龍瓊先，伍 季，彭 勇，張旭乾，廖文華

國際癌癥研究中心(IARC)的GLOBOCAN數(shù)據(jù)庫顯示，2020年前列腺癌新發(fā)病例1 414 259例，死亡病例375 304例，是全球第四大常見癌癥和男性第二大常見癌癥[1]。原鈣黏蛋白9(protocadherin 9, PCDH9)屬于非聚集型原鈣黏蛋白家族，與已證實(shí)的抑癌基因PCDH8、PCDH17、PCDH20同位于染色體13q21，可介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用，以及調(diào)節(jié)多種效應(yīng)分子，其表達(dá)缺失可引起腫瘤增殖甚至轉(zhuǎn)移[2]?，F(xiàn)有研究顯示，PCDH9在多種實(shí)體腫瘤(如膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝癌)組織中表達(dá)下降，且與腫瘤惡性程度及患者預(yù)后密切相關(guān)。一項(xiàng)研究對65例未經(jīng)治療的中國前列腺癌患者及良性配對組織進(jìn)行了全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中存在PCDH9缺失，其可以作為一個新的潛在的前列腺癌抑制基因[3]。然而，PCDH9缺失對抑制前列腺癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移的影響報(bào)道甚少，其在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)分析PCDH9在調(diào)控前列腺癌細(xì)胞周期中的作用，探討其表達(dá)缺失在抑制前列腺癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)浸潤和轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制，為明確前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018～2020年南充市中心醫(yī)院存檔的92例前列腺癌、36例良性前列腺石蠟包埋組織，所有組織常規(guī)HE染色后均經(jīng)2位以上病理專家診斷。92例前列腺癌患者年齡48～87歲，平均(64.33±5.46)歲。按照2016版前列腺癌WHO/ISUP分級分組系統(tǒng)將前列腺癌分為1～5個組別：1組8例，2組15例，3組17例，4組21例，5組31例。術(shù)前PSA≤20 ng/mL 23例，>20 ng/mL 69例。所有患者均行手術(shù)切除治療，患者術(shù)前均未行放、化療或抗雄激素等治療。

1.2 主要試劑PCDH9兔抗人抗體購自Abcam公司，STAT3、Cyclin D1和C-myc抗體均購自福州邁新公司；免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新公司。

1.3 免疫組化取石蠟包埋組織蠟塊3 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水。Multimer標(biāo)記兩步法檢測，由全自動多功能病理檢測系統(tǒng)(Benchmark GX，羅氏公司)按步驟操作。基本條件設(shè)定為：抗原修復(fù)30 min，用緩沖液沖洗，加入UV DAB inhibitor(Ultraview Universal DAB Detection Kit，羅氏公司)，37 ℃ 4 min。緩沖液沖洗，添加一抗(PCDH9、Cyclin D1和C-myc)，37 ℃ 30 min。緩沖液沖洗，加UV HRP multimer(Ultraview Universal DAB Detection Kit，羅氏公司)，37 ℃ 8 min。緩沖液沖洗，加入等體積的DAB和DAB H2O2(Ultraview Universal DAB Detection Kit，羅氏公司)，37 ℃ 8 min。緩沖液沖洗，加入UV copper(DAB試劑盒內(nèi))，37 ℃ 4 min。緩沖液沖洗，蘇木精Ⅱ核復(fù)染，37 ℃ 8 min。用緩沖液沖洗，加入Bluing Reagent，37 ℃ 4 min，緩沖液沖洗，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷組織切片由2名病理醫(yī)師重復(fù)觀察，隨機(jī)選取5個高倍鏡視野，按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～25%為2分，26%～50%為3分，51%～100%為4分；按陽性染色強(qiáng)度計(jì)分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分相加作為最終評分：≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣本率的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織和良性前列腺組織中PCDH9的表達(dá)PCDH9陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。PCDH9蛋白在前列腺癌組織中低表達(dá)，陽性率為72.8%(67/92)，顯著低于良性前列腺癌組織(100%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.157，P<0.001)(圖1A～C)。

2.2 前列腺癌組織中PCDH9與Cyclin D1、C-myc表達(dá)的相關(guān)性前列腺癌組織中細(xì)胞周期調(diào)控基因Cyclin D1的陽性率為68.5%(63/92)(圖1D)，C-myc的陽性率為64.1%(59/92)(圖1E)，與良性前列腺組織相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。63例Cyclin D1陽性前列腺癌組織中25例存在PCDH9蛋白表達(dá)缺失，25例PCDH9表達(dá)缺失病例中均存在C-myc蛋白過表達(dá)。同時Spearman檢驗(yàn)分析前列腺癌組織中PCDH9表達(dá)與Cyclin D1、C-myc的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.414、-0.457，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 前列腺癌組織中PCDH9與Cyclin D1、C-myc表達(dá)的相關(guān)性

2.3 前列腺癌組織中PCDH9與STAT3表達(dá)的相關(guān)性STAT3陽性主要位于細(xì)胞核，其在前列腺癌組織中高表達(dá)，陽性率為82.6%(76/92)(圖1F))，76例STAT3陽性的前列腺癌組織中24例存在PCDH9蛋白表達(dá)缺失，Spearman檢驗(yàn)分析顯示，前列腺癌組織中PCDH9的表達(dá)與STAT3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.216，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

ABCDEF

表2 前列腺癌組織中PCDH9與STAT3表達(dá)的相關(guān)性

2.4 前列腺癌組織中PCDH9、STAT3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系分析前列腺癌組織中PCDH9、STAT3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在高WHO/ISUP分級分組、PSA>20 ng/mL及Ⅲ+Ⅳ期前列腺癌組織中PCDH9的陽性率顯著降低(P<0.01)，PCDH9表達(dá)與患者年齡、脈管神經(jīng)侵犯無關(guān)(P>0.05)。前列腺癌組織中STAT3表達(dá)與WHO/ISUP分級分組、PSA水平相關(guān)(P<0.05)，在WHO/ISUP分級分組5組、PSA>20 ng/mL組中，STAT3的陽性率最高，而不同年齡、有無脈管神經(jīng)侵犯及不同臨床分期組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。>

表3 前列腺癌組織中PCDH9、STAT3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

近年來，中國男性前列腺癌的發(fā)病率逐漸升高，尤其是70歲以上的老年患者，嚴(yán)重影響了老年男性的生活及健康[4]。早期前列腺癌缺乏特異的臨床癥狀，發(fā)病較為隱匿，臨床上主要表現(xiàn)為尿頻、尿急、夜尿增多、尿流細(xì)弱，與前列腺增生癥狀類似；當(dāng)出現(xiàn)明顯的癥狀時，疾病多已發(fā)展至中晚期[5]，易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，臨床上多數(shù)患者初診時即失去了根治性治療的機(jī)會。因此，探究中國前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，對前列腺癌的早預(yù)防、早診斷及早治療具有重要的意義。

PCDH9屬于非集簇原鈣黏蛋白家族，可介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用和調(diào)節(jié)多種效應(yīng)分子，其表達(dá)缺失可引起腫瘤增殖甚至轉(zhuǎn)移[2]。Wang等[6]在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中觀察到PCDH9表達(dá)下調(diào)，而PCDH9的外源表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。PCDH9可以通過激活GSK-3β信號并抑制轉(zhuǎn)錄因子Snail1的表達(dá)來抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞遷移[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-200a-3p在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)的miR-200a-3p通過靶向PCDH9促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖[8]。上述研究提示惡性腫瘤中存在PCDH9表達(dá)缺失，且與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中PCDH9的缺失率為27.2%，與良性前列腺組織相比，其表達(dá)下調(diào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時，PCDH9表達(dá)與前列腺癌的分級分組、臨床分期和PSA水平等預(yù)后指標(biāo)密切相關(guān)。Zhang等[9]檢測了24例前列腺癌和對應(yīng)正常組織中PCDH9的表達(dá)，結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中PCDH9的表達(dá)低于正常組織。究其腫瘤組織中PCDH9表達(dá)缺失的原因，有研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中不僅存在PCDH9的雜合性缺失，而且還存在DNA甲基化[10]；而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中miR-215-5p可以通過結(jié)合其啟動子和3′UTR來抑制PCDH9的表達(dá)[11]。除了miRNA靶向PCDH9 mRNA影響蛋白表達(dá)，蛋白-蛋白相互作用也可能造成PCDH9表達(dá)缺失。最近有研究顯示前列腺癌細(xì)胞中PCDH9表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致AKT磷酸化和活性增加，PCDH9在轉(zhuǎn)錄后受piR-001773和piR-017184調(diào)控，進(jìn)一步揭示了前列腺癌中PCDH9表達(dá)下調(diào)的意義[9]。

上述研究結(jié)果顯示，前列腺癌組織中存在PCDH9表達(dá)下調(diào)，但其在抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移中的具體作用機(jī)制仍不清楚。STAT3是一種特殊的轉(zhuǎn)錄因子，多種惡性腫瘤細(xì)胞中都存在異常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和STAT3的異常激活[12-13]。STAT3表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖，而其下調(diào)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，其是激活多種生長因子或細(xì)胞因子信號通路上的關(guān)鍵點(diǎn)。目前，已鑒定出許多STAT3的靶基因，包括編碼抗凋亡基因BCL-x和MCL-1，細(xì)胞周期調(diào)控基因Cyclin D1和C-myc，以及促血管發(fā)生因子VEGF。Cyclin D1基因的擴(kuò)增、染色體重排或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)均可導(dǎo)致其蛋白過表達(dá)而使細(xì)胞發(fā)生癌變，STAT3可能通過調(diào)節(jié)Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄使細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[14]。同時，STAT3通過SH2結(jié)構(gòu)域與Src結(jié)合，激活C-myc基因并上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期[15]。Cyclin D1在正常組織中表達(dá)量較少甚至不表達(dá)，在多數(shù)惡性腫瘤中過表達(dá)。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中Cyclin D1表達(dá)顯著高于良性卵巢腫瘤，其表達(dá)與腫瘤分級、FIGO分期、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且Cyclin D1陽性組的LVD計(jì)數(shù)高于Cyclin D1陰性組。C-myc已經(jīng)被證明在多種人類癌癥組織中呈高表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[17]。當(dāng)染色體易位或信號通路基因突變等情況發(fā)生時，C-myc會發(fā)生不依賴于生長因子刺激的擴(kuò)增，導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞增殖和腫瘤產(chǎn)生[18]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了STAT3信號通路在介導(dǎo)前列腺癌中PCDH9表達(dá)缺失、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中的作用。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中Cyclin D1、C-myc的表達(dá)明顯高于良性前列腺組織，且隨腫瘤分級分組、臨床分期的增高而增高，與前列腺癌患者的預(yù)后有著密切關(guān)系。PCDH9與Cyclin D1、C-myc表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，前列腺癌組織中PCDH9表達(dá)下調(diào)與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1和C-myc過表達(dá)密切相關(guān)，PCDH9表達(dá)缺失率隨著Cyclin D1和C-myc過表達(dá)率增高而增高，PCDH9表達(dá)缺失病例常存在Cyclin D1和C-myc的過表達(dá)，提示前列腺癌組織中PCDH9表達(dá)缺失可能會引起腫瘤細(xì)胞周期紊亂，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的失控性生長。為此，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)觀察了前列腺癌組織中STAT3的表達(dá)，并分析了PCDH9表達(dá)下調(diào)與STAT3表達(dá)上調(diào)的關(guān)系，結(jié)果顯示PCDH9表達(dá)缺失病例中存在STAT3的過表達(dá)，進(jìn)一步提示STAT3信號通路在介導(dǎo)前列腺癌中PCDH9表達(dá)缺失、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中具有重要的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在PCDH9的表達(dá)缺失，其作用機(jī)制可能是STAT3信號通路介導(dǎo)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，PCDH9可能成為進(jìn)展期前列腺癌治療的一個潛在新靶點(diǎn)。