劉瓊，李慧，羅鵬征，馬國(guó)榮，張煒，萬(wàn)巧鳳

寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，寧夏 銀川 750004

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tb）感染所致的一種慢性傳染病，是當(dāng)今世界由單一致病菌感染引起的死亡率最高的疾?。?］。據(jù)WHO 統(tǒng)計(jì)，全球結(jié)核潛伏感染人群接近20 億，僅2019 年全球約有患者1 000萬(wàn)人，140 萬(wàn)人死于 TB［2］。我國(guó)新發(fā) TB 患者約占全球第3 位（8. 4%），僅次于印度（26%）和印度尼西亞（8. 5%）［2］。因此，盡早發(fā)現(xiàn) TB 患者并給予有效治療是控制TB 播散的關(guān)鍵。

目前，用于TB 診斷的方法有X 光檢查、病原學(xué)檢測(cè)（痰液抗酸染色法及細(xì)菌培養(yǎng)法）、結(jié)核菌素（purified protein derivative，PPD）皮膚試驗(yàn)及 TB 核酸序列擴(kuò)增技術(shù)等。病原學(xué)檢測(cè)是TB 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)的M. tb 病原學(xué)診斷率較低，2020 年WHO報(bào)告顯示，我國(guó)TB 病原學(xué)陽(yáng)性率為47%，低于全世界57%的檢出率［2］，僅靠此法會(huì)延誤對(duì)患者的治療［3］；PPD 皮試是一種免疫學(xué)檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，但難以區(qū)分卡介苗的免疫效果及致病性 M. tb 的感染，因此診斷價(jià)值不高［4］；在 TB 早期診斷中，核酸擴(kuò)增技術(shù)是病原學(xué)診斷的重要補(bǔ)充，但因其成本高及對(duì)檢測(cè)環(huán)境的嚴(yán)格要求，限制了其在基層醫(yī)院的應(yīng)用［5］。血清學(xué)檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、適用于肺外結(jié)核和肺結(jié)核等優(yōu)勢(shì)［6］。因此，獲得高靈敏度、高特異性的M. tb 抗原或抗體，并將其應(yīng)用于血清學(xué)檢測(cè)TB，是早期診斷TB 的理想方法。

本研究通過(guò)構(gòu)建表達(dá)M. tb 早期分泌性蛋白R(shí)v1886c 基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli 后誘導(dǎo)高表達(dá)Rv1886c 蛋白（Ag85B），并免疫小鼠制備多克隆抗體，旨在為采用血清學(xué)方法早期診斷TB 奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 菌株、質(zhì)粒及基因組 克隆和表達(dá)菌株E. coli DH5α 和 BL21（DE3）、pET-28a 質(zhì)粒及 M. tb（H37Rv）基因組均由馬國(guó)榮老師惠贈(zèng)。

1. 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) BALB ／ c 小鼠，雄性，7 ～ 8周齡，體重（21 ± 1. 6）g，共 10 只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。本實(shí)驗(yàn)對(duì)BALB ／ c 小鼠的所有處理均以科研為目的進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（2021-N019）。

1. 3 主要試劑 TaqDNA 聚合酶和T4 DNA 連接酶購(gòu)自日本TaKaRa 公司；限制性?xún)?nèi)切酶 HindⅢ和BamHⅠ購(gòu)自美國(guó)NEB 公司；硫酸卡那霉素（Kan）、IPTG、瓊脂糖、胰化蛋白胨及酵母提取物均購(gòu)自寧夏科博生物科技有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；鼠抗Ag85B 單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP 標(biāo)記的兔抗鼠IgG 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；含Ni+螯合劑的Ni-NTA His純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invintrogen 公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1. 4 目的基因 Rv1886c 的擴(kuò)增 以 M. tb（H37Rv）的DNA 為模板，根據(jù)GenBank 中注冊(cè)的M. tb Rv1886c基因（Gene ID：885785）序列設(shè)計(jì)引物，P1：5′-CCCAAGCTTATGACAGACGTGAGCCGAAAGA-3′（下 劃線(xiàn)部分為 Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)），P2：5′-CGGGATCCTCAGCCGGCGCCTAACGAA-3（′下劃線(xiàn)部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），基因全長(zhǎng)為977 bp。PCR 反應(yīng)體系：Premix Taq 25 μL，DNA 2 μL，P1、P2 引物各 1 μL，加水至 50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1 min，共 35 個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃延伸 10 min?；厥誔CR 產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1. 5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用T4 DNA 連接酶將PCR 產(chǎn)物與 pET-28a 質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化 E. coli DH5α。隨機(jī)挑取 5 個(gè)菌落，接種于含 50 μg ／ mL 硫酸卡那霉素的LB 培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h 后提取質(zhì)粒DNA，用Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將獲得的含有Rv1886c 基因的表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-28a-Rv1886c。

1. 6 重組蛋白表達(dá)菌株的構(gòu)建 將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Rv1886c 通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化入E. coli BL21（DE3）中，命名為 BL-Rv1886c，于-80 ℃保存。

1. 7 重組Rv1886c 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

1. 7. 1 誘導(dǎo)劑濃度 將凍存的BL-Rv1886c 菌株接種于 20 mL 含 100 μg ／ mL Amp 的 LB 液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床 200 r ／ min，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；再按 2%比例轉(zhuǎn)種至200 mL LB 培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液A600為 0. 4 ～ 0. 6 時(shí)，分別加入 0. 2、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 和 3. 0 mmol ／ L IPTG，37 ℃誘導(dǎo) 4 h。各取 2 mL菌液制備蛋白樣品，進(jìn)行12% SDS-PAGE 分析，確定最佳誘導(dǎo)劑濃度。

1. 7. 2 誘導(dǎo)時(shí)間 BL-Rv1886c 表達(dá)菌培養(yǎng)至菌液A600為 0.4 ～ 0.6 時(shí)，加入 0.5 mmol／L IPTG，37 ℃分別誘導(dǎo) 2、4、6、8 h。各取 2 mL 菌液制備蛋白樣品，進(jìn)行12% SDS-PAGE 分析，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1. 7. 3 誘導(dǎo)溫度 BL-Rv1886c 表達(dá)菌培養(yǎng)至菌液A600為 0. 4 ～ 0. 6 時(shí)，加入 0. 5 mmol ／ L IPTG，分別于27、30、37 ℃誘導(dǎo)4 h。收集菌液制備蛋白樣品，進(jìn)行12% SDS-PAGE 分析，確定最佳誘導(dǎo)溫度。

1. 8 重組蛋白的分離純化 采用Ni-NTA His 純化試劑盒純化目的蛋白。將誘導(dǎo)后的菌液離心、制備上柱樣品，按照說(shuō)明書(shū)中的方法進(jìn)行親和色譜純化。收集洗脫液，加入透析袋中，于4 ℃低溫下進(jìn)行梯度透析復(fù)性，每4 ～8 h 換液1 次，透析48 h 后回收復(fù)性蛋白，BCA 定量法測(cè)定蛋白濃度。保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1. 9 重組蛋白的Western blot 分析 分別取重組蛋白 10 和 40 μg，按 1 ∶4 體積比加入 5 × 樣品緩沖液，沸水浴5 min 后上樣，經(jīng)12% SDS-PAGE 分離后，半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，以5%脫脂奶粉 4 ℃封閉過(guò)夜；TBST 洗膜 10 min，共 3 次，加入鼠抗 Ag85B 單克隆抗體（1 ∶1 000 稀釋?zhuān)?7 ℃孵育l h；加入 HRP 標(biāo)記的兔抗鼠 IgG（1 ∶1 000 稀釋?zhuān)?7 ℃振蕩 60 min；加入 ECL 發(fā)光液，X 線(xiàn)膠片曝光，經(jīng)顯影、定影后分析結(jié)果。

1. 10 抗小鼠血清的制備 將純化的Ag85B 蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分混合形成油包水乳化劑，經(jīng)小鼠背部皮下注射，300 μL ／ 只，共 7 只；對(duì)照組 3只小鼠注射0. 9%氯化鈉溶液與等體積弗氏完全佐劑充分混合的乳化劑。每周免疫1 次，共4 次，除初次免疫外，其余3 次使用弗氏不完全佐劑，于第4 次免疫后1 周經(jīng)眼框后靜脈叢采血，分離血清。

1. 11 抗體滴度檢測(cè) 采用間接ELISA 法。將純化的 Ag85B 蛋白配制成 2 μg ／ mL 的溶液包被 96 孔酶標(biāo)板，0. 1 mL ／ 孔，4 ℃過(guò)夜；加入 2% BSA 封閉液，0. 1 mL ／ 孔，37 ℃靜置 2 h；TBST 洗板 4 次，加入 2 倍稀釋的免疫血清（終濃度為 1 ∶200、1 ∶400、1 ∶800、1 ∶1 600、1 ∶3 200、1 ∶6 400、1 ∶12 800、1 ∶25 600、1 ∶51 200、1 ∶102 400），第 1 列設(shè) PBS 陰性對(duì)照，37 ℃孵育l h；加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1 ∶1 000 稀釋?zhuān)?. 1 mL ／ 孔，37 ℃溫育 40 min；PBST 洗板，加入底物，0. 1 mL ／ 孔，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入 50 μL 2 mol ／ L H2SO4終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀上測(cè)定A450值。以試驗(yàn)孔A450值 ／ 陰性對(duì)照A450值＞2. 1 倍的最高樣品稀釋度定義為抗體滴度［1］。

1. 12 抗體特異性鑒定 采用Western blot 法。取純化的Ag85B 蛋白，經(jīng)12% SDS-PAGE 分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，以5%脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜；TBST 洗膜3 次，加入制備的鼠抗血清（稀釋梯度依次為 1 ∶1 000、1 ∶5 000、1 ∶25 000），室溫孵育 2 h；TBST 洗膜 3 次，加入 HRP 標(biāo)記的兔抗鼠 IgG（1 ∶1 000 稀釋?zhuān)?，室溫孵?1 h；TBST 洗膜 3 次，采用 ECL顯色觀察。

2 結(jié) 果

2. 1 Rv1886c 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 Rv1886c 基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約1 000 bp處可見(jiàn)特異性條帶，大小與預(yù)期（977 bp）相符，見(jiàn)圖1。

圖1 Rv1886c 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 PCR amplification of Rv1886c gene

2. 2 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Rv1886c 的雙酶切（Hind Ⅲ和 BamHⅠ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)與擴(kuò)增條帶大小一致的條帶，見(jiàn)圖2?；驕y(cè)序結(jié)果與 GenBank 中公布的M. tb Rv1886c 基因序列完全一致，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Rv1886c 的酶切鑒定Fig. 2 Identification of the pET-28a-Rv1886c vector through restriction enzyme digestion

2. 3 重組Rv1886c 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

2. 3. 1 最佳誘導(dǎo)劑濃度 12%SDS-PAGE 分析顯示，在誘導(dǎo)劑濃度為 0. 2 ～ 2 mml ／ L 時(shí)，Ag85B 重組蛋白表達(dá)量較高，但誘導(dǎo)劑濃度為0. 2 mml ／ L 時(shí)，雜蛋白較多，因此選擇最佳誘導(dǎo)劑濃度為0.5 mmol／L。見(jiàn)圖3。

圖3 37 ℃下不同濃度IPTG 誘導(dǎo)4 h 表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE 分析Fig. 3 SDS-PAGE results of proteins expressed in transformed E. coli induced with IPTG in different concentrations at 37 ℃for 4 h

2. 3. 2 最佳誘導(dǎo)時(shí)間 12% SDS-PAGE 分析顯示，誘導(dǎo)8 h，Ag85B 重組蛋白表達(dá)量最高，但雜帶較多；誘導(dǎo)4 和6 h，Ag85B 重組蛋白表達(dá)量高且雜帶較少，因此確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。見(jiàn)圖4。

圖4 37 ℃下0. 5 mmol ／ L IPTG 誘導(dǎo)不同時(shí)間表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig. 4 SDS-PAGE results of proteins expressed in transformed E. coli induced by 0. 5 mmol ／ L IPTG at 37 ℃ for different time periods

2. 3. 3 最佳誘導(dǎo)溫度 12% SDS-PAGE 分析顯示，誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)，Ag85B 重組蛋白表達(dá)量最高，因此確定最佳誘導(dǎo)溫度為37 ℃。見(jiàn)圖5。

圖5 0. 5 mmol ／ L IPTG 于不同溫度下誘導(dǎo) 4 h 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig. 5 SDS-PAGE results of proteins expressed in transformed E. coli induced by 0. 5mmol ／ L IPTG at different temperatures

2. 4 純化重組蛋白的鑒定

2. 4. 1 SDS-PAGE 分析 純化重組蛋白的純度達(dá)90%以上，蛋白濃度約為1. 5 mg ／ mL，可用于動(dòng)物免疫。見(jiàn)圖6。

圖6 純化重組蛋白的SDS-PAGE 分析Fig. 6 SDS-PAGE results of purified recombinant protein

2. 4. 2 Western blot 分析 純化的重組蛋白可與Ag85B單克隆抗體反應(yīng)，在相對(duì)分子質(zhì)量約30 000 處可見(jiàn)特異條帶，見(jiàn)圖7。

圖7 純化重組蛋白的Western blot 分析Fig. 7 Western blotting results of purified recombinant protein

2. 5 小鼠血清抗體效價(jià) 間接ELISA 結(jié)果顯示，小鼠血清抗體滴度高達(dá)1︰51 200，見(jiàn)圖8。

圖8 間接ELISA 法測(cè)定血清Ag85B 抗體滴度Fig. 8 Determination of serous Ag85B antibody titer through indirect ELISA

2. 6 Ag85B 多克隆抗體的特異性 Western blot 分析顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約30 000 處可見(jiàn)明顯條帶，且在稀釋濃度為1︰25 000 條件下也可發(fā)生特異性反應(yīng)。見(jiàn)圖9。

圖9 Western blot 鑒定不同稀釋度的抗Ag85B 血清Fig. 9 Identification of anti Ag85B sera with different dilutions through Western blotting

3 討 論

《“十三五”全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃》明確提出了規(guī)劃目標(biāo)：2020 年我國(guó)肺結(jié)核發(fā)病和死亡人數(shù)進(jìn)一步減少，全國(guó)肺結(jié)核發(fā)病率下降至58 ／ 10 萬(wàn)以下，肺結(jié)核患者病原學(xué)陽(yáng)性率達(dá)50%以上［7］。2020 年我國(guó)已基本完成規(guī)劃目標(biāo)［8］。WHO 和我國(guó)對(duì)診斷TB 的技術(shù)規(guī)范進(jìn)行了推薦［9-10］，TB 的診斷技術(shù)需因地施策和規(guī)范應(yīng)用才能發(fā)揮其功效，不應(yīng)盲目尋求新方法，更不能忽略經(jīng)典的TB 病原學(xué)及血清學(xué)檢查［11］。

M. tb 的分泌性蛋白是刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫效應(yīng)的外源性抗原，是診斷TB 的標(biāo)志分子［12］。Ag85 復(fù)合物是常見(jiàn)的M. tb 分泌蛋白，占M. tb 分泌蛋白總量的45%，該復(fù)合物包括Ag85A、Ag85B 和Ag85C 3 種組分，其中 Ag85B 占 22%，Ag85A 占15%，Ag85C 占8%［13］。因Ag85 復(fù)合物可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的 Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，該復(fù)合物尤其Ag85A 和Ag85B 是最有前景的TB 疫苗候選抗原［14］。Ag85B 是由M. tb Rv1886c 基因編碼的相對(duì)分子質(zhì)量為30 000 的早期分泌性蛋白。Rv1886c 編碼的約40 個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列在分泌時(shí)被切除，然后Ag85B 釋放到M. tb菌體外，因此在M. tb 培養(yǎng)濾液中，第3 天即可檢測(cè)到 Ag85B［15］。又由于 Ag85B 的分泌量高于 Ag85A，因此Ag85B 有望成為T(mén)B 的血清學(xué)早期診斷標(biāo)志物。

本研究成功地對(duì)Rv1886c 基因進(jìn)行克隆及表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化條件，獲得了較高純度的重組蛋白Ag85B，該蛋白可有效刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，抗體滴度達(dá)1︰51 200。以純化的Ag85B 蛋白為抗原，抗血清為一抗進(jìn)行Western blot，在相對(duì)分子質(zhì)量約30 000處可見(jiàn)明顯條帶，且在抗血清稀釋濃度為1︰25 000條件下，Ag85B 與其抗血清也能發(fā)生特異性反應(yīng)，表明Ag85B 與其抗血清結(jié)合具有高靈敏度和特異性，可作為T(mén)B 血清學(xué)診斷的候選抗原分子。本研究為T(mén)B 的血清學(xué)早期診斷奠定了基礎(chǔ)。