趙鑫，俞露，孫瑞欣，朱秋媚，王江林，劉涵，劉玉林，劉景會，鄒勇

長春生物制品研究所有限責任公司細胞因子室，吉林 長春 130012

長效生長激素（recombinant human growth hormone-Fc，rhGH-Fc）免疫融合蛋白是利用一段柔軟多肽將人生長激素與IgG4 Fc 片段相連，將基因克隆至GS 雙表達載體，再利用CHO-k1 細胞進行表達的一種Fc 融合蛋白［1］。rhGH-Fc 融合蛋白具有與生長激素相同的生理作用，同時擁有較長的半衰期［2］。相較短效生長激素，rhGH-Fc 可減少用藥次數，提高患者依從性，從而提高治療效果［3］。國內的長效生長激素均為PEG 化生長激素，而Fc 融合蛋白除了可通過增大藥物相對分子質量降低清除率，還可通過FcRn 結合域來提高pH 敏感性結合力，以緩釋的方式延長藥物半衰期。與PEG 化藥物相比，Fc 融合蛋白不僅具有更長的藥物半衰期，而且具有更好的生物相容性。

相關蛋白是蛋白質在物理、化學作用下，由于蛋白聚集或某些氨基酸側鏈發(fā)生氧化、脫酰胺等化學修飾反應［4］，產生的與原蛋白質結構類似，但物理、化學性質又與原蛋白質存在差異的一類蛋白。氧化和脫酰胺反應是rhGH-Fc 最容易發(fā)生的降解反應，脫酰胺反應主要是 Asn ／ Glu（天冬酰胺 ／ 谷氨酸）在臨近氨基酸α 碳親核攻擊下脫掉酰胺基水解成Asp ／ Glu（天冬氨酸 ／ 谷氨酸）殘基［5］，氧化反應主要是由于Met 位點中的含硫基團易被空氣中氧氣氧化［6］。研究表明，蛋白質的生物學活性會受蛋白結構影響［7］，相關蛋白產物也可能會影響蛋白質的免疫原性［8］。蛋白質相關蛋白的含量變化既可體現部分蛋白質結構的變化，同時也反映了蛋白質的穩(wěn)定程度，因此，建立穩(wěn)定、準確的相關蛋白檢測方法至關重要。

本研究建立了rhGH-Fc 相關蛋白含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，并對建立的方法進行驗證。

1 材料與方法

1. 1 主要試劑及儀器 rhGH-Fc 蛋白純化液（CHOK1 細胞表達）由長春生物制品研究所有限責任公司細胞因子室制備，批號分別為S190826、S191031 和S191112；乙腈（LC ／ MS）購自美國 Honeywell 公司；甲酸（LC ／ MS）購自美國 Fisher 公司；鹽酸胍購自美國 Gibco 公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）購自美國 Promega 公司；碘乙酰胺（iodoacetamide，IAM）購自美國Sigma 公司；碳酸氫銨、硫酸銨和乙腈（高效液相淋洗）購自國藥集團化學試劑有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）購自美國 Sigma-Aldrich 公司；磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉購自湖南九典制藥有限公司；超濾管和0. 22 μm 無菌濾膜購自美國Millpore 公司；AcQuity 液相色譜系統(tǒng)、G2-XS 精確質量四級桿飛行時間（Q-TOF）液質聯用系統(tǒng)、Xevo G2 OTof 質譜儀、UNIFI 軟件及 BEH C18色譜柱（130 ? 1. 7 μm，2. 1 mm × 100 mm）購自美國Waters 公司；PerkinElmer Flexa 型高效液相色譜系統(tǒng)（配有UV／VIS 檢測器、自動進樣器、往復式柱塞泵、TCNav 色譜工作站、柱溫箱）購自美國PerkinElmer公司；ZORBAX 300SB-C18（4. 6 mm × 250 mm，5-Micron）色譜柱購自美國Agilent 公司；G-25 色譜柱購自美國GE 公司。

1. 2 樣品配制

1. 2. 1 對照品溶液 向rhGH-Fc 原液中緩慢加入45%飽和度的硫酸銨（按25 ℃硫酸銨飽和度計算表），并不斷攪拌，直至硫酸銨全部溶解，4 ℃靜置30 min；7 200 × g 離心 30 min；棄上清，得到蛋白沉淀，用冷注射用水復溶，7 200 × g 離心 20 min；棄沉淀，上清液經 5 mmol ／ L PB 緩沖液（pH 7. 0）平衡好的 G-25色譜柱純化，得到緩沖液為 5 mmol ／ L PB（pH 7. 0）、蛋白濃度為 1 mg ／ mL 的蛋白樣品，作為 rhGH-Fc 對照品溶液，于-20 ℃保存。

1. 2. 2 氧化加速試驗樣品 向rhGH-Fc 對照品溶液中加入0. 1%過氧化氫，用0. 22 μm 無菌濾膜濾至滅菌西林瓶中，4 ℃放置48 h。

1. 2. 3 脫酰胺加速試驗樣品 將rhGH-Fc 對照品溶液用0. 22 μm 無菌濾膜濾至滅菌西林瓶中，37 ℃放置6 d。

1. 3 rhGH-Fc 相關蛋白結構解析

1. 3. 1 樣品處理 取對照品溶液、氧化加速試驗樣品、脫酰胺加速試驗樣品各150 μL，分別按以下步驟處理：加入 300 μL 鹽酸胍（8 mol ／ L），加入 2 μL DTT（1 mol ／ L），50 ℃水浴 30 min；放至室溫，加入4 μL IAM（1 mol ／ L），避光 30 min；加至超濾管中，12 000 × g 離心 5 min，棄膜下液，加入 50 mmol ／ L NH4HCO（3pH 8. 0）緩沖液置換，重復離心步驟15次；用置換用緩沖液將樣品濃度調至0. 3 mg ／ mL，按15 ∶1 的比例加入胰蛋白酶，37 ℃酶切4. 5 h。

1. 3. 2 質譜檢測方法 用Waters Xevo G2 QTof 質譜儀，色譜柱為 BEH C18（130 ? 1. 7 μm，2. 1 mm ×100 mm）；流動相A 為水 + 0. 1%甲酸，流動相B 為乙腈+0.1%甲酸；柱溫為65 ℃；流速為0.3 mL／min；樣品保存溫度為10 ℃；上樣量為1. 5 μg。按下述線性梯度洗脫程序檢測：0 ~ 2 min，100% A；2 ~32 min，100% A→60% A；32 ~ 33 min，60% A→5%A；33 ~ 39 min，5% A。

1. 4 方法優(yōu)化

1. 4. 1 梯度洗脫方法 色譜條件：色譜柱ZORBAX 300SB-C18（4. 6 mm × 250 mm，5-Micron）；流動相 A為水+0.1%TFA，流動相B 為乙腈+0.1%TFA；柱溫為 45 ℃；流速為 0. 7 mL ／ min；上樣量為 40 μg；檢測波長為280 nm。梯度洗脫方法如下：①：0~40 min，30% B→100% B。②：0 ~ 40 min，35% B→80% B；③：0 ~ 10 min，35% B→55% B；10 ~ 40 min，55%B→80% B。④：0 ~ 10 min，35% B→55% B；10 ~40 min，55% B→75% B。⑤：0 ~ 10 min，35% B→55%B；10~50 min，55%B→75%B。⑥：0~10 min，45% B→55% B；10 ~ 40 min，55% B→65% B。

1. 4. 2 流動相 色譜條件：色譜柱ZORBAX 300SBC18（4.6 mm × 250 mm，5-Micron）；柱溫為 45 ℃；流速為 0.7 mL ／min；上樣量為 40 μg；檢測波長為 280 nm。流動相方案1：流動相A 為水 + 0. 1% TFA，流動相B 為乙腈 + 0. 1% TFA；梯度洗脫方法：0 ~ 10 min，35% B→55% B；10 ~ 50 min，55% B→75% B。流動相方案2：流動相A 為30%乙腈 + 0. 1%，流動相B為80%乙腈+0.1%TFA，梯度洗脫方法：0~10 min，10% B→50% B；10 ~ 50 min，50% B→90% B。

1. 5 方法的驗證

色譜條件：色譜柱ZORBAX 300SB-C18（4.6 mm×250 mm，5-Micron）；流動相 A 為 30%乙腈 + 0. 1%TFA，流動相B 為80%乙腈 + 0. 1% TFA，梯度洗脫方法為 0 ~ 10 min，10% B→50% B；10 ~ 50 min，50% B→90% B；柱溫為 45 ℃；流速為 0. 7 mL ／ min；上樣量為40 μg；檢測波長280 nm。

1. 5. 1 系統(tǒng)適應性 取rhGH-Fc 對照品1 mL，按色譜條件進樣檢測，計算理論塔板數、拖尾因子、主蛋白與相關蛋白分離度。

1. 5. 2 重復性 取rhGH-Fc 對照品1 mL，按色譜條件進樣檢測，重復進樣6 次，記錄主峰比例，主峰峰面積，計算平均值和相對標準偏差（RSD）。

1. 5. 3 專屬性 取rhGH-Fc 對照品和5 mmol ／ L PB緩沖液（pH 7. 0）各1 mL，分別按色譜條件進樣檢測。

1. 5. 4 耐用性 兩臺相同型號高效液相色譜儀，記為設備1 和2；按照配方配制2 批流動相，記為流動相1 和2；取2 根相同型號，使用程度不同的色譜柱，記為色譜柱1 和2；設置柱溫箱溫度為40、45 和50 ℃。不同條件下進樣檢測，記錄主峰純度，計算平均值和RSD。

1. 5. 5 檢測限及定量限 將樣品稀釋5 個梯度，濃度分別為 0. 1、0. 05、0. 025、0. 01、0. 005 mg ／ mL，按色譜條件進樣檢測，記錄信噪比（S ／ N），檢測限S ／ N 不小于 3，定量限 S ／ N 不小于 10。

1. 6 rhGH-Fc 氧化產物及脫酰胺產物的檢測 用建立的相關蛋白檢測方法對rhGH-Fc 氧化加速試驗樣品和脫酰胺加速試驗樣品進行檢測，并與rhGH-Fc對照品圖譜進行比較。

1. 7 rhGH-Fc 相關蛋白檢測方法的初步應用 用建立的相關蛋白檢測方法對本室純化的不同批次rhGH-Fc 純化液進行檢測，并分析檢測結果。

2 結 果

2. 1 rhGH-Fc 相關蛋白結構 通過質譜肽圖分析，rhGH-Fc 的主要脫酰胺位點為第299 和368 位的天冬酰胺殘基；rhGH-Fc 的主要氧化位點除了與短效生長激素相同的第14、125 位甲硫氨酸外，在第236 和342 位的甲硫氨酸處也容易發(fā)生氧化反應。見圖1 和表1。

表1 rhGH-Fc 主要氧化和脫酰胺位點Tab. 1 Major oxidation and deamidation sites of rhGH-Fc

圖1 rhGH-Fc 質譜肽圖檢測Fig. 1 Mass spectrometry peptide mapping of rhGH-Fc

2. 2 方法優(yōu)化的結果 梯度洗脫方法⑤較梯度洗脫方法①、②、③、④分離度更高，分離效果好；較梯度洗脫方法⑥峰型更對稱，出峰時間更合理。見圖2。因此，選則梯度洗脫方法⑤為rhGH-Fc 相關蛋白含量檢測的梯度洗脫方法。流動相方案2 較1 分離度有所提高，峰型更對稱，見圖3。因此，選則流動相方案2 為rhGH-Fc 相關蛋白含量檢測的流動相方案。

圖2 各洗脫方法的對比圖Fig. 2 Comparison of various elution methods

2. 3 方法的驗證結果

2. 3. 1 系統(tǒng)適應性 結果顯示，主峰理論塔板數為13 919，拖尾因子為1. 4，主蛋白與相關蛋白分離度為1. 9，符合《中國藥典》二部（2015 版）重組人生長激素相關蛋白質項目中拖尾因子0. 9 ~ 1. 8，分離度大于1. 0 的要求。見圖3。

圖3 rhGH-Fc 相關蛋白檢測方法的優(yōu)化及系統(tǒng)適應性驗證Fig. 3 Optimization of determination method for rhGH-Fc associated protein and verification for system adaptability

2. 3. 2 重復性 結果顯示，對照品主峰純度平均值為96. 51%，RSD 為0. 22%，主峰峰面積平均值為3 286 333. 38，RSD 為 1. 8%，符合《中國藥典》四部（2015 版）0512 HPLC 法中 RSD 小于 2%的要求。見表2。

表2 重復性驗證結果Tab. 2 Verification for reproducibility

2. 3. 3 專屬性 結果表明，PB 緩沖液在蛋白出峰時間未出峰，對蛋白純度檢測無干擾，見圖4。表明該方法專屬性良好。

圖4 專屬性驗證結果Fig. 4 Verification for specificity

2. 3. 4 耐用性 結果顯示，相同色譜柱條件下，不同設備、不同批次流動相、不同柱溫對檢測結果無明顯影響；主峰純度平均值為96. 64%，RSD 為0. 05%。見表3。

表3 耐用性驗證結果Tab. 3 Verification for durability

2. 3. 5 檢測限及定量限 結果顯示，蛋白濃度為0.01 mg／mL 時，S／N=4，該方法檢測限為 0.01 mg／mL；蛋白濃度為 0. 025 mg ／ mL 時，S ／ N = 13，該方法定量限為 0. 025 mg ／ mL。

2. 4 rhGH-Fc 氧化產物及脫酰胺產物分析 結果顯示，與對照品溶液相比，rhGH-Fc 氧化加速試驗樣品及rhGH-Fc 脫酰胺加速試驗樣品的氧化產物峰和脫酰胺產物峰均明顯升高，見圖5。表明相較于質譜檢測，建立的方法更簡便、快速、直觀，更適用于日常大量樣品的檢測。

圖5 rhGH-Fc 相關蛋白的HPLC 法檢測Fig. 5 Determination of rhGH-Fc associated protein by HPLC

2. 5 rhGH-Fc 相關蛋白檢測方法的初步應用 用建立的方法均可快速、靈敏地檢測出不同批次rhGHFc 純化液的相關蛋白含量，見圖6。

圖6 3 批rhGH-Fc 純化液相關蛋白檢測結果Fig. 6 Determination of three batches of purified rhGH-Fc

3 討 論

通過質譜結構解析結果發(fā)現，rhGH-Fc 存在多個易發(fā)生氧化和脫酰胺反應的位點，這些位點除了分布于rhGH 片段上，在Fc 片段上也存在。由于氧化和脫酰胺反應產生的相關蛋白會影響產品質量，在蛋白純化和制劑開發(fā)過程中要對相關蛋白含量加以控制，因此需建立一種快速、便捷的RP-HPLC 檢測方法用于藥品研究過程的相關蛋白檢測。

長春生物制品研究所有限責任公司細胞因子室生產的rhGH-Fc 融合蛋白是真核表達，糖基化修飾復雜，組分較多，在進行相關蛋白檢測時，如果采用類似重組人生長激素的等度洗脫方法［9］，當使用甲醇、正丙醇等洗脫強度弱的流動相時，強保留雜質組分可能會滯留在色譜柱上，很難被完全洗脫，所有組分集中在圖譜后部，分離度差，峰型不對稱，不能準確分析rhGH-Fc 相關蛋白含量；當使用洗脫強度強的乙腈作為流動相時，弱保留雜質組分會在色譜圖起始部分一起流出，很難分離所有組分，分析效果差。采用梯度洗脫方法可有效解決上述問題，因此本文設計了乙腈作為流動相的梯度洗脫方法進行rhGH-Fc 相關蛋白含量檢測。

影響梯度洗脫的影響因素較多。梯度洗脫陡度影響各組分間的分離度［10］，當梯度陡度較大時，各組分間分離度較差，不能達到《中國藥典》二部（2015版）要求，因此可適當放緩梯度陡度來達到更好的分離效果。但如果陡度過緩，既會延長分析時間，也會影響峰型及對稱性。若1 個梯度洗脫陡度不能完全分離，可在1 個梯度洗脫中采用2 個不同的梯度陡度使分離度進一步提高［11］。強洗脫溶劑B 的濃度變化范圍影響出峰時間，若B 的起始濃度過低，譜圖起始比較空曠，無組分峰出現；B 的起始濃度過高，譜圖后部比較空曠，表明梯度洗脫未結束全部組分已被洗脫出，較早流出的組分可能產生重疊，降低分離度。優(yōu)化流動相A、B 中的乙腈濃度可使梯度洗脫過程中的梯度變化更緩和，出峰時間更合理，對于提高分離度和改善峰型均有明顯效果。

綜上所述，本研究成功建立了rhGH-Fc 相關蛋白含量RP-HPLC 檢測方法。經驗證，此方法能有效分離本產品相關蛋白，具有較好的系統(tǒng)適應性，且專屬性好、耐用性強、檢測限低，可滿足藥品研發(fā)過程中RP-HPLC 相關蛋白含量的檢測需求。