右，70 s時菌株存活率幾乎為零，有研究表明，在一定的處理條件下，孢子的致死率在70%～85%之間時[35]，正突變率較高，隨著孢子致死率的增加，正突變率逐漸降低而負突變率急劇上升，無法達到篩選優(yōu)良目的，故本實驗重點選用致死率在70%～85%菌種為篩選菌種。且在此突變率下回復性更小[36]，所以選擇60 s作為ARTP的照射時間。

圖3 致死率曲線Fig.3 Curve of lethality rate

2.4 誘變菌株的篩選

菌株發(fā)酵殼聚糖酶的產量與菌株的濃度有著密切聯(lián)系，因此在進一步誘變處理后，根據高密度培養(yǎng)所得的OD600nm值，選擇了OD600nm增加值較大的30個孔，吸取100 μL發(fā)酵液測定酶活，計算出酶活/OD600nm，并根據酶活/OD600nm的大小降序排列，如表1所示。

根據表1所示，將這30個孔中酶活/OD600nm值最大的六個孔，即202、129、115、221、113和188六個微孔，涂布于種子培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，使孢子發(fā)芽、生長并且大量繁殖菌絲體，使誘變后的菌體長得更加粗壯，活力強[37]。培養(yǎng)6 h后，在選擇的這六個孔中分別挑選菌落大小、與形態(tài)大小不同的菌株，進行酶活驗證實驗，結果如表2所示。0號菌株為原菌株，其他為所挑選的誘變之后的菌株，可以明確地看到僅有202-1一株菌株的酶活較原菌株高。經測定，ARTP誘變之前，原始菌株的酶活為8.3581 U/mL，誘變后，酶活提高到9.4606 U/mL，較原菌株酶活提高了13.19%。有研究用紫外誘變菌株，在紫外照射100 s時生產殼聚糖酶，菌株的產酶活力最高為8.92 U/mL；用DES誘變菌株處理 50 min生產殼聚糖酶，菌株殼聚糖酶活最高達到8.12 U/mL[38]?？梢园l(fā)現(xiàn)ARTP誘變可以有效地改變菌株的酶活。還有研究利用ARTP 誘變黑曲霉以提高產單寧酶的能力[39]，通過APTP 提高菌株葡萄糖氧化酶的產量[40]，這些研究可以發(fā)現(xiàn)，ARTP誘變技術還可以有效地改變不同酶的酶活。

表1 突變菌株的篩選Table 1 The mutant strains screening

表2 突變株搖瓶發(fā)酵復篩Table 2 The mutants strains in shake flask screening

2.5 突變株穩(wěn)定性分析

以防此突變株在傳代過程中發(fā)生菌株“衰退”的情況，所以進行突變穩(wěn)定性的分析。對編號202-1菌株進行傳代培養(yǎng)，用種子培養(yǎng)基斜面連續(xù)培養(yǎng)6代。將每代菌株制成種子液，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)之后，結果如圖4所示。該菌株進行傳代試驗之后，測定其酶活力，傳代 1～6 次的酶活分別為9.6345、9.2578、9.8158、9.7349、9.3157和10.1015 U/mL，這六代培養(yǎng)的平均酶活為9.643367 U/mL，波動在5%之內，由此可以看出該菌株能穩(wěn)定產酶。

由圖4可知，殼聚糖酶活力出現(xiàn)上下波動的趨勢，在第2代、第5代下降較為明顯，而在第3代、第6代明顯提高，可能是由于菌體自身的正負調控基因的修復機制[34]。篩選的編號202-1菌株，在連續(xù)傳代6次的酶活較穩(wěn)定。說明該菌株在傳代的過程中具有良好的遺傳穩(wěn)定性，從工業(yè)化生產的角度分析，該菌株可保證在生產過程中殼聚糖酶產量的穩(wěn)定性，即在相同條件下該菌株產酶性能不變。因此，編號202-1具有產酶量高，穩(wěn)定性強的特點，可用于后續(xù)的出發(fā)菌株。也有研究利用ARTP誘變對番茄枯萎病有拮抗作用的枯草芽孢桿菌，經過6次傳代，獲得番茄枯萎病高效拮抗突變株，證實該突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性[26]。因此用ARTP誘變技術對培育突變菌株具有遺傳穩(wěn)定性。

圖4 突變株遺傳穩(wěn)定性Fig.4 Genetic stability of mutant strains

2.6 菌株電鏡觀察

微生物的突變株往往伴隨菌落形態(tài)的變化[41]，圖5（a）為菌株的菌落劃線圖，圖5（b）、圖5（c）分別為原始菌株和突變菌株單個菌體的電鏡掃描圖。突變株和原始菌株的菌落形態(tài)均為圖5（a）所示，菌落形態(tài)呈白色圓形狀，表面光滑具有粘性。圖5（b）、圖5（c）所示分別為原始菌株和突變菌株的電鏡掃描圖，兩張電鏡掃描圖進行比較，單個原始菌株長4.02 μm，寬1.15 μm，單個突變菌株長5.05 μm，寬1.07 μm，突變菌株的單個菌株較原始菌株更加細長。雖然從菌落形態(tài)沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化，但是從電鏡掃描圖可看出ARTP對菌體的個體形態(tài)造成了明顯變化。研究表明，大多數的突變菌株比原始出發(fā)菌株偏大，而菌株的大小說明了突變株的生長速度[41]，突變菌株比原始菌株偏大，生長速度也較快。

圖5 蠟狀芽孢桿菌菌株形態(tài)Fig.5 Bacillus cereus strain morphology

3 結論

本研究采用 ARTP 誘變野生型菌株蠟狀芽孢桿菌提高殼聚糖酶酶活，較基因工程技術具有操作簡便，突變率高和無污染等優(yōu)點，是一種新型的物理誘變技術。本研究以生長6 h的蠟狀芽孢桿菌為基礎菌株，在ARTP誘變60 s時，其致死率可達到85%，誘變得到一株酶活提高了13.19%的菌株。然后進行酶活穩(wěn)定性驗證，經六代培養(yǎng)的平均酶活為9.643367 U/mL，波動在5%之內，表明其產酶量高，穩(wěn)定性強。最后對菌株進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)誘變菌株的個體形態(tài)發(fā)生變化，較初始菌株細長，證明菌株的生長速度變快，同時也表明酶活提高是ARTP誘變起到的作用。