張凌星 張曉莉 張業(yè)宏 于 毅 顧仁駿? 高智賢?

1(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

2(河南省神經(jīng)傳感與控制工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

3(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

引言

急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP)，是指一氧化碳(CO)中毒癥狀恢復(fù)后，患者經(jīng)2～60 天假愈期，再次出現(xiàn)以精神意識障礙、大腦皮層局灶性功能障礙、腦神經(jīng)損害及周圍神經(jīng)炎等神經(jīng)系統(tǒng)損害[1]。據(jù)統(tǒng)計，DEACMP 發(fā)病率約為CO 中毒患者的3%～30%，但因其在假愈期無明顯癥狀、隱匿性強(qiáng)，易被忽視而導(dǎo)致預(yù)后較差。因此，早發(fā)現(xiàn)、早治療對該病的防治及康復(fù)十分重要。國內(nèi)病理報告，DEACMP 發(fā)病時常見蒼白球?qū)ΨQ性病變和海馬病變，但相應(yīng)區(qū)域的病變過程和機(jī)制尚不清楚[2]。

目前，臨床檢查的方法主要有腦CT[3]、MRI[4]、實驗室病理檢查[5]、神經(jīng)電生理檢查等[6]，雖能檢測到腦部病變，但難以連續(xù)監(jiān)測腦部病程變化。頭皮腦電(EEG)因無創(chuàng)、靈敏度高、簡單易行且時間分辨率高等特點，已被應(yīng)用于臨床進(jìn)行DEACMP 分級診斷，通過觀察患者的原始腦電波形變化是否出現(xiàn)廣泛而不規(guī)則的高振幅慢波活動來進(jìn)行判定[7-8]。但這種讀圖方法依賴于臨床醫(yī)生的主觀經(jīng)驗和診斷水平，缺少客觀的檢測指標(biāo)。頭皮腦電也難以獲知位于大腦中部特定受損區(qū)域在假愈期內(nèi)的活動狀態(tài)變化。

因此，本研究使用植入電極記錄DEACMP 大鼠海馬區(qū)的局部場電位信號(local field potential，LFP)，持續(xù)記錄8 周，通過提取LFP 頻段振蕩的特征參數(shù)，探究DEACMP 的長時程海馬區(qū)腦電信號的變化規(guī)律，以期為DEACMP 的臨床檢測與治療提供理論支持和參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

36 只健康成年雄性清潔級SD 大鼠，體重250～350 g，由河南省動物實驗中心提供。大鼠飼養(yǎng)于空調(diào)室(20～23℃)，光照/暗循環(huán)12 h。實驗嚴(yán)格執(zhí)行新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物使用規(guī)定。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 模型制備

隨機(jī)挑選30 只大鼠進(jìn)行造模，按照本研究組提出的造模方法[9-10]，每隔4 h 腹腔注射一次CO 氣體，注射劑量分別為10、5、5、5 mL/100 g，觀察染毒后大鼠的癥狀及體征行為變化。

1.2.2 電極植入

10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔麻醉大鼠，將頭部固定于立體定位儀上，顱骨前囟和后囟在同一水平面上。剃毛后，在顱骨上磨4 個小孔，并放置螺絲用于固定電極，參照Paxinos 等的大鼠腦立體定位圖譜[11]，在海馬體上方(連合線外側(cè)2.0～2.5 mm，中間連合點后方2.5～3.8 mm，下方2.6 mm)磨開2×2 mm 小窗口，剝離硬腦膜和軟腦膜，使用微推進(jìn)器，將自制的4 通道電極(鎳鉻合金，單根電極直徑460 μm，間隔200 μm)緩慢植入至海馬區(qū)。牙科水泥固定電極后縫合，術(shù)后注射青霉素防止感染。將大鼠轉(zhuǎn)移到籠中單獨飼養(yǎng)，用白熾燈輔熱，確保術(shù)后恢復(fù)。待大鼠醒來之后給予食物和水，并進(jìn)行術(shù)后跟蹤觀察。因染毒后大鼠健康狀態(tài)不佳，再開顱植入電極后存活時長較短，難以存活8 周(最長存活5 周)。為了觀察假愈期大鼠海馬區(qū)局部場電位變化，本研究選擇對大鼠分批植入電極。造模當(dāng)天選擇4 只大鼠進(jìn)行電極植入，之后以周為時間節(jié)點，每次增補(bǔ)2～3 只大鼠植入電極，以保證每周4～5 只存活大鼠進(jìn)入腦電記錄。而6 只正常大鼠直接植入電極，作為造模前的參照基準(zhǔn)。

1.3 腦電分析

大鼠電極植入后，經(jīng)過恢復(fù)，于次日采集局部場電位，使用Cerebus 多通道信號采集系統(tǒng)記錄信號，采樣頻率為30 kHz，每次采集4～5 min，連續(xù)采集3 次，保證至少合計有1 min 時間大鼠處于安靜狀態(tài)作為有效數(shù)據(jù)。剔除模型失敗、手術(shù)失敗、異常數(shù)據(jù)的大鼠后，共20 只大鼠(造模前正常鼠，n＝4；染毒造模大鼠，n＝16)進(jìn)入腦電信號數(shù)據(jù)分析。

原始腦電信號以128 Hz 的頻率降采樣，然后使用0.5～30 Hz 的7 階橢圓帶通濾波器，提取出有用的信號頻帶。選擇一維小波包分解函數(shù)(wpdec)和db4 小波對預(yù)處理后的腦電信號進(jìn)行分解重構(gòu)，為α 波(8～13 Hz)、β 波(14～30 Hz)、θ 波(4～7 Hz)和δ 波(0.5～3.5 Hz)等4 個頻段，計算各波段均方根值和能量占比。其中，均方根值(RMS)用來衡量4 個頻段振蕩的幅值，計算公式如下:

能量(E)是頻段的能量值，計算公式如下:

式中，xn代表第n個樣本點數(shù)據(jù)。

能量占比(pi)是用來計算某個頻段能量相對于4 個頻段總能量的占比，計算公式如下:

式中，Ei為第i個頻段能量值，pi為第i個頻段的能量占比，i取值1～4，分別對應(yīng)α 波、β 波、θ 波、δ 波。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0 進(jìn)行分析。為研究時間節(jié)點(造模前和造模后1～8 周)對局部場電位4 種震蕩成分的幅值和能量占比的影響，采用重復(fù)測量方差分析，若時間對參數(shù)具有顯著影響，則再使用LSD 檢驗對不同時間節(jié)點進(jìn)行成對比較。所有數(shù)據(jù)以P<0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模情況

腹腔注射CO 染毒后，誘發(fā)急性一氧化碳中毒(ACMP)，觀察大鼠的主要表現(xiàn)為:興奮、呼吸短促、爬動頻繁、易怒和體重逐漸增加；部分大鼠口鼻、耳、爪、尾部皮膚呈現(xiàn)櫻桃紅色，行走不穩(wěn)，嗜睡昏迷(見圖1(a))。存活下來的老鼠癥狀逐漸消退，直到蘇醒。正常表現(xiàn)幾周后，開始出現(xiàn)抑郁、肌張力增高、行走不穩(wěn)、毛發(fā)增多、肌肉收縮、暴飲暴食等神經(jīng)癥狀(見圖1(b))。該模型視為接近臨床標(biāo)準(zhǔn)的DEACMP 中毒模型。

圖1 CO 腹腔注射誘導(dǎo)ACMP 和DEACMP 的臨床表現(xiàn)。(a)造模后30 min；(b)造模后3 周Fig.1 Clinical manifestations of ACMP and DEACMP induced by CO injection.(a) 30 min after modeling；(b)Three weeks after modeling

2.2 波段提取

對原始數(shù)據(jù)預(yù)處理，在降低計算量的基礎(chǔ)上提取出有用的信號頻帶，得到降采樣和濾波后的數(shù)據(jù)結(jié)果如圖2所示。將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行一維小波包分解與重構(gòu)，得到α、β、θ 和δ 頻段及其頻譜分布(見圖3)，與設(shè)定的4 個頻段頻譜范圍相符。

圖2 原始腦電信號(上圖)、降采樣(中圖)和濾波(下圖)處理后的信號Fig.2 Original electroencephalogram signal (above)，down- sampling signal (middle) and filtering signal(below).

圖3 一維小波包分解與重構(gòu)后的頻段波形和信號頻譜。(a)頻段波形；(b)信號頻譜Fig.3 Waveforms and signal spectrum after wpdec decomposition and reconstruction.(a) Frequency waveform；(b) Signal spectrum

2.3 振蕩幅值

造模前與造模后8 周的4 個波段均方根值結(jié)果如圖4所示。重復(fù)測量方差分析的結(jié)果表明，時間對幅值具有顯著影響，4 個波段的統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。與造模前相比，造模后1～8 周(后簡稱1～8周)α、β、θ 和δ 波的幅值在大鼠染毒后早期(1/2周)和后期(7/8 周)增加，而在染毒后中期(3/4/5/6 周)接近正常水平。與造模前相比，4 個波段相應(yīng)幅值具體增加的周次分別是α 波、β 波和θ 波，均為1/2/6/7/8 周(α 波見圖4(a)；β 波見圖4(b)；θ 波見圖4(c)。δ 波為造模后1/2/3/4/7/8 周(見圖4(d))，各周的相應(yīng)幅值如表1所示。造模后1～8周，4 個波段的幅值總體呈現(xiàn)出先增加、后降低、再升高的變化趨勢。經(jīng)成對比較表明，4 個振蕩成分在造模后早期和后期的幅值高于造模后中期的振蕩幅值。4 種成分造模后3～6 周的幅值顯著低于1/2/7/8 周的值，如表1所示。

表1 造模前與造模后(1～8 周)的各頻帶振蕩幅值Tab.1 Oscillation amplitude of each frequency band of before and after modeling (1～8 weeks)μV

圖4 造模前與造模后的各頻帶振蕩幅值(每個子圖的橫坐標(biāo)中，0 表示造模前，1～8 表示造模后1～8 周；?P<0.05，??P<0.01，???P<0.005，表示造模前與造模后存在顯著差異)。(a)α 波；(b)β 波；(c)θ 波；(d)δ 波Fig.4 The oscillation amplitude in each frequency band of before and after modeling (In the abscissa of each sub graph，0 represents before modeling，1～8 represents 1～8 weeks after modeling；?P<0.05，??P<0.01，???P<0.005，significant difference between before and after molding).(a)α wave；(b)β wave；(c)θ wave；(d)δ wave

2.4 能量占比

造模前與造模后8 周的4 個頻段能量占比結(jié)果如圖5所示。重復(fù)測量方差分析的結(jié)果表明，時間對能量占比具有顯著影響，統(tǒng)計結(jié)果如表2所示。圖5中與造模前相比，造模后α、β、θ 和δ 波的能量占比在1～8 周出現(xiàn)顯著變化。相對于造模前，造模后1～8 周α 波、β 波和θ 波的能量占比普遍出現(xiàn)顯著減小。3 種成分能量占比顯著減少的周次分別為:α 波為造模后3/4/6/7/8 周(見圖5(a))，β 波為造模后2/3/4/7/8 周(見圖5(b))，θ 波為造模后2/3/4/6/7/8 周(見圖5(c))。相對于造模前，δ 波在1～8 周顯著增加，1～4 周升高較緩，5～8 周逐漸上升(見圖5(d))。其中，α 波的能量占比在1～4周變化較小，而在5～8 周表現(xiàn)為逐步下降，具體的能量占比值如表2所示。成對比較結(jié)果顯示，4 個波段在造模后8 周的能量占比與造模后1～7 周具有顯著差異。δ 波造模后8 周的能量占比顯著高于1～7 周的值，α 波、β 波和θ 波造模后8 周的能量占比顯著低于1～7 周的值，如表2所示。

表2 造模前與造模后(1～8 周)的各頻帶能量占比Tab.2 Energy proportion of each frequency band before and after modeling (1～8 weeks)

圖5 造模前與造模后的各頻帶振蕩能量占比(每個子圖的橫坐標(biāo)中，0 表示造模前，1～8 表示造模后1～8 周；?P<0.05，??P<0.01，???P<0.005，表示造模前與造模后存在顯著差異)。(a)α 波；(b)β 波；(c)θ 波；(d)δ 波Fig.5 The proportion of oscillation energy in each frequency band of before and after (In the abscissa of each sub graph，0 represents before modeling，1～8 represents 1～8 weeks after modeling；?P<0.05，??P<0.01，???P<0.005，significant difference between before and after molding).(a)α wave；(b)β wave；(c)θ wave；(d)δ wave

3 討論

急性一氧化碳中毒的醫(yī)治近年來取得了一定進(jìn)展，但遲發(fā)性腦病的發(fā)病率沒有降下來，主要原因是未及時發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的精神和運動障礙甚至死亡[8]。然而，目前DEACMP 的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究顯示，海馬區(qū)是DEACMP 累及的主要部位之一，該區(qū)是高等動物學(xué)習(xí)記憶與認(rèn)知功能形成的重要腦功能區(qū)，也是調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)并受應(yīng)激影響最重要的腦部結(jié)構(gòu)[12]。因其對缺血和缺氧耐受力很低，所以缺血缺氧會引發(fā)海馬細(xì)胞持續(xù)凋亡[13]，導(dǎo)致智力、記憶力、計算力和空間定位力下降，即出現(xiàn)遲發(fā)性腦病[14]。臨床發(fā)現(xiàn)，一氧化碳中毒除了會繼發(fā)腦組織缺血、缺氧外，還會引發(fā)腦水腫和脫髓鞘等彌漫性損害，會導(dǎo)致大腦振蕩模式受到影響[7]。

鑒于DEACMP 病程發(fā)展呈現(xiàn)異常-正常-再異常的動態(tài)變化[9]，連續(xù)監(jiān)測腦部變化才有可能找到有效的監(jiān)測指標(biāo)。因此，選擇海馬區(qū)作為研究對象，記錄該區(qū)域長時程腦電信號，探究DEACMP 病程發(fā)展對腦電振蕩模式的影響。使用課題組提出的腹腔注射法，建立DEACMP 模型大鼠[9-10]，成功輔以大鼠的行為學(xué)評價判斷造模。通過分析α、β、θ 和δ波等4 個頻段振蕩的均方根值，發(fā)現(xiàn)DEACMP 模型大鼠海馬區(qū)4 個波段振蕩的幅值在發(fā)病早期(1/2周)普遍存在異常，可能與腦水腫產(chǎn)生的高幅彌漫性電活動和脫髓鞘造成的神經(jīng)傳導(dǎo)速度失衡和頻率紊亂有關(guān)[13]。臨床上診斷DEACMP 的先決條件之一，就是在疾病開始時腦電信號出現(xiàn)100%異常[6]。因此，這4 種波形早期的顯著增加可能預(yù)示著DEACMP 發(fā)病的風(fēng)險。在后期(7/8 周)4 個波幅值也表現(xiàn)出普遍增加，可歸因于DEACMP 病情加重。而在中期有一些時段的幅值則顯著降低，整體呈現(xiàn)增加-降低-增加的變化趨勢，這可能與DEACMP 的假愈期異常-正常-再異常的變化有關(guān)[14-15]。

局部場電位(LFP)與頭皮腦電(EEG)都是對腦電信號進(jìn)行測量，兩者之間既有區(qū)別又有聯(lián)系。局部場電位(LFP)通過植入電極，記錄大腦特定核團(tuán)中全部神經(jīng)元的電活動信號。頭皮腦電(EEG)利用置于頭皮上表面電極，無創(chuàng)地測量大腦神經(jīng)活動生物電位。二者之間有相關(guān)關(guān)系，互為表征[16]。本研究各頻段能量占比的結(jié)果表明，DEACMP 組的δ波頻所占比例顯著增加，α 波、β 波占比顯著減小。這與臨床上DEACMP 患者的EEG 呈廣泛慢波活動，α、β 波解體、減弱，δ 波廣泛出現(xiàn)的結(jié)果一致[17]。δ 波占比增加和α 波占比降低的結(jié)果就產(chǎn)生了臨床上α 波頻率減慢的現(xiàn)象，該現(xiàn)象是腦功能減退的早期敏感指標(biāo)[18]。進(jìn)一步觀察病程進(jìn)展對能量占比的影響發(fā)現(xiàn)，能量占比變化可分為波動段和持續(xù)變化段。造模后1～4 周，δ 波和α 波占比有所波動；而在5～8 周，δ 波占比呈現(xiàn)持續(xù)上升，α 波占比則持續(xù)下降。這種分段變化可能與DEACMP患者腦部病變加重有關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腦電信號波形的異常程度與疾病輕重具有對應(yīng)關(guān)系。輕度異常EEG 表現(xiàn)為低中幅的α 波為主；中度異常EEG表現(xiàn)為混有高幅的δ 波；重度異常EEG 表現(xiàn)為廣泛性波幅平坦，有大量的δ 波出現(xiàn)[18-19]。因此，病程后期δ 波占比持續(xù)增加和α 波占比持續(xù)減少變化，提示海馬區(qū)應(yīng)存在中重度異常，如腦組織缺氧細(xì)胞受損加重，廣泛受累[20-21]。

4 結(jié)論

以DEACMP 主要受累部位之一的海馬區(qū)作為研究對象，記錄該區(qū)域長時程(8 周)的腦電信號，提出以腦電振蕩幅值和能量占比兩個參數(shù)監(jiān)測DEACMP 假愈期病程變化。結(jié)果表明，腦電振蕩各波段幅值初期的普遍異常可能預(yù)示DEACMP 發(fā)生高風(fēng)險；δ 波能量占比偏高和α 波能量占比偏低不僅可以作為早期指標(biāo)，二者分段變化還可不受假愈期表象影響來表征疾病嚴(yán)重程度。因此，本研究提出腦電振蕩分析方法不僅可作為預(yù)測DEACMP 發(fā)病風(fēng)險的指標(biāo)，而且還可表征DEACMP 的實際嚴(yán)重程度，為監(jiān)測DEACMPD 的EEG 特征提供了一種新方法。后續(xù)將進(jìn)一步研究使用無創(chuàng)的頭皮腦電驗證方法的有效性，從而推進(jìn)該方法的臨床應(yīng)用。