閆旭佳 ，袁亞迪 ，幺山山 ，崔博沛 ，宋麗芳 ，劉佩 ，孫世洋 ，卞蓮蓮，高帆，張潔，毛群穎，梁爭論

1. 中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2. 長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春130012；3. 北京成大天和生物科技有限公司，北京 100176

甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）屬于小RNA 病毒科嗜肝病毒屬，為直徑27 ～32 nm 的球形顆粒，在外界環(huán)境中無包膜［1］。HAV 是導(dǎo)致人類病毒性肝炎的主要病原體［2］，常通過糞-口途徑引起暴發(fā)或散發(fā)流行［3］。據(jù)報(bào)道，2005 年全球約有1. 19億人感染HAV，其中約3 100 萬人出現(xiàn)明顯臨床癥狀，約3. 4 萬人死亡［4］。近20 年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展、衛(wèi)生環(huán)境的極大改善以及甲肝疫苗的大量應(yīng)用，全球范圍內(nèi)甲肝發(fā)病率均呈下降趨勢［5］，但因大多數(shù)人群均在兒童期間接種疫苗，成年后并未進(jìn)行再次接種，從而出現(xiàn)了人群抗體水平降低，發(fā)病年齡后移，臨床癥狀加重等問題［6］。因此，在現(xiàn)今的后HAV 疫苗時(shí)代，加強(qiáng)HAV 相關(guān)食品安全管理對(duì)我國乃至全球新特征下的HAV 防控具有新的意義。

雙殼貝類（包括牡蠣、扇貝和貽貝等）通過攝食活動(dòng)，以每小時(shí)40 升海水的過濾速度，有效積累水體中的各種食源性病原體［7］。全球每年因生食或未煮熟的貝類而導(dǎo)致甲肝流行的事件頻頻發(fā)生［8］。多項(xiàng)研究顯示，HAV 可在貝類中長時(shí)間存在［9］。但HAV 在貝類中的動(dòng)態(tài)富集、衰減規(guī)律和臟器分布尚不明確，特別是活病毒的動(dòng)態(tài)改變等未見相關(guān)研究，這與我國日益增長的貝類消費(fèi)需求，鮮牡蠣生食習(xí)慣的風(fēng)靡，以及因其帶來的不斷加大的生物安全風(fēng)險(xiǎn)不相匹配。如何更好地控制食源性疾病、食品源頭污染和保證食品安全已成為我國乃至全球食品行業(yè)的首要任務(wù)［10］。

本研究以太平洋牡蠣為模型，在實(shí)驗(yàn)室條件下采用海水人工養(yǎng)殖的方式，在養(yǎng)殖水體中加入HAV活病毒，富集后更換潔凈海水，使牡蠣在潔凈海水中凈化養(yǎng)殖10 d，分析總HAV 及活HAV 在牡蠣體內(nèi)富集和凈化衰減的動(dòng)態(tài)規(guī)律，為防控貝類中HAV 等生物安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 牡蠣及海水 太平洋牡蠣購自我國青島養(yǎng)殖基地；潔凈海水采集自我國青島養(yǎng)殖基地的天然潔凈海水，經(jīng)檢測不含HAV。

1. 2 病毒、細(xì)胞及質(zhì)粒 活HAV 為HAV 疫苗減毒株（L-A-1 株，病毒滴度為 8. 33 LgCCID50／ mL），由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗二室惠贈(zèng)；人胚肺二倍體細(xì)胞（2BS 細(xì)胞）由中國食品藥品檢定研究院保存；HAV 質(zhì)粒由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

1. 3 主要試劑及儀器 小鼠抗HAV 單克隆抗體（XA036-7）由北京科興生物制品有限公司惠贈(zèng)；蛋白酶K 購自美國Sigma 公司；DynabeadsTM蛋白質(zhì)G免疫沉淀試劑盒、MagMaxTM-96 病毒RNA 分離試劑盒和Multiskan FC 酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司；QuantiFast Pathogen PCR + IC 試劑盒購自德國QIAGEN 公司；MEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；MagMAX 全自動(dòng)核酸提取儀和PRISMA 7500 型熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司。

1. 4 牡蠣暫養(yǎng)、染毒及凈化 選取大小規(guī)格相近（400. 0 ± 30. 0）g 的健康牡蠣，用刷子小心清除表面的附著物，置于潔凈海水中適養(yǎng)3 d 后，在水體中加入活HAV，使水中HAV 濃度為4.33 LgCCID50／mL，富集24 h 后，將污染水體更換為潔凈海水，之后每24 h 更換1 次海水，使染毒牡蠣在潔凈海水中持續(xù)凈化10 d。

1. 5 牡蠣和養(yǎng)殖水體的采集 分別在加毒后0、3、6、9、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240及264 h（凈化養(yǎng)殖后，每次均在更換海水前進(jìn)行采樣）隨機(jī)選取5 ～8 只牡蠣，同時(shí)另取5 mL 養(yǎng)殖水體，首先采用免疫沉淀提取結(jié)合一步法實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR（quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction，qRT-PCR）法分別檢測 0 ～264 h 不同時(shí)間點(diǎn)的養(yǎng)殖水體、牡蠣消化腺以及牡蠣其他組織的總HAV 含量；再采用qRT-PCR 法和疊氮溴化丙錠-定量RT-PCR（propidium monoazidequantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，PMA-qRT-PCR）同時(shí)檢測 3、12、24、72、120、168、216 和264 h 牡蠣消化腺總HAV 和活HAV 病毒含量，并對(duì)兩者進(jìn)行相關(guān)性分析。另取0、3 和24 h 的染毒牡蠣2 ～3 只，進(jìn)行HE 染色及免疫組化檢測，評(píng)價(jià)各組織的組化動(dòng)態(tài)改變。

1. 6 牡蠣樣本處理 參照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 15216-1 ∶2017，將不同時(shí)間點(diǎn)的牡蠣解剖后，分別取消化腺、鰓、唇瓣、外套膜和閉殼肌進(jìn)行勻漿，在勻漿中加入10 μL 20 mg ／mL 蛋白酶 K 溶液，37 ℃，320 r ／min消化 60 min；60 ℃滅活蛋白酶 K 15 min；4 ℃，9 000 × g離心 10 min；取上清，用 2. 5 mol ／ L NaOH 溶液調(diào)整pH 至6. 0 ~ 8. 0，用于HAV 抽提以及活病毒檢測。

1.7 引物、探針的設(shè)計(jì)及合成 利用SnapGene 3.2.1進(jìn)行引物及探針設(shè)計(jì)，上游引物F 序列：5′-CTTGCAGTGTTAACTTGGCTYTC-3′，下游引物 R 序列：5′-CGCCGCTGTTACCCTATCC-3′；探針序列：FAM-TTGATCTTCCACAAG-MGB。引物及探針序列由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

1. 8 總HAV 檢測 利用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的磁珠免疫沉淀法分別提取牡蠣消化腺等組織上清液和養(yǎng)殖水體［11］，獲得 50 μL 產(chǎn)物，用于 HAV 總 RNA 的抽提。按試劑盒說明書進(jìn)行核酸抽提，收集50 μL總RNA。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期建立的HAV 熒光定量PCR法進(jìn)行 qRT-PCR［12］，以 HAV 質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)，以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)和Ct 值繪制回歸曲線，計(jì)算樣品拷貝數(shù)。反應(yīng)體系按試劑盒說明書添加，模板為5 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃ 20 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，共 45 個(gè)循環(huán)。

1. 9 活 HAV 檢測 將濃度為（3 ~ 4）× 105個(gè) ／ mL的2BS 細(xì)胞接種于 12 孔板中，置 37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)至單層后，用無血清MEM 將待測牡蠣上清 10 倍稀釋，加入孔中，400 μL ／ 孔，并設(shè)復(fù)孔，置37 ℃，5% CO2孵箱吸附2 h；棄上清，按照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的 PMA-qRT-PCR 方法處理后［13］，取 50 μL上清，用于核酸抽提及qRT-PCR 檢測。以HAV 活病毒為標(biāo)準(zhǔn)，以病毒滴度的對(duì)數(shù)和Ct 值繪制回歸曲線，計(jì)算樣品病毒滴度。

1. 10 免疫組化 將牡蠣解剖后，分別取消化腺、鰓、唇瓣、外套膜和閉殼肌，浸入福爾馬林中充分固定48 h 后，包埋于石蠟中，制備石蠟包埋切片，按照試劑盒說明書進(jìn)行處理、封閉、滴加小鼠抗HAV 單克隆抗體和顯色，當(dāng)肉眼觀察到棕黃色時(shí)，浸泡于自來水中終止顯色，迅速加蓋蓋玻片，顯微鏡下觀察。

1. 11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析（ANOVA），以 P ＜ 0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 8. 0. 2 和Excel 繪圖。

2 結(jié) 果

2. 1 牡蠣養(yǎng)殖水體中的總HAV qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，加毒后0 ～24 h，環(huán)境水體的HAV 總RNA從最初的 5. 544 Lgcopies ／ g 逐漸下降，至 3 和 6 h，分別降至 4. 916 和 4. 646 Lgcopies ／ g，顯著低于 0 h的 RNA 濃度（t 分別為 8.777 和 9.062，P<0.000 1）；6 h 后降速減緩，至 24 h 降至 4. 428 Lgcopies ／g，24 h共下降 1.116 Lgcopies／g（t=10.380，P<0.000 1）。而更換潔凈海水（24 h）后1 d（48 h），環(huán)境水體中仍可檢測出2.757 Lgcopies ／g 總HAV，并可持續(xù)檢出，至 216 h 仍可檢測到 1. 838 Lgcopies ／ g。見圖 1。提示受污染牡蠣在養(yǎng)殖過程中，可持續(xù)在環(huán)境中釋放低濃度的HAV，造成養(yǎng)殖環(huán)境的生物污染。

圖1 牡蠣養(yǎng)殖水體中總HAV 的動(dòng)態(tài)變化（n = 3）Fig. 1 Dynamic changes of total HAV in oyster culture water body（n = 3）

2. 2 牡蠣消化腺中總HAV 的富集和消減規(guī)律 qRTPCR 檢測結(jié)果顯示，牡蠣在污染水體中養(yǎng)殖3 h，消化腺中的總HAV 即顯著升高至5. 810 Lgcopies ／ g（t = 9. 016，P < 0. 000 1）；隨著時(shí)間的延長，總 HAV濃度在消化腺中繼續(xù)緩慢升高，至12 h 達(dá)最高點(diǎn)（6.152 Lgcopies／g）；之后持續(xù)高水平存在，直至凈化養(yǎng)殖后2 d（72 h），HAV 才緩慢下降，凈化養(yǎng)殖后10 d（264 h），消化腺中 HAV 含量仍達(dá) 4.398 Lgcopies／g，較最高點(diǎn)僅下降1. 754 Lgcopies ／ g。見圖2。牡蠣消化腺中總HAV 與環(huán)境水體總HAV 變化趨勢存在明顯差異。

圖2 牡蠣消化腺中總HAV 的富集及消減動(dòng)態(tài)趨勢（n=5）Fig. 2 Accumulation and depuration of total HAV in digestive gland of oyster（n = 5）

2. 3 牡蠣消化腺中總HAV 和活HAV 的富集和消減規(guī)律 qRT-PCR 和PMA-qRT-PCR 法檢測結(jié)果顯示，活HAV 和總HAV 含量均呈先升高后降低的趨勢，均于染毒后3 h 即顯著升高至3. 432 LgCCID50／g和 5.146 Lgcopies／g，12 h 達(dá)峰值（3.929 LgCCID50／g和 6. 440 Lgcopies ／g），72 h 后緩慢下降，216 ～ 264 h降至最低點(diǎn)（2.675 LgCCID50／g 和 4.231 Lgcopies／g）。見圖3。經(jīng)配對(duì)t 檢驗(yàn)，牡蠣消化腺中總HAV 和活HAV 的含量變化趨勢差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 分別為1. 482、1. 464、1. 364、1. 044、1. 293、1. 274、1. 528和1. 164，P > 0. 05）。

圖3 牡蠣消化腺中總HAV 與活HAV 的富集和衰減動(dòng)態(tài)趨勢（n = 3）Fig. 3 Dynamic trend of accumulation and depuration of total and live HAV in oyster digestive gland（n = 3）

相關(guān)性分析顯示，各時(shí)間點(diǎn)的活HAV 與總HAV含量具有良好的相關(guān)性，R2達(dá)0. 811 6，見圖4。經(jīng)推算，牡蠣消化腺中 10 CCID50／ g 活 HAV 約相當(dāng)于81 copies ／ g 總 HAV。

圖4 牡蠣消化腺中總HAV 與活HAV 含量的相關(guān)性分析Fig. 4 Correlation of total and live HAV contents in digestive gland of oyster

2.4 不同組織中HAV 富集水平及免疫組化 qRT-PCR結(jié)果顯示，染毒后24 h 牡蠣的消化腺、鰓、唇瓣、外套膜和閉殼肌中均可檢出總HAV，含量在2. 965 ～6. 086 Lgcopies ／ g 之間，其中，消化腺中含量最高，唇瓣中最低；消化腺中總HAV 含量顯著高于鰓、唇瓣、外套膜和閉殼?。╰ 分別為 4. 721、4. 694、5. 633、5.400，P 分別為 0.009 2、0.001 8、0.019 3 和 0.006 4）。見圖5。

圖5 牡蠣各組織HAV 顆粒的富集和分布（n = 3）Fig. 5 Enrichment and distribution of HAV virus particles in various tissues of oyster（n = 3）

免疫組化結(jié)果顯示，除閉殼肌因非特異性反應(yīng)較強(qiáng)外，其他4 個(gè)組織均可見陽性HAV 顆粒，且隨著感染時(shí)間的延長而增多，但不同時(shí)間的反應(yīng)強(qiáng)度存在一定差異。其中，3 h 時(shí)即可在唇瓣上皮細(xì)胞內(nèi)見到明顯的HAV 陽性顆粒，而消化腺、鰓和外套膜3 h 僅可見弱陽性病毒顆粒，至24 h HAV 反應(yīng)才見強(qiáng)陽性HAV 顆粒。見圖6。

圖6 HAV 在牡蠣不同組織的免疫組化時(shí)間動(dòng)態(tài)改變Fig. 6 Immunohistochemical temporal dynamics of HAV in different tissues of oyster

3 討 論

牡蠣又名生蠔、海蠣子，營養(yǎng)價(jià)值高，高蛋白低脂肪，含有人體必需的多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有食用價(jià)值和藥用價(jià)值［14］。近年來，隨著我國人民生活水平的不斷提高，生鮮即食牡蠣越來越得到認(rèn)可和普及［15］。由于牡蠣具有超強(qiáng)的海水過濾能力，可過濾和富集海水中的各類物質(zhì)，如導(dǎo)致赤潮的氮和磷等有機(jī)物質(zhì)等，被許多國家稱為海水凈化的天然能手［16］，但這也使其成為HAV 等食源性病毒傳播的主要載體［17］。加之近年來我國乃至全球的HAV 流行特征已逐漸發(fā)生變化，生鮮即食牡蠣等雙殼貝類的食用安全問題越來越得到人們的關(guān)注［18］。但相關(guān)基礎(chǔ)研究較少，特別是關(guān)于牡蠣中HAV 富集、衰減動(dòng)態(tài)模型的研究，且多采用qRT-PCR 法檢測總HAV，無法區(qū)分活病毒和死病毒，難以反映牡蠣中HAV 活力的動(dòng)態(tài)變化，給貝類相關(guān)HAV 的監(jiān)測、凈化消減和滅活研究帶來極大困惑。

HAV 活力檢測是國際公認(rèn)的食品中安全性監(jiān)測和研究的難點(diǎn)，也是生物制品學(xué)研究和評(píng)價(jià)的難點(diǎn)。HAV 雖然可在2BS 等細(xì)胞上生長、復(fù)制，但生長緩慢、病毒滴度低、且不引起細(xì)胞病變作用或殺傷作用［19］。因此，在生物制品學(xué)研究中只能采用傳統(tǒng)的2BS 細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)合HAV 抗原檢測（ELISA）的方法進(jìn)行活HAV 含量檢測［20］。方法操作步驟繁雜、影響因素多、檢測周期長（約1 個(gè)月）、細(xì)胞培養(yǎng)量大、定量準(zhǔn)確性較低。而對(duì)于牡蠣等貝類食品，由于牡蠣中含有多種生物活性酶，且成分復(fù)雜，需要長時(shí)間細(xì)胞培養(yǎng)的活毒檢測方法基本難以實(shí)現(xiàn)。2020年，卞蓮蓮等［13］利用PMA 可選擇性進(jìn)入失活病毒衣殼（及包膜），與病毒基因組共價(jià)結(jié)合，抑制其聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn)，建立了可區(qū)分活病毒與死病毒的PMA-qRT-PCR 方法。該方法不需要細(xì)胞培養(yǎng)、檢測周期短（1 d）、定量準(zhǔn)確、操作簡便，經(jīng)驗(yàn)證，可有效區(qū)分活病毒與死病毒，與經(jīng)典的細(xì)胞培養(yǎng)法相比，具有良好的相關(guān)性，可應(yīng)用于活HAV 的定量檢測。

本研究分別采用qRT-PCR 和PMA-qRT-PCR方法同時(shí)檢測牡蠣消化腺內(nèi)總HAV 和活HAV 含量，并對(duì)養(yǎng)殖水體的總HAV 進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攻毒后養(yǎng)殖水體的總HAV 從高水平緩慢下降，至 24 h 雖下降了 1. 116 Lgcopies ／ g，但凈化養(yǎng)殖后，仍可在水體中持續(xù)檢出低濃度的總HAV，直至第9 天（216 h）。在牡蠣消化腺中，總HAV 和活HAV含量均在染毒后3 h 顯著升高，12 h 升至最高點(diǎn)，分別為 6. 440 Lgcopies ／ g 和 3. 929 LgCCID50／ g；此時(shí)，總HAV 為環(huán)境水體的29. 7 倍；凈化養(yǎng)殖后，兩者仍持續(xù)處于高水平，至72 h 出現(xiàn)緩慢下降，凈化后10 d仍可檢出 4. 251 Lgcopies ／ g 和 2. 678 LgCCID50／ g的總HAV 和活HAV，兩者的富集和凈化衰減動(dòng)態(tài)趨勢一致，表明HAV 在牡蠣體內(nèi)不僅可有效富集，而且可長時(shí)間保持病毒活性，并對(duì)環(huán)境造成持續(xù)污染；經(jīng)相關(guān)性分析，從染毒的3 ～264 h（總計(jì)11 d），總HAV 與活HAV 含量之間相關(guān)性良好（R2=0. 811 6），可通過牡蠣的總HAV 含量檢測反映活HAV 含量。

消化腺是國際公認(rèn)的貝類中HAV 等病原微生物的檢測組織。除消化腺外，2019 年HYUNKYUNG等［21］研究顯示，鰓中也可檢出HAV。但由于牡蠣等貝類成分復(fù)雜，HAV 等的提取存在干擾強(qiáng)、回收率低、難度大等問題［22］，使HAV 在不同組織的分布研究受到極大限制。本研究采用前期建立的HAV 磁珠免疫沉淀法提取病毒［11］，結(jié)合qRT-PCR 檢測不同組織中的總HAV［12］。結(jié)果顯示，染毒后24 h，消化腺、鰓、唇瓣、外套膜和閉殼肌中均可檢出不同含量的總HAV。其中，消化腺中含量最高，為6.086 Lgcopies／g，顯著高于其他各組織（P < 0. 05）；唇瓣中最低，為2. 965 Lgcopies ／ g。采用免疫組化進(jìn)一步證實(shí)，染毒后3 h，唇瓣中首先可見強(qiáng)陽性HAV 顆粒，而消化腺、鰓、外套膜中呈弱陽性反應(yīng)，至24 h，各組織中陽性反應(yīng)均明顯增強(qiáng)，再次證明消化腺、鰓、唇瓣、外套膜污染HAV 后，均可成為HAV 的病毒庫。且在污染早期，唇瓣可能較消化腺更加敏感，可作為早期HAV 污染檢測的靶組織予以關(guān)注。

綜上所述，本研究采用人工暫養(yǎng)方式，對(duì)太平洋牡蠣受污染后，HAV 在牡蠣不同組織中的污染富集和凈化衰減動(dòng)態(tài)趨勢進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)染毒后3 h，牡蠣消化腺中即可出現(xiàn)高水平HAV，至12 h 達(dá)峰值，為環(huán)境中的29. 7 倍。凈化污染不能有效清除牡蠣體內(nèi)的HAV，且污染牡蠣可持續(xù)排毒，對(duì)環(huán)境造成二次污染。本研究還首次通過活HAV 快速檢測方法發(fā)現(xiàn)HAV 可在牡蠣消化腺內(nèi)長時(shí)間保持良好的病毒活力，提出通過總HAV 檢測可反映牡蠣中活HAV含量，10 CCID50／ g 活 HAV 約相當(dāng)于 81 copies ／ g的總HAV。一方面為貝類等復(fù)雜基質(zhì)中活HAV 的檢測和評(píng)估提供了新的思路和新手段，另一方面提示我國應(yīng)加強(qiáng)對(duì)牡蠣等可生食貝類的HAV 等腸道病毒的關(guān)注，進(jìn)一步開展相關(guān)基礎(chǔ)、方法學(xué)、病毒監(jiān)測和管理策略研究，為應(yīng)對(duì)HAV 后疫苗時(shí)代出現(xiàn)的HAV 流行和防控的新特點(diǎn)、新需求做好源頭控制，更好地保障我國的食品安全。