李莉，朱丹丹，張鳳

1.瀘州市婦幼保健院兒科，四川 瀘州 646000；2.綿陽市第三人民醫(yī)院(四川省精神衛(wèi)生中心)，四川 綿陽 621000

2-甲基丁酰-輔酶A脫氫酶缺乏癥(2-methylbutyryl-CoA dehydrogenase deficiency，2-MBAD)是 由ACADSB基因變異引起的異亮氨酸分解代謝受損的隱性遺傳代謝性疾病，也稱短/支鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥(short/branched chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency，SBCADD)[1]。在新生兒疾病篩查開展前，多由出生后出現(xiàn)喂養(yǎng)困難、低血糖或在兒童期出現(xiàn)發(fā)育遲緩、智力障礙、癲癇、肌肉萎縮、肌張力減退、自閉癥等臨床表現(xiàn)進行檢查而確診，但隨著串聯(lián)質譜的開展，大部分患者在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前已被確診[2]。本研究對3例串聯(lián)質譜篩查時發(fā)現(xiàn)異戊?；鈮A(C5)升高患者進行基因檢測，確診為2-MBAD，并進行ACADSB基因變異分析，以明確其致病原因，為家系的遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018—2020年瀘州市婦幼保健院新生兒疾病篩查串聯(lián)質譜發(fā)現(xiàn)異戊?；鈮A(C5)升高疑似2-MBAD的3例患者，收集串聯(lián)結果及臨床資料，并對其進行遺傳代謝性疾病相關基因檢測。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 經監(jiān)護人簽署知情同意書、并經醫(yī)院倫理委員會批準后，抽取患者及其父母靜脈血2 mL，EDTA抗凝，送北京博奧醫(yī)學檢驗所，使用天根生化科技(北京)有限公司的微量樣品基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 高通量測序及Sanger測序驗證 采用探針法靶向捕獲3 877個已知的疾病基因，配合Illumina Next 500測序平臺獲得測序數(shù)據(jù)，篩選出變異位點。再用Sanger測序方法驗證患者父母。

1.2.3 變異位點的生物信息學分析 用SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster等軟件對候選點變異進行位點保守性預測、蛋白功能預測；用GnomAD、ExAC和1000Genomes數(shù)據(jù)庫對變異位點進行人群頻率注釋；用ClinVar數(shù)據(jù)庫對變異位點的致病性判讀結果進行注釋。選擇GnomAD等數(shù)據(jù)庫中東亞人群頻率低于0.01，并且位點保守性強、對蛋白結構或功能影響劇烈，ClinVar中為非良性變異，且基因對應的臨床表型與患者表型吻合的基因變異位點查閱文獻進行變異位點的致病性分析。

2 結果

2.1 臨床資料

2.1.1 病例1 男，58 d，因新生兒疾病篩查C5升高就診，患者系G2P1，足月順產，出生體質量3.3 kg，無窒息、搶救病史，患者生后精神奶量可，大小便正常。父母體健，非近親結婚，否認家族遺傳病史。查體：體質量4.1 kg，身長53 cm，頭圍39 cm。前囟1.8 cm×1.4 cm，平軟，神清，皮膚彈性可，心肺腹無異常；四肢肌力、肌張力正常，神經系統(tǒng)檢查無異常。輔助檢查：血常規(guī)、肝腎功能、心肌酶譜、電解質、血糖、血氨、血乳酸未見異常。串聯(lián)結果：C5 0.56μmol/L，C5/C2 0.04，C5/C3 0.40(第一次)；C5 0.60μmol/L，C5/C2 0.04，C5/C3 0.30(第二次)(參考范圍C5 0～0.4μmol/L，C5/C2 0～0.04，C5/C3 0～0.4)。

2.1.2 病例2 女，21 d，因新生兒疾病篩查C5升高就診，患者系G1P1，足月順產，出生體質量2.8 kg，無窒息、搶救病史，患者生后精神奶量可，大小便正常。父母體健，非近親結婚，否認家族遺傳病史。查體：體質量3.2 kg，身長51 cm，頭圍36 cm。前囟1.8 cm×1.5 cm，平軟，神清，皮膚彈性可；心肺腹無異常；四肢肌力、肌張力正常，神經系統(tǒng)檢查無異常。輔助檢查：血常規(guī)、肝腎功能、心肌酶譜、電解質、血糖、血氨、血乳酸未見異常。串聯(lián)結果：C5 7.94μmol/L，C5/C2 0.19，C5/C3 1.82(第一次)；C5 8.81μmol/L，C5/C2 0.91，C5/C3 5.99(第二次)。

2.1.3 病例3 女，44 d，因新生兒疾病篩查C5升高就診，患者系G1P1，足月順產，出生體質量3.1 kg，無窒息、搶救病史，患者生后精神奶量可，大小便正常。父母體健，非近親結婚，否認家族遺傳病史。查體：體質量4.0 kg，身長51.6 cm，頭圍38 cm。前囟1.8 cm×1.4 cm，平軟，神清，皮膚彈性可；心肺腹無異常；四肢肌力、肌張力正常，神經系統(tǒng)檢查無異常。輔助檢查：血常規(guī)、肝腎功能、心肌酶譜、電解質、血糖、血氨、血乳酸未見異常。串聯(lián)結果：C5 1.37μmol/L，C5/C2 0.14，C5/C3 0.93(第一次)；C5 1.54μmol/L，C5/C2 0.04，C5/C3 0.35(第二次)。

2.2 基因檢測結果 病例1，ACADSB基因外顯子5,c.655G＞A(p.V219M)(純合變異)，分別來自父母；病例2，ACADSB基因外顯子10，c.1165 A＞G(p.M389V)(純合變異)，分別來自父母；病例3，ACADSB基因外顯子5,c.655G＞A(p.V219M)(雜合變異)，來自母親，外顯子10,c.1165 A＞G(p.M389V)(雜合變異)，來自父親，如圖1。通過Phyre2功能軟件可知655位纈氨酸及1165位蛋氨酸位于相對保守區(qū)域，如圖2。c.655G＞A(p.V219M)及c.1165A＞G(p.M389V)位點突變沒有導致氨基酸之間的氫鍵改變，如圖3。

圖1 ACADSB基因變異測序圖(箭頭所指為變異位點)

圖2 ACADSB基因變異圖

圖3 變異位點氫鍵連接

3 討論

異亮氨酸作為支鏈氨基酸(branched-chain amino acids，BCAAs)之一，在生長、免疫、蛋白質代謝、脂肪酸代謝、葡萄糖轉運等全身生理功能中起著至關重要的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，異亮氨酸可以誘導宿主防御肽(β-防御素)的表達，從而調節(jié)宿主的先天免疫和適應性免疫，進而改善免疫系統(tǒng)，包括免疫器官、細胞和活性物質。此外，異亮氨酸可通過增加抗菌素的表達，恢復某些病原體對人和動物健康的影響[4]。異亮氨酸代謝異?？芍露喾N代謝性疾病[5]，2-MBAD就是其中之一，如圖4所示。2-MBAD是由ACADSB基因變異所致，發(fā)病率極低，目前全球發(fā)病率不詳，但在東南亞苗族和苗族后裔中較為常見，該區(qū)域發(fā)病率高達1/250～1/500，有文獻報道，我國泉州市發(fā)病率為1/30 379[1]。ACADSB基因(NG_008003.1)位于10號染色體(10q26.13)，共11個外顯子，編碼432個氨基酸的2-甲基丁酰輔酶A脫氫酶，該酶在異亮氨酸(Isoleucine)代謝途徑中發(fā)揮重要作用，該基因缺陷導致2-甲基丁酰肉堿、2-甲基丁酰甘氨酸等代謝物異常蓄積[6]。

圖4 異亮氨酸代謝

研究發(fā)現(xiàn)，苗族華人大部分2-MBAD病例無臨床癥狀，可能與其他短支鏈?；o酶A活性重疊，避免異亮氨酸有害代謝物的積累[7]，但在感染和應激情況下可能發(fā)生新生兒危象，嚴重者發(fā)生發(fā)育遲緩、智力障礙、癲癇、肌肉萎縮、肌張力減退、自閉癥等[8]。

ACADSB基因c.655G＞A(p.V219M)的變異不屬于多態(tài)性變化，發(fā)生頻率極低，目前尚無報道。該位點變異219位纈氨酸與235位苯丙氨酸之間的氫鍵沒有發(fā)生改變，但與220位的蛋氨酸形成二肽改變。有研究發(fā)現(xiàn)，纈氨酸-蛋氨酸經歷電子吸收，產生帶有SO鍵的陽離子，該陽離子可以在纈氨酸-蛋氨酸中性子上去質子化，產生的中性自由基。但蛋氨酸-蛋氨酸二肽不能產生中性自由基，因此導致2-甲基丁酰輔酶A脫氫酶活性減低[9]。

c.1165A＞G(p.M389V)為熱點變異位點，位于親水口袋中[10]，在美國威斯康星州該位點純合變異占所有變異位點中的1.3%，雜合子變異占21.8%[11]；而在中國泉州該位點變異率占所有變異位點中的33.3%[1]。該位點由蛋氨酸變異為纈氨酸，氨基酸之間的氫鍵沒有改變，但分子遺傳學分析發(fā)現(xiàn)該位點使ACADSB基因在轉錄過程中外顯子10跳躍，導致2-甲基丁酰輔酶A脫氫酶活性減低[7]。

2-MBAD的治療資料少且無統(tǒng)一的治療共識，目前治療措施以改善臨床癥狀、低蛋白飲食及補充肉堿為主，避免禁食。

綜上所述，本文3例患者在新生兒疾病篩查時發(fā)現(xiàn)串聯(lián)質譜異常，基因檢測診斷2-MBAD，予以低蛋白飲食及補充肉堿，目前尚未發(fā)生發(fā)育遲緩、智力障礙、癲癇、肌肉萎縮、肌張力減退等，但后期是否發(fā)生，需長時間追蹤隨訪。c.655G＞A(p.V219M)目前暫無報道，新變異的檢出豐富了基因變異譜，為家系的遺傳咨詢提供了依據(jù)。