劉 麗 萬辰杰 王 碩 李崇崇 柯林楠 王春仁

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

引言

隨著人工生物心臟瓣膜(以下簡稱生物瓣膜)材料和技術(shù)的不斷進(jìn)展，以及對(duì)人工機(jī)械心臟瓣膜(以下簡稱機(jī)械瓣膜)終身抗凝并發(fā)癥的重視，越來越多的臨床研究顯示了生物瓣膜的優(yōu)越性[1-4]。2017年發(fā)布的瓣膜性心臟病治療指南(ESC/EACTS guidelines for the management of valvular heart disease)[5]推薦50 歲以下患者選擇機(jī)械瓣膜，70 歲以上患者選擇生物瓣膜，50～70 歲患者兩種瓣膜都可以考慮，臨床生物瓣膜植入患者年齡有降低的趨勢。

目前生物瓣膜一般使用牛心包或豬主動(dòng)脈瓣經(jīng)戊二醛交聯(lián)材料制備，貯存于含戊二醛的保存液中(以下簡稱為濕性生物瓣膜)，優(yōu)勢在于患者不需要終生服用抗凝藥物。但生物瓣膜發(fā)生瓣膜鈣化毀損和再次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)更高，且再次開胸手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)比首次手術(shù)明顯增高。隨著生物材料的發(fā)展，近年來出現(xiàn)了通過覆蓋牛心包材料鈣結(jié)合位點(diǎn)的牛心包處理技術(shù)，并以此為瓣葉材料制備出新型干燥組織生物瓣膜(以下簡稱為干性生物瓣膜)，為生物瓣膜提供了更加優(yōu)異的抗鈣化性能和生物力學(xué)性能[6]。同時(shí)，干性生物瓣膜在常溫下干燥貯存，大幅降低了瓣膜運(yùn)輸和貯存成本。濕性瓣膜需要保存在含戊二醛保存液中，在2℃～8℃冷藏條件下運(yùn)輸和貯存。因此，干性生物瓣膜是未來生物瓣膜發(fā)展的趨勢。

目前，干性生物瓣膜剛剛進(jìn)入臨床階段，缺少長期耐久性數(shù)據(jù)。本研究對(duì)一種干性生物瓣膜進(jìn)行體外加速耐久性能測試，通過瓣膜脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)、瓣葉熱力學(xué)分析和顯微鏡下膠原纖維觀察對(duì)其耐久性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為干性生物瓣膜臨床耐久性能評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品:干性生物瓣膜(23 和32 mm 兩種規(guī)格各3 個(gè))，測試環(huán)境參數(shù)模擬及標(biāo)準(zhǔn)參照為主動(dòng)脈瓣位。

實(shí)驗(yàn)用流體為0.9%生理鹽水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

耐久性能測試采用人工心臟瓣膜疲勞測試系統(tǒng)和脈動(dòng)流性能測試系統(tǒng)(加拿大VIVITRO Lab)。疲勞測試系統(tǒng)提供100 mmHg 的平均反向壓力，1 000 次/min 的加速頻率；脈動(dòng)流性能測試系統(tǒng)模擬主動(dòng)脈瓣部位流動(dòng)環(huán)境，提供生理壓力及流量波形，2～7 L/min 的模擬心輸出量。瓣葉熱力學(xué)分析采用差示掃描量熱儀(DSC 214 Polyma，Netzsch)測試。瓣葉膠原纖維結(jié)構(gòu)分析采用雙光子共聚焦顯微鏡(A1R MP，Nikon)測試。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 耐久性能測試

耐久性能測試是評(píng)價(jià)瓣膜長期有效性的體外測試方法。該實(shí)驗(yàn)?zāi)M瓣膜臨床使用條件及使用時(shí)間，對(duì)瓣膜的長期使用性能進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)YY/T1449.3-2016 及ISO 5840-3:2013 人工心臟瓣膜標(biāo)準(zhǔn)[7-8]，對(duì)于生物瓣膜一般考慮模擬臨床使用5年時(shí)間(2 億次循環(huán))過程中瓣膜的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。瓣膜做為血液系統(tǒng)的閥門，其流體力學(xué)性能是其最重要的性能指標(biāo)，因此，在耐久性能測試過成中，通過脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)對(duì)干性生物瓣膜流流體力學(xué)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而評(píng)價(jià)其耐久性能。

將待測干性生物瓣膜安裝在人工心臟瓣膜疲勞測試系統(tǒng)對(duì)應(yīng)測試腔中。通過調(diào)節(jié)電機(jī)運(yùn)動(dòng)幅值及頻率，使得通過干性生物瓣膜平均跨瓣壓差為100 mmHg，至少95%的循環(huán)達(dá)到通過閉合瓣膜的定義目標(biāo)壓差峰值100 mmHg，每個(gè)循環(huán)中至少有5%的時(shí)間里所受壓差是等于或大于100 mmHg，調(diào)節(jié)測試頻率為1 000 次/min。每完成0.5 億次循環(huán)取出干性生物瓣膜進(jìn)行脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)，測試其流體力學(xué)性能，直至2 億次耐久性能測試結(jié)束。

1.3.2 脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)

脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)用來測試瓣膜在脈動(dòng)條件下的流體力學(xué)性能，該流體力學(xué)性能主要通過平均跨瓣壓差、返流百分比、有效瓣口面積和能量損失4 個(gè)指標(biāo)反映。其中，平均跨瓣壓差是循環(huán)的正壓差階段，瓣膜兩側(cè)的壓差對(duì)時(shí)間的算術(shù)平均值，是用來評(píng)價(jià)瓣膜狹窄的重要指標(biāo)。返流百分比是一個(gè)循環(huán)內(nèi)反向通過瓣膜的流量與前向流階段通過瓣膜的流量的百分比，以評(píng)價(jià)瓣膜返流的重要指標(biāo)。有效瓣口面積通過壓差和流量計(jì)算得出，更直觀地反映瓣膜的性能。能量損失以瓣膜一個(gè)循環(huán)計(jì)算，包括瓣膜開啟和關(guān)閉兩個(gè)過程，反映瓣膜的效能。

將待測干性生物瓣膜安裝在脈動(dòng)流測試系統(tǒng)上，在平均主動(dòng)脈壓100 mmHg、心率70 次/min，心輸出量5.0 L/min 的實(shí)驗(yàn)條件下測試干性生物瓣膜的平均跨瓣壓差、返流百分比、有效瓣口面積和能量損失。每個(gè)條件下選取10 個(gè)循環(huán)測試并計(jì)算平均值。將0、0.5、1.0、1.5、2.0 億次的干性生物瓣膜脈動(dòng)流性能測試結(jié)果進(jìn)行對(duì)比和分析。

1.3.3 瓣葉熱力學(xué)分析

分別取耐久性能測試前后的干性生物瓣膜瓣葉樣品用濾紙吸干表面水分，稱量約5 mg，置于差示掃描量熱儀的鋁制樣品盤中，密封加熱，起始溫度為10℃，每分鐘升高2℃，最終至150℃。以吸熱峰值作為樣品的變性溫度。

1.3.4 瓣葉膠原纖維結(jié)構(gòu)分析

取耐久性能測試前后的干性生物瓣膜瓣葉在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察，激光設(shè)置為840 nm 的激發(fā)波長，以誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)依賴的自體熒光和二次諧波產(chǎn)生(second harmonic generation，SHG)。選擇檢測器前的低通濾波器采集膠原的SHG 信號(hào)。探測器的針孔被設(shè)置為最大值以收集焦平面上產(chǎn)生的所有光線。

2 結(jié)果

2.1 耐久性能

干性生物瓣膜在100 mmHg 平均壓力、70 次/min 心率、5 L/min 心輸出量條件下的脈動(dòng)流性能數(shù)據(jù)見表1。YY/T1449.3－2016[7](等同轉(zhuǎn)化于ISO 5840.3∶2013)對(duì)于左心植入的瓣膜的最低脈動(dòng)流性能做了規(guī)定，具體要求見表1。經(jīng)過2 億次耐久性能測試的干性生物瓣膜脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全滿足該標(biāo)準(zhǔn)的要求，說明干性生物瓣膜經(jīng)過2 億次耐久性能測試后仍具有良好的流體力學(xué)性能。

表1 干性生物瓣膜耐久性能測試后脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The pulsatile-flow testing results of the dry bioprosthetic valve after durability testing

2.2 脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)結(jié)果

干性生物瓣膜2 億次耐久性能測試中，每完成0.5 億次循環(huán)后進(jìn)行脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3 個(gè)瓣膜測試結(jié)果平均值。從圖1可以看出，經(jīng)過2 億次循環(huán)后，23 mm 規(guī)格干性生物瓣膜平均跨瓣壓差有所升高，但仍處于同規(guī)格生物瓣膜較低水平，32 mm 規(guī)格干性生物瓣膜平均跨瓣壓差變化不大；2 個(gè)規(guī)格干性生物瓣膜有效瓣口面積耐久性能測試前后基本一致，說明體外加速疲勞測試后，干性生物瓣膜未發(fā)生明顯的狹窄；測試前后，返流百分比無明顯變化，說明體外加速疲勞測試后，干性生物瓣膜未出現(xiàn)明顯的返流；能量損失無明顯變化，說明干性生物瓣膜體外加速疲勞測試后，瓣膜的效能無明顯降低。

圖1 干性生物瓣膜耐久性能測試中脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(a)跨瓣壓差；(b)返流百分比；(c)有效瓣口面積；(d)能量損失Fig.1 The pulsatile-flow testing results of the dry tissue bioprosthetic valve after durability testing.(a) Mean pressure gradient；(b) Paravalvular leakage；(c) Effective orifice area；(d) Energy loss

2.3 熱力學(xué)分析結(jié)果

干性生物瓣膜耐久性能測試前后，瓣葉熱變性溫度見圖2。從圖2可以看出，經(jīng)過2 億次耐久性能測試后，瓣葉材料的熱力學(xué)變性溫度降低，從96.6℃變?yōu)?1.2℃，熱變性溫度是組織內(nèi)存在化學(xué)鍵的表現(xiàn)，這些鍵維持了蛋白質(zhì)內(nèi)或蛋白質(zhì)間三維、四維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。疲勞后變性溫度降低，表明一些化學(xué)鍵受到破壞，鍵合程度降低，瓣葉交聯(lián)程度降低。

圖2 瓣葉熱力學(xué)分析測試曲線。(a)耐久性能測試前；(b)耐久性能測試后Fig.2 The test curve of valve thermodynamic analysis.(a) Before durability-testing；(b) After durability-testing

2.4 膠原纖維結(jié)構(gòu)

分別取耐久性能測試前后的干性生物瓣膜的瓣葉在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察，激光激發(fā)波長為840 nm，測試結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，在同樣測試條件下，經(jīng)過2 億次耐久性能測試后的瓣葉亮度變暗，但膠原纖維形狀未發(fā)生變化，仍是卷曲的立體結(jié)構(gòu)，說明膠原纖維含量降低，化學(xué)鍵部分丟失，跟熱變性溫度的表現(xiàn)是一致的。

圖3 雙光子共聚焦顯微鏡下840 nm 激發(fā)波長下的圖像。(a)耐久性能測試前；(b)耐久性能測試后Fig.3 The image at 840 nm excitation wavelength under double light confocal microscope.(a)Before durability-testing；(b) After durability-testing

3 討論

人工心臟瓣膜是用來治療瓣膜功能失效引起的結(jié)構(gòu)性心臟病的長期植入的醫(yī)療器械，目前主要有生物瓣膜和機(jī)械瓣膜兩種材質(zhì)[9]。與機(jī)械瓣膜性比，生物瓣膜植入后無需終身抗凝，流體力學(xué)性能更好，出血事件和血栓栓塞率較低。但生物瓣膜壽命有限，可能發(fā)生瓣膜撕裂、瓣葉鈣化、人工瓣膜感染性心內(nèi)膜炎等不良事件，一些植入生物瓣膜的患者更是過早的出現(xiàn)了這些不良事件，并未達(dá)到預(yù)期的使用壽命[10-12]。耐久性能測試是臨床前評(píng)價(jià)人工心臟瓣膜安全性的主要方法。人工心臟瓣膜行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1449.3-2016 及目前對(duì)于人工心臟瓣膜耐久性的研究[13-14]中，重點(diǎn)關(guān)注瓣膜的開閉狀態(tài)和流體力學(xué)性能，而對(duì)于生物瓣膜，瓣葉材料為動(dòng)物源性材料，可能出現(xiàn)瓣膜流體力學(xué)性能尚未發(fā)生衰退，但瓣葉已發(fā)生微觀改變。因此有必要在瓣膜耐久性能測試中對(duì)瓣葉進(jìn)行進(jìn)一步測試分析。

本課題對(duì)一種新型干性生物瓣膜進(jìn)行耐久性能測試，并首次采用熱力學(xué)分析和雙光子激光共聚焦顯微鏡對(duì)耐久性能測試后的瓣葉進(jìn)行分析，從微觀角度對(duì)干性瓣膜耐久性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。耐久性能測試后瓣葉材料變性溫度有一定下降，表明一些化學(xué)鍵受到破壞，鍵合程度降低，瓣葉交聯(lián)程度降低，雙光子激光共聚焦顯微鏡下觀察到，在同樣測試條件下，亮度變暗，但膠原纖維形狀未發(fā)生變化，仍是卷曲的立體結(jié)構(gòu)，說明膠原纖維含量降低，化學(xué)鍵部分丟失，跟熱變性溫度的表現(xiàn)是一致的。說明經(jīng)過2 億次耐久性能測試，干性生物瓣膜瓣葉在纖維結(jié)構(gòu)方面發(fā)生了變化，但干性生物瓣膜耐久性能測試前后流體力學(xué)性能無顯著變化，仍具有良好的流體力學(xué)性能。說明熱變性溫度和膠原纖維結(jié)構(gòu)對(duì)于評(píng)價(jià)生物瓣膜耐久性能具有一定意義。

4 結(jié)論

干性生物瓣膜經(jīng)過2 億次疲勞測試后，瓣葉膠原纖維含量減少，但結(jié)構(gòu)仍保持完整的三維結(jié)構(gòu)，熱變性溫度有所降低，瓣膜脈動(dòng)流性能未發(fā)生明顯變化，均滿足YY/T1449.3-2016 標(biāo)準(zhǔn)中性能要求，說明耐久性能測試后，干性生物瓣膜仍具有良好的流體力學(xué)性能。