李曉鵬,鄭 爽,劉塑杰,田京偉,杜廣營(yíng)

(煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺(tái) 264005)

免疫逃逸是指腫瘤通過(guò)多種機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,是腫瘤存活和進(jìn)展的重要策略[1-2]。吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO,EC1.13.11.42),是一種含亞鐵血紅素的酶,廣泛分布于人和其他哺乳動(dòng)物除肝臟以外的組織中。IDO通過(guò)色氨酸在犬尿氨酸的分解代謝起關(guān)鍵作用[3],IDO可通過(guò)多種機(jī)制介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,已經(jīng)成為抗腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。已經(jīng)有多個(gè)IDO抑制劑進(jìn)入至臨床試驗(yàn)階段,其中進(jìn)展最快的BMS-986205(BMS公司)正在開(kāi)展膀胱癌的phase 3研究[4-5]。然而,動(dòng)物試驗(yàn)研究結(jié)果顯示,IDO抑制劑單用時(shí)抗腫瘤作用較弱,腫瘤抑制率約30%～50%[6]。因此,有必要尋求提高IDO抑制劑臨床抗腫瘤作用的途徑,將IDO抑制劑與其他作用機(jī)制的抗腫瘤藥物如化療藥物聯(lián)合使用是其中重要策略之一。

紫杉醇是第一個(gè)應(yīng)用于腫瘤化療的紫杉烷家族藥物,通過(guò)促進(jìn)微管蛋白聚合抑制解聚,致使快速分裂的腫瘤細(xì)胞終止于有絲分裂G2M期而死亡,臨床上主要用于卵巢癌、乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌的一線(xiàn)和二線(xiàn)治療[7-9]。伊立替康及其活性代謝物SN-38可與拓?fù)洚悩?gòu)酶I-DNA復(fù)合物結(jié)合,從而阻止斷裂單鏈的再連接,引起DNA雙鏈斷裂,主要用于成人轉(zhuǎn)移性大腸癌的治療[10]。力撲素是南京綠葉思科藥業(yè)公司生產(chǎn)的紫杉醇脂質(zhì)體,臨床用于乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌的化療治療。氟尿嘧啶是以抗代謝物而起作用[11],在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為有效的氟尿嘧啶脫氧核苷酸后,通過(guò)阻斷脫氧核糖尿苷酸受細(xì)胞內(nèi)胸苷酸合成酶轉(zhuǎn)化為胸苷酸,而干擾DNA的合成,臨床上廣泛用于多種腫瘤的化療治療如腸癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等。

LPM3480226是山東綠葉制藥有限公司開(kāi)發(fā)的小分子IDO抑制劑,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1,正在中國(guó)開(kāi)展臨床一期試驗(yàn),注冊(cè)登記號(hào)為CTR20182328。本研究以小鼠結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠為模型,觀(guān)察LPM3480226聯(lián)合紫杉醇、伊立替康、力撲素、氟尿嘧啶等常用化療藥物的抗腫瘤作用,為L(zhǎng)PM3480226的開(kāi)發(fā)以及臨床研究方案提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

圖1 LPM3480226的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of LPM3480226

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株與動(dòng)物

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26. WT,由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供,使用RPMI-1640培養(yǎng)基,含10%胎牛血清,于37 ℃,5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng),隔天換液1次,每2～3 d傳代,按1∶2～1∶5比例傳代。

BALB/c小鼠,雄性,體重16～20 g,購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2014-0004,動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)(無(wú)特定病原體)環(huán)境中,溫度21±2 ℃,濕度30%～70%,人工照明,晝夜12 h交替。所有動(dòng)物相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)煙臺(tái)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 供試品與主要試劑

LPM3480226,白色或類(lèi)白色粉末,山東綠葉制藥有限公司生產(chǎn);HPLC純度大于99.7%,分子式為C12H12BrFN6O3S,相對(duì)分子質(zhì)量為419.23。LPM3480226溶液配制:加入適量預(yù)先配制的20% Solutol溶液,50～60 ℃超聲至溶液澄清,再用溶劑定容至所需體積;配制成不同的濃度,配制后室溫遮光保存。

紫杉醇注射液,10 mL/60 mg/瓶,?？谑兄扑帍S(chǎng)有限公司生產(chǎn),用生理鹽水注射液稀釋至所需濃度,現(xiàn)用現(xiàn)配。

注射液用紫杉醇脂質(zhì)體(力撲素?),10 mL/30 mg/瓶,南京綠葉思科藥業(yè)有限公司生產(chǎn),使用時(shí)向瓶?jī)?nèi)加入適量5%葡萄糖注射液,在紫杉醇脂質(zhì)體專(zhuān)用振蕩器上振搖5 min,然后定容至所需體積,再稀釋至所需濃度,給藥前再振搖10 min。

注射用鹽酸伊立替康(開(kāi)普拓?),2 mL/40 mg/瓶,輝瑞制藥生產(chǎn),使用時(shí)吸取一定量原液,用生理鹽水注射液稀釋至所需濃度,現(xiàn)用現(xiàn)配。

氟尿嘧啶注射液(海普?),10 mL/0.25 g/瓶,上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn),使用時(shí)吸取一定量原液,用生理鹽水注射液稀釋至所需濃度,現(xiàn)用現(xiàn)配。

Kolliphor?HS15(Solutol)購(gòu)自SIGMA公司,生理鹽水購(gòu)自山東齊都藥業(yè)有限公司,葡萄糖注射液購(gòu)自石家莊四藥有限公司,Matrigel@基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CT26荷瘤小鼠制備

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26細(xì)胞,收集、重懸至無(wú)血清培養(yǎng)基中,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL,向細(xì)胞懸液中加入等體積的Matrigel,使細(xì)胞的終濃度為5×105個(gè)/mL。超凈工作臺(tái)中,于每只小鼠肩胛處皮下接種0.2 mL腫瘤細(xì)胞懸液,接種量為1×105個(gè)/只。待瘤快長(zhǎng)至500～1000 mm3時(shí),剝出瘤塊,剪刀剪碎,用皮埋植入穿刺針(直徑1.2 mm)接種至小鼠背部肩胛處皮下,制備CT26小鼠移植瘤模型。游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大直徑(a)和最小直徑(b),根據(jù)公式V=0.5×a×b2,計(jì)算腫瘤體積,待腫瘤體積長(zhǎng)至100 mm3時(shí),進(jìn)行隨機(jī)分組,開(kāi)始試驗(yàn)。

2.2 劑量設(shè)計(jì)

前期荷瘤小鼠結(jié)腸癌CT26模型劑量依賴(lài)性研究結(jié)果顯示,LPM3480226在200 mg/kg時(shí),腫瘤抑制作用最強(qiáng),抑制率為40%左右。本實(shí)驗(yàn)室藥效試驗(yàn)研究背景資料顯示,紫杉醇、力撲素、氟尿嘧啶、伊立替康的最大耐受劑量分別約為20、40、40、50 mg/kg。因此,本實(shí)驗(yàn)中,LPM3480226的給藥劑量設(shè)為200 mg/kg,每天2次灌胃給藥;紫杉醇、力撲素、氟尿嘧啶、伊立替康的給藥劑量分別設(shè)為20、40、40、50 mg/kg,每周2次靜脈注射給藥。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

待瘤塊長(zhǎng)至平均體積約100 mm3時(shí)開(kāi)始分組,分組當(dāng)天開(kāi)始給藥,定義為第1天,本實(shí)驗(yàn)共分為10個(gè)組,每組8只動(dòng)物,給藥體積為0.1 mL/10 g,LPM3480226的給藥劑量設(shè)為200 mg/kg,每天2次灌胃給藥,紫杉醇、力撲素、氟尿嘧啶、伊立替康的給藥劑量分別設(shè)為20、40、40、50 mg/kg,每周2次靜脈注射給藥,連續(xù)給藥11 d,且停止給藥后繼續(xù)觀(guān)察小鼠的體重、腫瘤體積4 d,動(dòng)物分組及給藥詳見(jiàn)表1。

表1 PM3480226聯(lián)合不同化療藥物抗小鼠CT26研究動(dòng)物分組與給藥(n=8)Tab.1 Antitumor effect of combined LPM3480226 and chemotherapy drugs in CT26 carcinoma-bearing mice: grouping an administration (n=8)

2.4 觀(guān)察指標(biāo)

2.4.1 動(dòng)物體重及死亡 實(shí)驗(yàn)期間每天觀(guān)察動(dòng)物死亡,每2 d測(cè)量1次各組小鼠體重。實(shí)驗(yàn)第15天,最后1次稱(chēng)重,以分組時(shí)動(dòng)物體重為基礎(chǔ),計(jì)算體重變化百分率。

2.4.2 腫瘤體積 實(shí)驗(yàn)期間,每2 d測(cè)量1次各組動(dòng)物的腫瘤體積(V)。游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大直徑(a)和最小直徑(b),根據(jù)公式V=0.5×a×b2計(jì)算腫瘤體積。根據(jù)腫瘤體積繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn),動(dòng)態(tài)觀(guān)察受試藥物的抗腫瘤效應(yīng)。

2.4.3 腫瘤重量 實(shí)驗(yàn)第15天,小鼠經(jīng)脫頸椎實(shí)施安樂(lè)死,剝離瘤塊并稱(chēng)重。根據(jù)腫瘤重量,計(jì)算每組的平均腫瘤重量MTV。相對(duì)腫瘤抑制率TGI(%):TGI=1-T/C。T/C為相對(duì)腫瘤增值率,即在某一時(shí)間點(diǎn),治療組和對(duì)照組相對(duì)腫瘤體積或瘤重的百分比值。T和C分別為治療組和對(duì)照組瘤重。

參考文獻(xiàn)[12],依據(jù)腫瘤重量分別計(jì)算LPM3480226與紫杉醇、力撲素、伊立替康、氟尿嘧啶聯(lián)合指數(shù)CI=W聯(lián)合/(WLPM3480226×W(PTC/LPS/CPT/FU)),W聯(lián)合為L(zhǎng)PM3480226+紫杉醇、LPM3480226+力撲素、LPM3480226+伊立替康、LPM3480226+氟尿嘧啶的平均瘤重與對(duì)照組平均瘤重的比值,WLPM3480226為L(zhǎng)PM3480226單用組與對(duì)照組平均瘤重的比值,W(PTC/LPS/CPT/FU)為紫杉醇、力撲素、伊立替康、氟尿嘧啶單用組平均瘤重與對(duì)照組平均瘤重的比值。CI值<1表示有協(xié)同作用,CI值=1表示有相加作用,CI值> 1表示有拮抗作用。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 荷瘤小鼠動(dòng)物體重

各給藥組均未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。體重結(jié)果如圖2和表2所示,實(shí)驗(yàn)期間,LPM3480226組、紫杉醇組、力撲素組、伊立替康組動(dòng)物體重在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05);氟尿嘧啶組動(dòng)物體重在第3至第7天顯著低于對(duì)照組(P<0.05);LPM3480226+紫杉醇組在第5至第9天,LPM3480226+力撲素組在第7至第13天,LPM3480226+伊立替康組在第5、9、13天,LPM3480226+氟尿嘧啶組在第5至第13天,動(dòng)物體重顯著低于對(duì)照組(P<0.05),這些組別在這些時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物體重降低幅度不大,多小于10%。第11天最后一次給藥結(jié)束后,各給藥組動(dòng)物體重開(kāi)始恢復(fù),至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(第15天),各給藥組和對(duì)照組的動(dòng)物平均體重和分組時(shí)的自身體重相比變化不大(-0.5%～6%)。

LPM3480226經(jīng)灌胃給藥,200 mg/kg,BID。四種化療藥物均經(jīng)靜脈給藥,BIW。給藥后每2 d測(cè)量1次動(dòng)物體重,數(shù)據(jù)以表示(n=8);*P<0.05,與對(duì)照組比較。圖2 LPM3480226聯(lián)合不同化療藥物對(duì)CT26荷瘤小鼠體重的影響Fig.2 Effects of combination of LPM3480226 and different chemotherapy drugs on body weight of CT26-bearing mice

表2 LPM3480226聯(lián)合不同化療藥物對(duì)CT26荷瘤小鼠體重及瘤重的影響(n=8)Tab.2 Effects of combination of LPM3480226 and different chemotherapy drugs on body weight and CT26 xenografts (n=8)

3.2 腫瘤體積

各組腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖3所示,LPM3480226組在給藥后第5天開(kāi)始腫瘤體積顯著小于對(duì)照組(P<0.05);紫杉醇組、力撲素組在給藥后第5天開(kāi)始,伊立替康組、氟尿嘧啶組在給藥后第3天開(kāi)始,腫瘤體積均顯著小于對(duì)照組(P<0.05);LPM3480226+紫杉醇組、LPM3480226+力撲素組、LPM3480226+伊立替康組在給藥后第5天開(kāi)始,LPM3480226+氟尿嘧啶組在藥后第3天開(kāi)始,腫瘤體積均顯著小于對(duì)照組(P<0.05)。在實(shí)驗(yàn)后期(第13至第15天),LPM3480226+力撲素、LPM3480226+伊立替康和LPM3480226+氟尿嘧啶各組動(dòng)物的平均腫瘤體積均小于LPM3480226單用組(P<0.05),同時(shí)也小于化療藥單用組(P<0.05),而LPM3480226+紫杉醇的腫瘤體積與單用組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

LPM3480226經(jīng)灌胃給藥,200 mg/kg,BID。四種化療藥物均經(jīng)靜脈給藥,BIW。給藥后每2天測(cè)量1次腫瘤體積,數(shù)據(jù)以表示(n=8)。*P<0.05,和對(duì)照組比較;#P<0.05,與LPM3480226組比較;@P<0.05,與力樸素組比較;&P<0.05,與伊立替康組比較;＄P<0.05,與氟尿嘧啶組比較。圖3 LPM3480226聯(lián)合不同化療藥物對(duì)CT26移植瘤體積的影響Fig.3 Effects of combinantion LPM3480226 and different chemotherapy drugs on CT26 tumor volume

3.3 腫瘤重量及抑制率

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),各給藥組的平均腫瘤重量均顯著小于對(duì)照組(P<0.05)(圖4)。LPM3480226+紫杉醇組腫瘤重量顯著小于LPM3480226組(P<0.05),但與紫杉醇組相比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),腫瘤重量抑制率分別為54.1% vs 30.6%和42.3%。LPM3480226+伊立替康組、LPM3480226+氟尿嘧啶組、LPM3480226+力撲素組的腫瘤重量均顯著小于LPM3480226組(P<0.05),同時(shí)也顯著小于相應(yīng)化療藥物單用組(P<0.05)。LPM3480226+力撲素組、LPM3480226+伊立替康組、LPM3480226+氟尿嘧啶組腫瘤重量與相應(yīng)化療藥物單用組的抑制率分別為61.5% vs 38.8%,55.1% vs 36.8%, 78.8 % vs 53.6%,抑制率提高20%以上。根據(jù)腫瘤重量計(jì)算LPM3480226和紫杉醇、力撲素、伊立替康、氟尿嘧啶的CI值分別為1.14、0.90、1.02、0.66,其中力樸素和氟尿嘧啶的CI值小于1,且力樸素和氟尿嘧啶聯(lián)用組腫瘤重量顯著小于單用組,提示LPM3480226和力樸素、氟尿嘧啶聯(lián)用具有一定協(xié)同效應(yīng)。

LPM3480226,灌胃給藥,200 mg/kg,BID;紫杉醇、力撲素、伊立替康、氟尿嘧啶靜脈給藥,給藥劑量分別為20、40、50、40 mg/kg,BIW。數(shù)據(jù)以表示(n=8)。*P<0.05,與對(duì)照組比較;#P<0.05,與LPM3480226組比較;@P<0.05,與力撲素組比較;&P<0.05,與伊立替康組比較;＄P<0.05,與氟尿嘧啶組比較。圖4 LPM3480226聯(lián)合不同化療藥物對(duì)CT26移植瘤重量的影響Fig.4 Effects of combination of LPM3480226 and different chemotherapy drugs on CT26 tumor weight

4 討論與結(jié)論

臨床前研究結(jié)果顯示,IDO抑制劑能有效提升PD-1等免疫檢查點(diǎn)藥物的抗腫瘤作用,已經(jīng)成為腫瘤聯(lián)合用藥研究的主流方向[13],但I(xiàn)DO抑制劑與化療藥物的聯(lián)合使用未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。本研究采用CT26荷瘤小鼠模型考察了IDO抑制劑LPM3480226聯(lián)合紫杉醇、力撲素、伊立替康、氟尿嘧啶等常用化療藥物的抗腫瘤作用。LPM3480226與各化療藥物聯(lián)用時(shí),對(duì)荷瘤小鼠體重影響較小,提示出聯(lián)合用藥具有較好的耐受性;LPM3480226可不同程度地顯著增強(qiáng)紫杉醇、伊立替康、力撲素、氟尿嘧啶等化療藥物的抗腫瘤作用。LPM3480226與不同化療藥物聯(lián)用的抗腫瘤增強(qiáng)作用機(jī)制并不明確,推測(cè)可能機(jī)制如下:抗癌藥物可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,有利于淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)釋放更多腫瘤抗原,可增強(qiáng)IDO抑制劑對(duì)T細(xì)胞的活化作用,改善腫瘤免疫微環(huán)境,上述因素協(xié)同作用,產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

綜上,LPM3480226與化療藥物紫杉醇、力撲素、伊立替康以及氟尿嘧啶聯(lián)用時(shí)具有較好的耐受性,可提高化療藥物的抗腫瘤作用,支持在臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步考察LPM3480226與上述化療藥物聯(lián)用的抗腫瘤作用。