劉如夢,徐亞男,朱曉音,田京偉

(煙臺大學(xué)藥學(xué)院,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學(xué)),新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺 264005)

遲發(fā)性運動障礙(Tardive Dyskinesia,TD)是一種以面部、軀干或身體其他部位異常的不自主重復(fù)運動為典型特征的疾病,口服抗精神病藥物發(fā)病率約為20 %～40 %,口服長效抗精神病藥物約為50 %[1]。TD的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但目前被公認(rèn)的發(fā)病理論是“D2受體增敏”,即突觸后D2受體長期被藥物阻滯導(dǎo)致其對多巴胺的敏感性上調(diào),黑質(zhì)-紋狀體多巴胺直接通路與間接通路失衡,從而表現(xiàn)出不自主重復(fù)運動[2-3]。

TD嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,數(shù)十年來,臨床醫(yī)生廣泛使用非適應(yīng)癥藥物治療TD。2017年,美國FDA批準(zhǔn)囊泡單胺轉(zhuǎn)運蛋白2(Vesicular Monoamine Transporters 2,VMAT2)抑制劑纈苯那嗪(Valbenazine,VBZ)用于TD治療,此后作為TD治療的一線用藥[4]。VMAT2主要表達(dá)于中樞單胺能神經(jīng)元的突觸囊泡膜上,利用囊泡膜上的H+-ATPase所產(chǎn)生電化學(xué)梯度驅(qū)動單胺類遞質(zhì)轉(zhuǎn)運至突觸囊泡內(nèi)儲存以備釋放。VBZ及其活性代謝產(chǎn)物羥基丁苯那嗪(Dihydrotetrabenazine,DHTBZ)與VMAT2可逆結(jié)合,阻止多巴胺被轉(zhuǎn)運至突觸囊泡,減少多巴胺的釋放,使黑質(zhì)-紋狀體多巴胺直接通路與間接通路恢復(fù)平衡,從而治療TD相關(guān)癥狀[5]。在前期研究中,VBZ能夠降低大鼠自主活動,誘導(dǎo)大鼠眼瞼下垂,升高血清催乳素濃度,這些改變都與單胺類遞質(zhì)釋放減少相關(guān),通過動物模型可評價其治療TD的作用。

本課題組在DHTBZ的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行改造,合成了新化合物130P4,化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示[6]。本研究通過對化合物與靶點VMAT2的親和力檢測、大鼠自主活動模型、眼瞼下垂模型和催乳素升高模型,考察130P4的藥效作用。

圖1 130P4的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of 130P4

1 實驗部分

1.1 實驗動物與藥品

動物:實驗所用Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性,200～220 g)購于濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司。大鼠飼養(yǎng)于無特定病原體(SPF)標(biāo)準(zhǔn)動物房,溫度21±2 ℃,濕度40 %～70 %,晝夜12 h交替,提供充足的食物和水,動物于實驗開始前在動物房至少預(yù)適應(yīng)一周。所有實驗均按照中華人民共和國衛(wèi)生部和中國醫(yī)科大學(xué)動物保健委員會的指導(dǎo)原則進(jìn)行,研究方案經(jīng)煙臺大學(xué)實驗動物研究委員會批準(zhǔn)。

藥品:130P4(MW: 387.55)由山東綠葉制藥有限公司提供,VBZ對甲苯磺酸鹽(MW: 762.97)購于江蘇維凱爾醫(yī)藥科技有限公司,二甲基亞砜購于阿拉丁試劑,Kolliphor?HS 15(別名Solutol?HS 15)購于Sigma, RayBio Rat Prolactin ELISA Kit 購于RayBiotech。

分組及給藥:SD大鼠隨機(jī)分組,每組8只。供試藥物先由適量分析純二甲基亞砜溶解后,再加入20 %的Solutol?HS 15溶解至所需藥物濃度,藥物溶液中二甲基亞砜的濃度為2 %。灌胃給藥,在給藥后不同時間點進(jìn)行實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 放射性配體受體競爭結(jié)合實驗 130P4對VMAT2親和力檢測,采用差速離心法制備雄性SD大鼠大腦(不含小腦)富含VMAT2的膜蛋白。取32 μg膜蛋白與10 nmol/L [3H]-DHTBZ及0.32～ 32 nmol/L的130P4在25 ℃孵育30 min。過濾和清洗膜蛋白,然后對膜蛋白進(jìn)行檢測[7]。

1.2.2 自主活動實驗 (1)劑量效應(yīng)關(guān)系研究:SD大鼠隨機(jī)分為8組:對照組,2.5、5.0和10 μmol/kg VBZ組,1.25、2.5、5.0和10 μmol/kg 130P4組,檢測單次給藥后0～1 h內(nèi)各組大鼠自主活動總運動距離[8]。(2)時間效應(yīng)關(guān)系研究:SD大鼠隨機(jī)分為3組:對照組,5.0 μmol/kg VBZ組和5.0 μmol/kg 130P4組,檢測單次給藥后0～1 h、1～2 h、2～3 h、4～5 h、7～8 h內(nèi)各組大鼠自主活動總運動距離,計算總運動距離減少率?？傔\動距離減少率=(對照組大鼠總運動距離-給藥組大鼠總運動距離)/對照組大鼠總運動距離×100 %。

實驗前一天將大鼠置于活動室適應(yīng)10 min,實驗當(dāng)天先將大鼠置于測試實驗室中適應(yīng)環(huán)境1 h,然后將大鼠放入活動室,使用TopScan監(jiān)測系統(tǒng)記錄并分析大鼠在活動室內(nèi)的總運動距離。每組實驗結(jié)束后,使用75 %的酒精將糞便清洗干凈以避免氣味等因素對大鼠運動活動造成影響。

1.2.3 眼瞼下垂 SD大鼠隨機(jī)分為5組,分別為:對照組,2.5、5.0 μmol/kg VBZ組,2.5、5.0 μmol/kg 130P4組。分別在單次給藥后第1、2、4、8小時對大鼠進(jìn)行眼瞼下垂評分,每個時間點的觀察時間為3 min,觀察開始前輕輕提起大鼠尾巴使其前爪離開桌面后再輕輕放下,以排除大鼠休息或睡眠行為對藥理性眼瞼下垂的干擾。對每分鐘內(nèi)的眼瞼下垂進(jìn)行評分,取觀察期內(nèi)3個評分的平均值。評分標(biāo)準(zhǔn):0=眼睛完全睜開;0.5=上眼瞼下垂1/4;1=上眼瞼下垂1/2;1.5=上眼瞼下垂3/4;2=眼睛完全閉合[7, 9]。

1.2.4 催乳素分泌 SD大鼠隨機(jī)分為3組,分別為:對照組、5.0 μmol/kg VBZ組和5.0 μmol/kg 130P4組。在給藥后60 min采用眼內(nèi)眥法取血,室溫放置2 h,在轉(zhuǎn)速3800×g、4 ℃條件下離心15 min,取血清于-80 ℃儲存以備用。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血清中催乳素濃度[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果

2.1 130P4與靶點VMAT2親和力檢測

實驗結(jié)果如表1所示,130P4與大鼠腦組織VMAT2親和力高,其親和力高于陽性對照化合物DHTBZ。

表1 130P4與VMAT2親和力檢測結(jié)果Tab.1 Result of VMAT2-binding affinity of 130P4

2.2 130P4對大鼠自主活動影響的劑量效應(yīng)關(guān)系

實驗結(jié)果如圖2所示,與對照組大鼠相比,VBZ各組大鼠的自主活動運動距離均降低,其中5.0 μmol/kg組和10.0 μmol/kg VBZ組大鼠運動距離與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。130P4各組大鼠自主活動運動距離均降低,其中2.5 μmol/kg組、5.0 μmol/kg組及10.0 μmol/kg 130P4組大鼠運動距離與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。給藥劑量在2.5 μmol/kg～10.0 μmol/kg時,VBZ組與130P4組大鼠自主活動運動距離均呈劑量依賴性降低。相同物質(zhì)的量給藥劑量下,130P4組大鼠運動距離減少程度高于VBZ組。

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01。圖2 給藥后1 h內(nèi)大鼠平均自主活動Fig.2 Mean locomotor activity of rat within 1 hour after administration

2.3 130P4對大鼠自主活動影響的時間效應(yīng)關(guān)系

實驗結(jié)果如圖3所示,與對照組相比,5.0 μmol/kg VBZ組大鼠在給藥后0～8 h各時間段內(nèi)自主活動運動距離均降低,其中在給藥后0～5 h各時間段內(nèi)自主活動運動距離與對照組相比有顯著性差異;5.0 μmol/kg 130P4組大鼠在給藥后0～8 h各時間段內(nèi)自主活動運動距離均顯著降低。

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01。圖3 給藥后大鼠不同時間段的自主活動Fig.3 Locomotor activity of rat at different time periods after administration

VBZ和130P4組大鼠自主活動運動距離減少率隨時間變化曲線如圖4所示,130P4在給藥后0～2 h內(nèi)運動距離減少率逐漸升高,在給藥后2～8 h內(nèi)運動距離減少率逐漸降低,其對自發(fā)活動的抑制作用至少持續(xù)8 h。除給藥后2～3 h外,其他時間段內(nèi)130P4組大鼠自主活動運動距離減少率均高于VBZ組。

圖4 大鼠自主活動減少率Fig.4 Reduction rate of locomotor activity in rat

2.4 130P4對大鼠眼瞼下垂的影響

實驗結(jié)果如圖5所示,與對照組相比,2.5 μmol/kg VBZ組大鼠在給藥后第1、2和4小時眼瞼下垂評分均升高,其中給藥后第2 h眼瞼下垂評分與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異。5.0 μmol/kg VBZ組大鼠在給藥后第1、2、4和8小時眼瞼下垂評分均升高,其中第1、2和4小時眼瞼下垂評分與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異;2.5 μmol/kg 130P4組大鼠在給藥后第1、2、4和8小時眼瞼下垂評分均升高,其中第1、2和4小時眼瞼下垂評分與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異。5.0 μmol/kg 130P4組大鼠在給藥后第1、2、4和8小時眼瞼下垂評分均顯著升高。且相同物質(zhì)的量給藥劑量下,130P4組大鼠眼瞼下垂評分高于VBZ組。

與對照組相比,**P<0.01。圖5 給藥后不同時間點眼瞼下垂評分Fig.5 Palpebral Ptosis Scores at different time after administration

2.5 130P4對大鼠催乳素分泌水平的影響

實驗結(jié)果如圖6所示,與對照組(4.39 ± 1.85 ng/mL)相比,5.0 μmol/kg VBZ組大鼠血清催乳素水平(6.57 ± 4.91 ng/mL,P> 0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義;5.0 μmol/kg 130P4組大鼠血清催乳素水平顯著升高(22.78 ± 9.69 ng/mL,P<0.05)。

3 討 論

VMAT2是位于突觸前膜內(nèi)囊泡膜上的轉(zhuǎn)運蛋白,能夠?qū)⑼挥|前膜內(nèi)胞漿中單胺遞質(zhì)如多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥色胺等轉(zhuǎn)運至囊泡內(nèi)并進(jìn)一步釋放至突觸間隙。VMAT2抑制劑可以拮抗VMAT2的轉(zhuǎn)運功能,減少突觸間隙的多巴胺釋放,減輕TD癥狀。體外試驗證實130P4對VMAT2具有高親和力,Ki值為1.38 nmol/L,IC50為2.37 nmol/L。多巴胺釋放減少可引起大鼠自主活動減少[10],單胺類遞質(zhì)釋放阻滯可引起大鼠眼瞼下垂[11-13]。在本研究中130P4劑量依賴性地降低大鼠自主活動、誘導(dǎo)大鼠眼瞼下垂,表明130P4可通過抑制VMAT2減少單胺類遞質(zhì)多巴胺及去甲腎上腺素的釋放。另外,DA與催乳素細(xì)胞膜上的D2受體結(jié)合,通過抑制腺苷酸環(huán)化酶和磷酸肌醇代謝而抑制催乳素基因的表達(dá),或通過調(diào)控鉀通道和鈣通道抑制催乳素分泌[14]。130P4通過抑制VMAT2減少多巴胺釋放,導(dǎo)致大鼠催乳素分泌增加。

前期研究顯示VBZ主要活性代謝產(chǎn)物DHTBZ對大鼠腦VMAT2的Ki值為4.2 nmol/L[6]。3 mg/kg(7.0 μmol/kg)VBZ可減少大鼠自主活動運動距離,自主活動減少率約為60 %。VBZ誘導(dǎo)大鼠眼瞼下垂的初始有效劑量為1 mg/kg,當(dāng)給藥劑量為3 mg/kg時,在給藥后第3、6和9小時大鼠眼瞼下垂評分升高且與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異。VBZ在3 mg/kg(7.0 μmol/kg)給藥劑量下,大鼠血清催乳素水平升高,但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義,VBZ相關(guān)實驗結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[8]。

實驗室前期對130P4進(jìn)行了部分體內(nèi)藥代動力學(xué)研究,實驗結(jié)果顯示,130P4與VBZ相同物質(zhì)的量給藥劑量下,在給藥后0～12 h內(nèi)各時間點,大鼠血漿和腦組織中130P4的濃度均高于VBZ及其代謝產(chǎn)物DHTBZ。血漿和腦組織中130P4的藥時曲線下面積AUClast高于VBZ及其代謝產(chǎn)物DHTBZ。

4 結(jié) 論

上述結(jié)果顯示,130P4與VMAT2親和力高,可減少大鼠自主活動、誘導(dǎo)大鼠眼瞼下垂和促進(jìn)大鼠催乳素釋放,對大鼠VMAT2具有抑制作用,相同物質(zhì)的量劑量下對VMAT2的抑制作用優(yōu)于VBZ。且前期研究結(jié)果顯示相同物質(zhì)的量給藥劑量下,130P4在血漿和腦組織中的暴露量均高于VBZ。與VBZ相比,130P4顯示了更好的藥效及藥代特征,為TD的治療提供新的候選藥物。