薛建鋒，魏 娜，楊 淳

原代細胞是指從活體獲取組織后的首代培養(yǎng)細胞，因其性質(zhì)最符合體內(nèi)的狀態(tài)，因此在藥理藥效學、毒理學、細胞分化、細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導通路等研究中價值最大。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)主要發(fā)揮功能的細胞，而星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)膠質(zhì)細胞中功能最復(fù)雜的細胞，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中常常需要同時對這兩種細胞功能狀態(tài)進行探討。常規(guī)方法是分別對這兩種細胞進行提取培養(yǎng)，過程繁瑣，且培養(yǎng)細胞的純度有限。如果能將兩者同時提取培養(yǎng)，既可以節(jié)約時間、成本，又可滿足實驗?zāi)康男枰?。因此，本科室利用同一批實驗動物同時進行原代神經(jīng)元及原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，并對分離培養(yǎng)過程進行優(yōu)化，以達到理想的實驗結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1試劑 Neurobasal-A培養(yǎng)基、DMEM/F-12(1 ∶1)培養(yǎng)基、B27(50×)營養(yǎng)因子(Gibco公司);胎牛血清、PBS液(BI)；左旋多聚賴氨酸(PLL，Sigma公司)；木瓜蛋白酶、D-hanks液、TritonX-100、DAPI、抗熒光淬滅封片劑(索萊寶公司)；4%多聚甲醛(Biosharp公司)；免疫熒光抗體封閉劑(碧云天公司)、鼠源神經(jīng)核抗原(NeuN)抗體、FITC結(jié)合山羊抗兔抗體、兔源GFAP抗體、山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 488(武漢Proteintech公司)；兔源MAP2抗體(CST)、Cy3結(jié)合山羊抗鼠抗體(Absin公司)。

1.1.2儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、細胞計數(shù)儀、超凈工作臺、臺式放大鏡。

1.1.3主要溶劑的配制 (1)0.1 mg/mL左旋多聚賴氨酸(PLL)溶液：稱取PLL后超純水溶解，配制成1 mg/mL的母液放置于-20 ℃。包被時用超純水稀釋10倍，0.22 μm的濾器過濾備用。(2)2 mg/mL木瓜蛋白酶溶液：稱取50 mg木瓜蛋白酶粉末溶于25 mL DMEM/F-12培養(yǎng)基中，現(xiàn)配現(xiàn)用。(3) 神經(jīng)元培養(yǎng)基：Neurobasal-A培養(yǎng)基、B27、雙抗比例為97 ∶2 ∶1。(4)20%DMEM/F-12培養(yǎng)基、10%DMEM/F-12培養(yǎng)基分別為含有20%和10%胎牛血清、雙抗1%的培養(yǎng)基。

1.2 實驗動物清潔新生24 h內(nèi)的SD乳鼠(雌雄不限)，由貴州醫(yī)科大學動物房提供，合格證號[SYXK(黔)2018-0001]。

1.3 方法

1.3.1培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶的預(yù)處理 取6、12、96孔板、T25培養(yǎng)瓶進行預(yù)處理。其中12孔板預(yù)先放置細胞爬片。0.1 mg/mL PLL處理各培養(yǎng)皿，在37 ℃培養(yǎng)箱中包被過夜。第2天用無菌PBS液清洗2次，吸干水分，放入超凈臺晾干備用。

1.3.2海馬神經(jīng)元取材和培養(yǎng) (1)取出生24 h內(nèi)的SD乳鼠，75%乙醇消毒3 min，斷脊處死。剪開頸部皮膚，沿失狀線將皮膚剪開至鼻端。彎頭眼科鑷輕輕劃開矢狀縫下筋膜，然后用兩把彎頭眼科鑷沿枕骨大孔處插入，對稱撕開顱骨，暴露整個大腦皮層。將皮層放入預(yù)冷的D-hanks液中，在放大鏡下用眼科鑷沿著枕葉緩慢游離出“新月形”的海馬。將海馬體的血管剝離干凈后放入預(yù)冷的種植培養(yǎng)基中。(2)手術(shù)刀將海馬切碎，大小1 mm×1 mm×1 mm，靜置2 min棄上清液，37 °C加入2 mg/mL木瓜蛋白酶消化20 min，每5 min搖晃培養(yǎng)皿，使其充分消化。在顯微鏡下觀察組織塊上無細胞后，加入等體積胎牛血清終止消化。向培養(yǎng)皿中加入3 mL種植培養(yǎng)基，用加樣槍吹打50次，靜置1 min，吸取上清液至離心管，重復(fù)此步驟3次，棄掉剩余沉淀。將上清液放入離心機850 r/min離心5 min。棄上層液，加神經(jīng)元培養(yǎng)基10 mL，200目篩網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液。(3)吸取10 μL加入特定的計數(shù)板，用BIO-RAD TC20自動細胞計數(shù)儀計數(shù)，調(diào)整種植密度為1.5×106/mL，種植入6、12、96孔板，標記提取日期和細胞種類。培養(yǎng)4 h后，倒掉神經(jīng)元培養(yǎng)基，用不含血清的DMEM/F-12清洗1遍，加新的神經(jīng)元培養(yǎng)基，后每隔2天半量換液。(4)分別在24、48、72 h觀察細胞形態(tài)，拍照記錄。第5天用免疫熒光法鑒定12孔板細胞。第7天開始進行后續(xù)實驗。

1.3.3星形膠質(zhì)細胞取材和培養(yǎng) (1)將剩余大腦皮層放入預(yù)冷的D-hanks液中，去掉小腦、腦干，更換D-hanks液。直頭鑷和彎頭鑷配合，在冰袋上將皮層血管剔除干凈。D-hanks液漂洗1次并吸干液體。手術(shù)刀將其切為1 mm×1 mm×1 mm大小小塊，加入0.25%胰酶，放入37 ℃培養(yǎng)箱消化20 min，期間每隔5 min搖晃1次。巴氏管吸取5 mL 20%DMEM/F-12培養(yǎng)基終止消化，輕柔地吹打60次分離細胞。(2)用200目篩網(wǎng)過濾，去掉大塊組織。再加20%DMEM/F-12培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱差速貼壁20 min。自動細胞計數(shù)儀計數(shù)，調(diào)整種植密度為1×106/mL，種植進相應(yīng)的培養(yǎng)瓶。(3)梯度血清法純化：20%DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，PBS洗2遍，加入10%DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)2天。第5天，加不含血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基。第7天，用十字手搖法搖晃培養(yǎng)瓶5 min，PBS洗2遍，加10%DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，以后每2天換液，均以10%DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。選第10天細胞進行鑒定。當細胞長至培養(yǎng)瓶90%時傳代培養(yǎng)，0.125%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min。選5代以內(nèi)的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3.4神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的鑒定 (1)將12孔培養(yǎng)板中的細胞爬片用PBS浸洗2次，每次3 min。(2)用4%多聚甲醛固定爬片20 min，PBS浸洗玻片3次×3 min。(3)0.25%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20 min。(4)PBS浸洗玻片3次×3 min，用免疫抗體封閉液封閉1 h。(5)吸掉封閉液，在提取海馬神經(jīng)元的爬片上分別滴加鼠源NeuN抗體(1 ∶100)、兔源MAP2抗體(1 ∶100)，在提取大腦皮層的細胞爬片上滴加兔源GFAP抗體(1 ∶100)，4 °C孵育過夜。(6)第2天，PBST浸洗爬片3次×3 min，在海馬神經(jīng)元的爬片中分別滴加抗小鼠的Cy3結(jié)合熒光二抗和山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 488，在大腦皮層的爬片上滴加抗兔的FITC結(jié)合熒光二抗。暗盒中室溫孵育2 h，PBST浸洗3次×3 min，所有操作在暗處進行。(7)滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，PBST浸洗3次×3 min。(8)吸干爬片上的液體，用兩把鑷子將爬片夾出，置于事先滴加抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，將長有細胞的一面朝下，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞純度的計算 隨機取3個200倍視野，通過對每個視野內(nèi)NeuN和GFAP陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的比例進行分類統(tǒng)計，求平均值。

2 結(jié)果

2.1 原代神經(jīng)元的形態(tài)接種12 h后，細胞體積小，呈圓形、橢圓形、不規(guī)則形，周邊環(huán)繞光暈，少數(shù)細胞有細小短突起，多數(shù)細胞已貼壁生長。換維持培養(yǎng)基1天后，細胞部分呈聚集性增長，胞體增大，突起變長，細胞間突起有少量連接。培養(yǎng)第5、6天的神經(jīng)元體積變大、成熟飽滿，細胞質(zhì)較豐富，光暈更為明顯，神經(jīng)元突起連接密切。培養(yǎng)第7天，細胞明顯聚集，突起增多伸長，細胞之間相互連接形成致密細胞網(wǎng)(圖1)。

圖1 不同時間段海馬神經(jīng)元的形態(tài)變化：A. 24 h；B. 48 h；C.72 h；D. 第5天；E. 第6天；F. 第7天

2.2 星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)培養(yǎng)第1天，細胞背景較雜，有各種形態(tài)：梭形、圓形、不規(guī)則形，多數(shù)細胞貼壁生長，含有較多的組織碎片；第3天，細胞胞體增大，呈錐形，有數(shù)個伸長的突起，里面混有折光性強的小膠質(zhì)細胞，也有少量多突起的神經(jīng)元；第5天，細胞胞體進一步增大，突起也較大，相互連接，融合度達70%；第7天，大量細胞死亡，換液后可見剩余貼壁生長的細胞形態(tài)較為一致，細胞胞體大，有數(shù)個大的突起相互連接，同時含有少量的小膠質(zhì)細胞(圖2)。經(jīng)第1次傳代培養(yǎng)后，可觀察到細胞形狀呈不規(guī)則形，胞質(zhì)豐富，突觸較長且交錯分布，呈典型的“石子路”樣，為星形膠質(zhì)細胞。

圖2 不同時間段星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)變化：A. 第3天；B. 第5天；C. 第7天

2.3 神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的鑒定分別用細胞特異性抗體NeuN和GFAP鑒定神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，選取3個視野求得神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的純度分別為(95±0.62)%、(94±0.73)%，達到了進行后續(xù)實驗的純度要求(圖3)。

圖3 原代神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的鑒定

3 討論

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞是最重要的兩種細胞模型。常規(guī)的實驗方法是選用不同時段的乳鼠分別進行神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞的提取培養(yǎng)。提取神經(jīng)元選用胎鼠或24 h新生乳鼠[1]，個別研究也選用成年鼠；而提取星形膠質(zhì)細胞選用出生2～3天乳鼠[2]。對于同時研究神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的實驗來說，選用不同時段的乳鼠費時費力，且造成實驗動物的浪費。本實驗用24 h新生SD大鼠，實現(xiàn)了神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的同時提取，且獲得了滿意的結(jié)果。另外，將海馬和皮層分別處理，一定程度上實現(xiàn)了神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的分離，減少了后續(xù)相應(yīng)雜細胞的干擾，對于致力于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病研究的學者來說，提供了一種簡便有效的方法。但實驗過程中需要注意諸多細節(jié)均會對培養(yǎng)效果產(chǎn)生影響。

首先是培養(yǎng)組織的選擇。神經(jīng)元主要存在于大腦皮層和海馬，多數(shù)研究者用大腦皮層來提取神經(jīng)元進行培養(yǎng)，但大腦皮層組織除神經(jīng)元外，還有大量的神經(jīng)膠質(zhì)細胞、結(jié)締組織等雜細胞。如果單獨用皮層提取神經(jīng)元，需要在培養(yǎng)后期加入阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元的生長。張余等[3]的研究結(jié)果顯示阿糖胞苷雖然對神經(jīng)元產(chǎn)量及形態(tài)影響不大，但會明顯縮短神經(jīng)元的存活時間，影響長期培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率。另外有學者提出只取大腦皮質(zhì)表層2.0～3.0 mm，培養(yǎng)的細胞純度達90%以上，明顯高于取整個皮質(zhì)的，且該方法不需使用阿糖胞苷[4]，但該培養(yǎng)方法所得細胞純度有待進一步驗證。而海馬組織含有的神經(jīng)元種類比較單一，且含量多，有典型的細胞表型，因此常被用來作為提取原代神經(jīng)元的首選[5]。故本實驗中也只選擇海馬來進行原代神經(jīng)元的培養(yǎng)，結(jié)果證明海馬組織培養(yǎng)的神經(jīng)元存活率較高。另外培養(yǎng)過程中還需注意細胞的純化。一種純化神經(jīng)元的方法是使用無血清培養(yǎng)基Neurobasal+B27(NB)，該方法利用血清營養(yǎng)缺失而抑制非神經(jīng)元的生長[6]。用無血清培養(yǎng)基的方法有兩種，一種是10%DMEM/F-12種植培養(yǎng)+NB維持培養(yǎng)；另一種是直接用NB培養(yǎng)。王靜歡等[7]的研究結(jié)果表明，7天內(nèi)單純用NB獲得的神經(jīng)元純度和活性高。因此，本實驗選擇單純用NB來純化神經(jīng)元。除此之外，一些操作細節(jié)也會影響細胞存活率和活性，如提取細胞時采用的機械吹打和酶消化法。單純用機械吹打[8]、單純用酶消化法[2]、機械吹打結(jié)合酶消化法[9]均可以提取到滿意數(shù)量的細胞。需要注意的是，機械吹打時動作一定要輕柔，且分層吹打會減少細胞損傷，提高細胞存活。如果選擇酶消化法，木瓜蛋白酶作用溫和，獲得的結(jié)果較為滿意[10]。另外有實驗室采用0.125%胰酶消化20 min，而本課題組的多次對比研究發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶消化后神經(jīng)元存活率高。接種密度也會影響接種效果，接種密度太低，會導致神經(jīng)元生長緩慢，難以形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)；接種密度過高，會造成神經(jīng)元接觸抑制、爭奪營養(yǎng)，影響神經(jīng)元的發(fā)育成熟[11]。本課題組總結(jié)數(shù)次實驗得出，種植密度在106～108/mL得到的神經(jīng)元生長最為良好。

由于大腦皮層含有的膠質(zhì)細胞數(shù)量較多，星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)相對神經(jīng)元來說較為容易。其關(guān)鍵在于排除雜細胞的干擾和分離不同的膠質(zhì)細胞。通過差速離心和梯度血清法可以去除成纖維細胞和內(nèi)皮細胞，恒溫搖床法可將星形膠質(zhì)細胞與其他膠質(zhì)細胞分離，神經(jīng)元的影響可在細胞傳代后得到解決。傳統(tǒng)的恒溫搖床法[12]需要37 ℃恒溫搖床，若實驗室無此條件，則需將培養(yǎng)瓶口封閉12～24 h在培養(yǎng)箱外搖晃培養(yǎng)，此法會造成細胞的缺氧死亡。丁娟等[2]的方法較為簡單，在細胞培養(yǎng)的第7天，通過“十字手搖法”搖晃5 min，也能將星形膠質(zhì)細胞和其他膠質(zhì)細胞分離開來。本文在其基礎(chǔ)上結(jié)合其他方法[13-14]對實驗條件進行了優(yōu)化，得到純度滿意的星形細胞。此外，在實驗過程中觀察到一些因素會影響細胞純度和活性。首先是小鼠殺菌消毒時，75%乙醇浸泡時間不宜過長(<5 min)，以免導致皮層細胞壞死自融。其次在剝離大腦軟腦膜和血管時一定要盡量剝離干凈，如可將大腦皮層置于無菌濾紙上輕輕滾動1周，此時腦膜和血管會得到很好的剝離，此步在純化中意義重大。添加胰酶時，每2只乳鼠加入500 μL胰蛋白酶消化20 min。差速貼壁時間需控制在20 min，若時間過短，成纖維細胞去除效果差；時間過長，有部分星形膠質(zhì)細胞也會貼附于試管壁，造成提取細胞過少。最后，種植密度也較為重要，實驗發(fā)現(xiàn)106～108/mL的細胞密度可獲得生長良好的細胞。

總之，本課題組通過多次實驗驗證，使用同一批出生24 h乳鼠分別分離海馬與皮質(zhì)來進行原代神經(jīng)元與原代星形膠質(zhì)細胞的同時培養(yǎng)是一種節(jié)約、省時、簡便、可行的方法，所培養(yǎng)的細胞完全滿足后續(xù)實驗需求。