劉 佳 ， 盧玉婷 ， 劉蕓娜 ， 閆子豪 ， 汪惠慶 , 李月紅

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長春 130118)

鯉春病毒血癥病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)引起的鯉春病毒血癥(Spring viremia of carp,SVC)是一種具有高致病性、高死亡率和高傳染性的疾病，該病危害多種魚類，并且引起的魚類死亡率最高可達(dá)90%[1]。SVCV屬于彈狀病毒科，水泡病毒屬，其基因組為線性單股負(fù)鏈RNA[2]。SVCV以魚鰓為入口感染侵入魚體中，入侵魚體后迅速地在魚體內(nèi)增殖并導(dǎo)致魚體產(chǎn)生病變，主要表現(xiàn)為病魚皮膚發(fā)黑并出現(xiàn)斑點(diǎn)狀出血點(diǎn)，眼球凸出，鰓、肌肉呈現(xiàn)紅色，魚鰾充血，腹部積水和瀉殖孔發(fā)炎等[3]。SVCV暴發(fā)通常會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖過程中鯉科魚類的大量發(fā)病和死亡，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。但由于人們對(duì)這種病原體了解甚少，目前并未開發(fā)出針對(duì)SVCV的疫苗。此外，雖然目前尚未有報(bào)道稱SVCV對(duì)人類存在危害，但是有機(jī)藥物殘留導(dǎo)致的食品安全問題對(duì)人體健康的影響亦不可小覷。因此，尋求一種積極有效的防治方法勢在必行。維生素C是魚類必需的營養(yǎng)物質(zhì)，具有促進(jìn)魚類生長、減少組織氧化損傷、提高魚類抗應(yīng)激能力、增強(qiáng)魚類抵抗病原侵襲能力并提高特異性免疫功能等作用，并且維生素C對(duì)人體無害[4-5]。有研究表明，在金頭鯛飼料中添加適量的維生素C能提高金頭鯛的免疫力；長期投喂大西洋鮭幼魚缺乏維生素C的飼料，幼魚的死亡率顯著升高； 投喂含有維生素C的飼料能改善雜交鱘幼魚的肌肉品質(zhì)，增強(qiáng)魚體的抗氧化性能并且不改變雜交鱘幼魚的生長性能和肌肉營養(yǎng)成分[4,6]。因此，本試驗(yàn)選擇維生素C對(duì)SVCV進(jìn)行體外抑制試驗(yàn)，以期能夠?yàn)镾VCV防治藥物的研發(fā)提供新的思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料 鯉魚上皮瘤細(xì)胞(Epithelioma papulosum cyprini,EPC)，Gibco M199細(xì)胞培養(yǎng)基(北京 Solarbio公司)，10%胎牛血清，1%雙抗(青霉素和鏈霉素)，于4 ℃保存。維生素C溶液:無血清培養(yǎng)基將其稀釋成20、40、60 μmol/L和80 μmol/L，4 ℃保存。二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]溶液和胰酶消化液等，均購自長春夢怡美生物科技有限公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)試劑，購自武漢塞維爾生物；活性氧(ROS)試劑，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。EPC、SVCV 為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 方法

1.2.1 病毒滴度的測定 將EPC接種于96孔板中，在27 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞密度至80%～90%時(shí)接入病毒，將病毒原液依次稀釋10倍加入細(xì)胞中，濃度分別為10-1～10-11，每個(gè)濃度做8個(gè)重復(fù)，每孔加入100 μL，觀察細(xì)胞病變情況，記錄出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)現(xiàn)象的孔數(shù)。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。

1.2.2 細(xì)胞活性的測定 將EPC接種于3個(gè)96孔 板中，在27 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞培養(yǎng)液除去，第1個(gè)孔板中將維生素C按照0、20、40、60 μmol/L和80 μmol/L的濃度加入細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h；第2個(gè)孔板中將SVCV按照10-1、10-3、10-5、10-7的濃度加入細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h； 第3個(gè)孔板中，先將維生素C按照0、20、40、60 μmol/L和80 μmol/L的濃度加入細(xì)胞中，梯度降溫至17 ℃培養(yǎng)24 h，然后再加入濃度為10-1的SVCV培養(yǎng)24 h；最后用MTT法測量490 nm處的OD值，計(jì)算不同作用條件下的細(xì)胞活性。

1.2.3 維生素C對(duì)SVCV的抑制作用 將EPC接種于96孔板中，在27 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；將0、20、40、60 μmol/L和80 μmol/L的維生素C接入孔板中，梯度降溫至17 ℃培養(yǎng)24 h，然后加入濃度為10-1的SVCV，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最后用MTT法測量490 nm處的OD值，計(jì)算維生素C對(duì)SVCV的抑制作用。

1.2.4 DAPI染色 將EPC接種于24孔板中，在27 ℃、 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將80 μmol/L的維生素C加入細(xì)胞中，3個(gè)重復(fù)，其他孔分別加入濃度為0、10-1、10-3、10-5、10-7的SVCV，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，梯度降溫至17 ℃培養(yǎng)24 h，去除維生素C和SVCV并用PBS清洗2遍，最后加入DAPI溶液，避光培養(yǎng)30 min后，去除DAPI溶液，用PBS清洗2遍并加入PBS，用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.2.5 活性氧測定 將EPC接種于24孔板中，在27 ℃、 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將0、20、40、60 μmol/L和80 μmol/L的維生素C加入細(xì)胞中，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，梯度降溫至17 ℃培養(yǎng)24 h，然后加入濃度為10-1的SVCV，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除維生素C和SVCV后用PBS清洗2遍，最后加入含有DCFH-DA的M199培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)30 min后，去除含有DCFH-DA的培養(yǎng)基后用PBS清洗2遍并加入PBS，用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行拍攝。

2 結(jié)果

2.1 病毒滴度測定 結(jié)果見表1。由公式計(jì)算可得TCID50=10-8.54，即當(dāng)SVCV稀釋度為10-8.54時(shí)，可使孔內(nèi)50%的細(xì)胞發(fā)生病變。

表1 病毒滴度的測定結(jié)果Table 1 Results of virus titer test

2.2 細(xì)胞活性測定 結(jié)果見圖1。從圖1可知，維生素C對(duì)EPC的細(xì)胞活性無顯著影響 (P>0.05)；SVCV能夠顯著降低EPC的細(xì)胞活性，在濃度為10-1時(shí)對(duì)細(xì)胞活性的影響最為顯著(P<0.05)；而維生素C能夠顯著改善SVCV對(duì)細(xì)胞活性的影響。

圖1 細(xì)胞活性的測定Fig.1 Cell viability assayA:維生素C對(duì)細(xì)胞活性的影響; B:SVCV對(duì)細(xì)胞活性的影響; C: 維生素C和SVCV對(duì)細(xì)胞活性的影響不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同A: Effect of vitamin C on cell viability; B: Effect of SVCV on cell viability; C:Effect of vitamin C and SVCV on cell viability Different letters indicated significant difference (P<0.05). The same as below

2.3 維生素C對(duì)SVCV的抑制效果測定 結(jié)果見表2。從表2可知，不同濃度的維生素C均對(duì)SVCV有一定的抑制作用，在本試驗(yàn)中，80 μmol/L的維生素C對(duì)SVCV的抑制作用最強(qiáng)。

表2 維生素C對(duì)SVCV抑制結(jié)果Table 2 Inhibitory results of Vitamin C on SVCV

2.4 DAPI染色 由圖2可知，80 μmol/L的維生素C對(duì)EPC無顯著影響，而濃度為10-1的SVCV對(duì)細(xì)胞影響最為顯著，隨著SVCV濃度的增高，病毒對(duì)EPC的傷害越大。

圖2 DAPI染色 (200×)Fig.2 DAPI staining (200×)A：對(duì)照組； B：80 μmol/L維生素C組; C：10-1 SVCV組； D：10-3 SVCV組； E：10-5 SVCV組； F：10-7 SVCV組A:Control group; B:80 μmol/L vitamin C group; C:10-1 SVCV group; D:10-3 SVCV group; E:10-5 SVCV group; F:10-7 SVCV group

2.5 活性氧測定 由圖3可知，SVCV使EPC產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激，而維生素C能夠顯著改善SVCV引起的ROS的產(chǎn)生。

圖3 ROS檢測 (200×)Fig.3 Determination of ROS (200×)A：對(duì)照組; B：SVCV組; C：SVCV+80 μmol/L維生素C組; D：SVCV+60 μmol/L維生素C組; E：SVCV+40 μmol/L維生素C組; F：SVCV+20 μmol/L維生素C組A:Control group; B:SVCV group; C:SVCV+80 μmol/L vitamin C group; D:SVCV+60 μmol/L vitamin C group; E:SVCV + 40 μmol/L vitamin C group; F:SVCV + 20 μmol/L vitamin C group

3 討論

為了探討維生素C體外抑制SVCV感染EPC的能力，本試驗(yàn)構(gòu)建體外EPC模型，用MTT法測定添加維生素C和SVCV 對(duì)EPC活性的影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，維生素C對(duì)細(xì)胞活性無顯著影響，SVCV對(duì)細(xì)胞活性影響顯著，其中SVCV濃度為10-1時(shí)，明顯降低細(xì)胞活性。從維生素C抑制SVCV感染細(xì)胞和維生素C緩解SVCV引起的氧化應(yīng)激兩方面討論維生素C對(duì)SVCV作用效果，本試驗(yàn)結(jié)果表明，80 μmol/L 的維生素C對(duì)SVCV具有最顯著的抑制效果并能降低SVCV引起的氧化應(yīng)激。此外，維生素C對(duì)SVCV的抑制率隨著維生素C濃度的增高而增高，在80 μmol/L時(shí)抑制率最高，達(dá)34.70%。

在細(xì)胞正常的生長代謝過程中會(huì)持續(xù)的產(chǎn)生活性氧(ROS)，活性氧對(duì)大部分細(xì)胞都有毒性[7]。大量的研究表明，維生素C能夠增強(qiáng)魚體的抗氧化能力，包括軍曹魚[8]、青魚[9]、黃鱔[10]、圓斑星鰈幼魚[11]、虹鱒[12]和雜交鱘[4]等。此外，維生素C還可促進(jìn)魚類生長，緩解環(huán)境等不良應(yīng)激反應(yīng)，提高魚體自身免疫力[13-15]。在本試驗(yàn)中，維生素C能明顯緩解SVCV引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激。

目前關(guān)于SVCV的感染機(jī)理尚不清楚，也未研制出有效的治療性藥物和預(yù)防性疫苗。由SVCV暴發(fā)導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失數(shù)目巨大，所以研制出有效的治療藥物和預(yù)防疫苗以及對(duì)于該病毒的入侵機(jī)理的研究迫在眉睫。維生素C作為動(dòng)物生長、生產(chǎn)及維持正常生理功能必不可少的一種營養(yǎng)物質(zhì)，在EPC上對(duì)SVCV具有顯著的抑制效果，且維生素C對(duì)魚體中粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和水分含量沒有顯著性影響[16-18]。本試驗(yàn)選定維生素C作為試驗(yàn)對(duì)象，探究維生素C對(duì)SVCV的抑制效果，以期為SVCV的防治提供理論基礎(chǔ)，開發(fā)新的思路，為生產(chǎn)高效的藥物及疫苗提供科學(xué)依據(jù)。