薛建鋒，魏 娜，楊 淳

原代細胞是指從活體獲取組織后的首代培養(yǎng)細胞，因其性質最符合體內的狀態(tài)，因此在藥理藥效學、毒理學、細胞分化、細胞凋亡、信號轉導通路等研究中價值最大。神經元是神經系統(tǒng)主要發(fā)揮功能的細胞，而星形膠質細胞是神經膠質細胞中功能最復雜的細胞，在神經系統(tǒng)疾病的研究中常常需要同時對這兩種細胞功能狀態(tài)進行探討。常規(guī)方法是分別對這兩種細胞進行提取培養(yǎng)，過程繁瑣，且培養(yǎng)細胞的純度有限。如果能將兩者同時提取培養(yǎng)，既可以節(jié)約時間、成本，又可滿足實驗目的需要。因此，本科室利用同一批實驗動物同時進行原代神經元及原代星形膠質細胞培養(yǎng)，并對分離培養(yǎng)過程進行優(yōu)化，以達到理想的實驗結果。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1試劑 Neurobasal-A培養(yǎng)基、DMEM/F-12(1 ∶1)培養(yǎng)基、B27(50×)營養(yǎng)因子(Gibco公司);胎牛血清、PBS液(BI)；左旋多聚賴氨酸(PLL，Sigma公司)；木瓜蛋白酶、D-hanks液、TritonX-100、DAPI、抗熒光淬滅封片劑(索萊寶公司)；4%多聚甲醛(Biosharp公司)；免疫熒光抗體封閉劑(碧云天公司)、鼠源神經核抗原(NeuN)抗體、FITC結合山羊抗兔抗體、兔源GFAP抗體、山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 488(武漢Proteintech公司)；兔源MAP2抗體(CST)、Cy3結合山羊抗鼠抗體(Absin公司)。

1.1.2儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、細胞計數(shù)儀、超凈工作臺、臺式放大鏡。

1.1.3主要溶劑的配制 (1)0.1 mg/mL左旋多聚賴氨酸(PLL)溶液：稱取PLL后超純水溶解，配制成1 mg/mL的母液放置于-20 ℃。包被時用超純水稀釋10倍，0.22 μm的濾器過濾備用。(2)2 mg/mL木瓜蛋白酶溶液：稱取50 mg木瓜蛋白酶粉末溶于25 mL DMEM/F-12培養(yǎng)基中，現(xiàn)配現(xiàn)用。(3) 神經元培養(yǎng)基：Neurobasal-A培養(yǎng)基、B27、雙抗比例為97 ∶2 ∶1。(4)20%DMEM/F-12培養(yǎng)基、10%DMEM/F-12培養(yǎng)基分別為含有20%和10%胎牛血清、雙抗1%的培養(yǎng)基。

1.2 實驗動物清潔新生24 h內的SD乳鼠(雌雄不限)，由貴州醫(yī)科大學動物房提供，合格證號[SYXK(黔)2018-0001]。

1.3 方法

1.3.1培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶的預處理 取6、12、96孔板、T25培養(yǎng)瓶進行預處理。其中12孔板預先放置細胞爬片。0.1 mg/mL PLL處理各培養(yǎng)皿，在37 ℃培養(yǎng)箱中包被過夜。第2天用無菌PBS液清洗2次，吸干水分，放入超凈臺晾干備用。

1.3.2海馬神經元取材和培養(yǎng) (1)取出生24 h內的SD乳鼠，75%乙醇消毒3 min，斷脊處死。剪開頸部皮膚，沿失狀線將皮膚剪開至鼻端。彎頭眼科鑷輕輕劃開矢狀縫下筋膜，然后用兩把彎頭眼科鑷沿枕骨大孔處插入，對稱撕開顱骨，暴露整個大腦皮層。將皮層放入預冷的D-hanks液中，在放大鏡下用眼科鑷沿著枕葉緩慢游離出“新月形”的海馬。將海馬體的血管剝離干凈后放入預冷的種植培養(yǎng)基中。(2)手術刀將海馬切碎，大小1 mm×1 mm×1 mm，靜置2 min棄上清液，37 °C加入2 mg/mL木瓜蛋白酶消化20 min，每5 min搖晃培養(yǎng)皿，使其充分消化。在顯微鏡下觀察組織塊上無細胞后，加入等體積胎牛血清終止消化。向培養(yǎng)皿中加入3 mL種植培養(yǎng)基，用加樣槍吹打50次，靜置1 min，吸取上清液至離心管，重復此步驟3次，棄掉剩余沉淀。將上清液放入離心機850 r/min離心5 min。棄上層液，加神經元培養(yǎng)基10 mL，200目篩網過濾，制成單細胞懸液。(3)吸取10 μL加入特定的計數(shù)板，用BIO-RAD TC20自動細胞計數(shù)儀計數(shù)，調整種植密度為1.5×106/mL，種植入6、12、96孔板，標記提取日期和細胞種類。培養(yǎng)4 h后，倒掉神經元培養(yǎng)基，用不含血清的DMEM/F-12清洗1遍，加新的神經元培養(yǎng)基，后每隔2天半量換液。(4)分別在24、48、72 h觀察細胞形態(tài)，拍照記錄。第5天用免疫熒光法鑒定12孔板細胞。第7天開始進行后續(xù)實驗。

1.3.3星形膠質細胞取材和培養(yǎng) (1)將剩余大腦皮層放入預冷的D-hanks液中，去掉小腦、腦干，更換D-hanks液。直頭鑷和彎頭鑷配合，在冰袋上將皮層血管剔除干凈。D-hanks液漂洗1次并吸干液體。手術刀將其切為1 mm×1 mm×1 mm大小小塊，加入0.25%胰酶，放入37 ℃培養(yǎng)箱消化20 min，期間每隔5 min搖晃1次。巴氏管吸取5 mL 20%DMEM/F-12培養(yǎng)基終止消化，輕柔地吹打60次分離細胞。(2)用200目篩網過濾，去掉大塊組織。再加20%DMEM/F-12培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱差速貼壁20 min。自動細胞計數(shù)儀計數(shù)，調整種植密度為1×106/mL，種植進相應的培養(yǎng)瓶。(3)梯度血清法純化：20%DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，PBS洗2遍，加入10%DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)2天。第5天，加不含血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基。第7天，用十字手搖法搖晃培養(yǎng)瓶5 min，PBS洗2遍，加10%DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，以后每2天換液，均以10%DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。選第10天細胞進行鑒定。當細胞長至培養(yǎng)瓶90%時傳代培養(yǎng)，0.125%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min。選5代以內的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3.4神經元和星形膠質細胞的鑒定 (1)將12孔培養(yǎng)板中的細胞爬片用PBS浸洗2次，每次3 min。(2)用4%多聚甲醛固定爬片20 min，PBS浸洗玻片3次×3 min。(3)0.25%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20 min。(4)PBS浸洗玻片3次×3 min，用免疫抗體封閉液封閉1 h。(5)吸掉封閉液，在提取海馬神經元的爬片上分別滴加鼠源NeuN抗體(1 ∶100)、兔源MAP2抗體(1 ∶100)，在提取大腦皮層的細胞爬片上滴加兔源GFAP抗體(1 ∶100)，4 °C孵育過夜。(6)第2天，PBST浸洗爬片3次×3 min，在海馬神經元的爬片中分別滴加抗小鼠的Cy3結合熒光二抗和山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 488，在大腦皮層的爬片上滴加抗兔的FITC結合熒光二抗。暗盒中室溫孵育2 h，PBST浸洗3次×3 min，所有操作在暗處進行。(7)滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，PBST浸洗3次×3 min。(8)吸干爬片上的液體，用兩把鑷子將爬片夾出，置于事先滴加抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，將長有細胞的一面朝下，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5神經元和星形膠質細胞純度的計算 隨機取3個200倍視野，通過對每個視野內NeuN和GFAP陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的比例進行分類統(tǒng)計，求平均值。

2 結果

2.1 原代神經元的形態(tài)接種12 h后，細胞體積小，呈圓形、橢圓形、不規(guī)則形，周邊環(huán)繞光暈，少數(shù)細胞有細小短突起，多數(shù)細胞已貼壁生長。換維持培養(yǎng)基1天后，細胞部分呈聚集性增長，胞體增大，突起變長，細胞間突起有少量連接。培養(yǎng)第5、6天的神經元體積變大、成熟飽滿，細胞質較豐富，光暈更為明顯，神經元突起連接密切。培養(yǎng)第7天，細胞明顯聚集，突起增多伸長，細胞之間相互連接形成致密細胞網(圖1)。

圖1 不同時間段海馬神經元的形態(tài)變化：A. 24 h；B. 48 h；C.72 h；D. 第5天；E. 第6天；F. 第7天

2.2 星形膠質細胞的形態(tài)培養(yǎng)第1天，細胞背景較雜，有各種形態(tài)：梭形、圓形、不規(guī)則形，多數(shù)細胞貼壁生長，含有較多的組織碎片；第3天，細胞胞體增大，呈錐形，有數(shù)個伸長的突起，里面混有折光性強的小膠質細胞，也有少量多突起的神經元；第5天，細胞胞體進一步增大，突起也較大，相互連接，融合度達70%；第7天，大量細胞死亡，換液后可見剩余貼壁生長的細胞形態(tài)較為一致，細胞胞體大，有數(shù)個大的突起相互連接，同時含有少量的小膠質細胞(圖2)。經第1次傳代培養(yǎng)后，可觀察到細胞形狀呈不規(guī)則形，胞質豐富，突觸較長且交錯分布，呈典型的“石子路”樣，為星形膠質細胞。

圖2 不同時間段星形膠質細胞的形態(tài)變化：A. 第3天；B. 第5天；C. 第7天

2.3 神經元和星形膠質細胞的鑒定分別用細胞特異性抗體NeuN和GFAP鑒定神經元和星形膠質細胞，選取3個視野求得神經元和星形膠質細胞的純度分別為(95±0.62)%、(94±0.73)%，達到了進行后續(xù)實驗的純度要求(圖3)。

圖3 原代神經元和星形膠質細胞的鑒定

3 討論

在神經系統(tǒng)疾病研究中，神經元和星形膠質細胞是最重要的兩種細胞模型。常規(guī)的實驗方法是選用不同時段的乳鼠分別進行神經元與星形膠質細胞的提取培養(yǎng)。提取神經元選用胎鼠或24 h新生乳鼠[1]，個別研究也選用成年鼠；而提取星形膠質細胞選用出生2～3天乳鼠[2]。對于同時研究神經元和神經膠質細胞的實驗來說，選用不同時段的乳鼠費時費力，且造成實驗動物的浪費。本實驗用24 h新生SD大鼠，實現(xiàn)了神經元和星形膠質細胞的同時提取，且獲得了滿意的結果。另外，將海馬和皮層分別處理，一定程度上實現(xiàn)了神經元和星形膠質細胞的分離，減少了后續(xù)相應雜細胞的干擾，對于致力于神經系統(tǒng)相關疾病研究的學者來說，提供了一種簡便有效的方法。但實驗過程中需要注意諸多細節(jié)均會對培養(yǎng)效果產生影響。

首先是培養(yǎng)組織的選擇。神經元主要存在于大腦皮層和海馬，多數(shù)研究者用大腦皮層來提取神經元進行培養(yǎng)，但大腦皮層組織除神經元外，還有大量的神經膠質細胞、結締組織等雜細胞。如果單獨用皮層提取神經元，需要在培養(yǎng)后期加入阿糖胞苷抑制非神經元的生長。張余等[3]的研究結果顯示阿糖胞苷雖然對神經元產量及形態(tài)影響不大，但會明顯縮短神經元的存活時間，影響長期培養(yǎng)神經元的存活率。另外有學者提出只取大腦皮質表層2.0～3.0 mm，培養(yǎng)的細胞純度達90%以上，明顯高于取整個皮質的，且該方法不需使用阿糖胞苷[4]，但該培養(yǎng)方法所得細胞純度有待進一步驗證。而海馬組織含有的神經元種類比較單一，且含量多，有典型的細胞表型，因此常被用來作為提取原代神經元的首選[5]。故本實驗中也只選擇海馬來進行原代神經元的培養(yǎng)，結果證明海馬組織培養(yǎng)的神經元存活率較高。另外培養(yǎng)過程中還需注意細胞的純化。一種純化神經元的方法是使用無血清培養(yǎng)基Neurobasal+B27(NB)，該方法利用血清營養(yǎng)缺失而抑制非神經元的生長[6]。用無血清培養(yǎng)基的方法有兩種，一種是10%DMEM/F-12種植培養(yǎng)+NB維持培養(yǎng)；另一種是直接用NB培養(yǎng)。王靜歡等[7]的研究結果表明，7天內單純用NB獲得的神經元純度和活性高。因此，本實驗選擇單純用NB來純化神經元。除此之外，一些操作細節(jié)也會影響細胞存活率和活性，如提取細胞時采用的機械吹打和酶消化法。單純用機械吹打[8]、單純用酶消化法[2]、機械吹打結合酶消化法[9]均可以提取到滿意數(shù)量的細胞。需要注意的是，機械吹打時動作一定要輕柔，且分層吹打會減少細胞損傷，提高細胞存活。如果選擇酶消化法，木瓜蛋白酶作用溫和，獲得的結果較為滿意[10]。另外有實驗室采用0.125%胰酶消化20 min，而本課題組的多次對比研究發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶消化后神經元存活率高。接種密度也會影響接種效果，接種密度太低，會導致神經元生長緩慢，難以形成神經元網絡；接種密度過高，會造成神經元接觸抑制、爭奪營養(yǎng)，影響神經元的發(fā)育成熟[11]。本課題組總結數(shù)次實驗得出，種植密度在106～108/mL得到的神經元生長最為良好。

由于大腦皮層含有的膠質細胞數(shù)量較多，星形膠質細胞的培養(yǎng)相對神經元來說較為容易。其關鍵在于排除雜細胞的干擾和分離不同的膠質細胞。通過差速離心和梯度血清法可以去除成纖維細胞和內皮細胞，恒溫搖床法可將星形膠質細胞與其他膠質細胞分離，神經元的影響可在細胞傳代后得到解決。傳統(tǒng)的恒溫搖床法[12]需要37 ℃恒溫搖床，若實驗室無此條件，則需將培養(yǎng)瓶口封閉12～24 h在培養(yǎng)箱外搖晃培養(yǎng)，此法會造成細胞的缺氧死亡。丁娟等[2]的方法較為簡單，在細胞培養(yǎng)的第7天，通過“十字手搖法”搖晃5 min，也能將星形膠質細胞和其他膠質細胞分離開來。本文在其基礎上結合其他方法[13-14]對實驗條件進行了優(yōu)化，得到純度滿意的星形細胞。此外，在實驗過程中觀察到一些因素會影響細胞純度和活性。首先是小鼠殺菌消毒時，75%乙醇浸泡時間不宜過長(<5 min)，以免導致皮層細胞壞死自融。其次在剝離大腦軟腦膜和血管時一定要盡量剝離干凈，如可將大腦皮層置于無菌濾紙上輕輕滾動1周，此時腦膜和血管會得到很好的剝離，此步在純化中意義重大。添加胰酶時，每2只乳鼠加入500 μL胰蛋白酶消化20 min。差速貼壁時間需控制在20 min，若時間過短，成纖維細胞去除效果差；時間過長，有部分星形膠質細胞也會貼附于試管壁，造成提取細胞過少。最后，種植密度也較為重要，實驗發(fā)現(xiàn)106～108/mL的細胞密度可獲得生長良好的細胞。

總之，本課題組通過多次實驗驗證，使用同一批出生24 h乳鼠分別分離海馬與皮質來進行原代神經元與原代星形膠質細胞的同時培養(yǎng)是一種節(jié)約、省時、簡便、可行的方法，所培養(yǎng)的細胞完全滿足后續(xù)實驗需求。