牟 琳 劉 蘋 李 來 岳婭婷

糖尿病性白內障是糖尿病患者中發(fā)生較早且具有致盲性的眼部并發(fā)癥之一[1]，其發(fā)生機制復雜。晶狀體上皮細胞全程參與晶狀體纖維的分化過程，其中上皮細胞間質轉化(EMT)是關鍵環(huán)節(jié)，對于開發(fā)新的治療方法具有重要意義[2]。然而，EMT調節(jié)糖尿病性白內障的分子機制仍有待進一步探討。有證據(jù)表明，EMT過程受到多種因素的調控，如microRNAs (miRNAs)[3-5]。曾凱宏等[6]發(fā)現(xiàn)高糖可誘導視網(wǎng)膜Müller細胞miR-29b表達降低，說明miR-29b在糖尿病早期視損傷中屬于保護性因子。郭小雷[5]證實miR-29b在高糖誘導的足細胞中表達量降低，而黃連素可以通過上調miR-29b表達延緩高糖誘導的足細胞EMT進程，因此，我們推斷miR-29b是一類與EMT密切相關的miRNAs，這種靶向EMT的生物學分子有望成為預防或治療糖尿病性白內障的重要靶標。因此，本研究擬分析miR-29b對糖尿病性白內障晶狀體上皮細胞EMT的調控作用，并進一步研究其可能的分子機制，以期為糖尿病性白內障的機制研究及臨床治療提供新的可行性靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞人晶狀體上皮細胞HLE-B3(ATCC CRL-11421TM)購自美國典型菌種保藏中心。

1.2 主要試劑及儀器DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Sigma公司；Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑和LipofectamineTM2000轉染試劑均購自美國Invitrogen公司；RIPA細胞裂解液和蛋白定量試劑盒購自上海碧云天有限公司；反轉錄試劑盒與SYBR Premix Ex Taq 試劑盒均購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報告試劑盒購自美國Promega公司；Western blot一抗：兔抗人N-鈣黏蛋白(N-Cadherin)多克隆抗體(11000)、兔抗人E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)多克隆抗體(11000)、兔抗人波形蛋白(Vimentin)多克隆抗體(11000)均購自美國CST公司，兔抗人特異性蛋白1(SP-1)單克隆抗體(150)購自美國Abcam公司；免疫熒光一抗：兔抗人N-Cadherin多克隆抗體(1100)、兔抗人E-Cadherin多克隆抗體(11000)、兔抗人Vimentin多克隆抗體(11000)均購自美國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及高糖處理HLE-B3細胞用含有體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞分組處理，各組細胞分別用含有5.5 mmol·L-1D-葡萄糖 (正常組)、10.5 mmol·L-1D-葡萄糖 、15.5 mmol·L-1D-葡萄糖 、25.5 mmol·L-1D-葡萄糖、35.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24 h；或用含有35.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h，實時熒光定量PCR檢測各組細胞miR-29b和SP-1 mRNA相對表達量，Western blot檢測各組細胞SP-1蛋白表達水平。

1.3.2 細胞轉染與分組取對數(shù)生長期HLE-B3細胞分為：正常組(用含有5.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)、高糖組(用含有35.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)、陰性組(轉染miRNA模擬物scramble和陰性siRNA序列)、miR-29b mimics組(轉染miR-29b模擬物)、miR-29b mimics+SP-1組(轉染miR-29b模擬物和SP-1基因序列)，除正常組外其余各組細胞均用含有35.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。由上海GenePharma公司化學合成了人miR-29b模擬物和模擬物陰性對照序列。miR-29b模擬物基因序列為：正向： 5’-UAGCAUCACAGAAAUAUUGGC-3’，反向： 5’-CAAUAUUUCUGUGCUGCUAUU-3’。細胞在6孔板中的融合率為70%～80%時，用Lipofectamine RNAiMAX質粒轉染miR-29b模擬物和模擬物陰性對照序列48 h后，實時熒光定量PCR檢測各組細胞miR-29b相對表達量。此外委托上海Sangon Biotech公司以化學方法合成了人SP-1基因特異性序列和陰性對照序列。用LipofectamineTM2000質粒轉染細胞6 h，然后更換培養(yǎng)基。繼續(xù)轉染48 h后進行后續(xù)實驗。SP-1基因序列為：正向：5’-CCGCTCGAGTTGAUUTGAGGAGACATCTA-3’；反向：5’-ATAAGAATGCGGCCGCAGCATTTACCCACAGCC-3’(該引物序列含有與miR-29b互補的靶序列)；陰性對照序列為：正向：5’-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’；反向：5’-GUACUUUUGUGUAGUACAGUU-3’，作為陰性對照。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測細胞miR-29b和SP-1的mRNA表達使用總RNA提取試劑盒提取總RNA并用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA后，用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行PCR，PCR擴增條件為:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。以小分子U6 mRNA或GAPDH為內參，結果分析采用2-ΔΔCt法。

1.3.4 Transwell實驗檢測細胞垂直遷移活性將細胞按10×103個·mL-1接種至Transwell上層小室(孔徑8 μm)中，用200 μL無血清DMEM(5.5 mmol·L-1D-葡萄糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時在下層小室中加入600 μL含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM(35.5 mmol·L-1D-葡萄糖)培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，用棉簽仔細擦拭上層小室的細胞。然后將濾紙固定在40 g·L-1多聚甲醛中30 min，用1 g·L-1結晶紫染色20 min。在倒置顯微鏡下對5個隨機視野的染色細胞進行計數(shù)。每個實驗均重復3次。

1.3.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移活性將細胞按20×103個·mL-1接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜達到80%以上融合。用200 mL移液管尖端劃傷單層細胞，制作人工傷口。分別用含5.5 mmol·L-1或35.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h。倒置顯微鏡下拍照。劃痕愈合率=(劃痕寬度0 h-劃痕寬度24 h)/劃痕寬度0 h×100%。

1.3.6 免疫熒光染色法檢測細胞中EMT相關蛋白表達和定位將細胞培養(yǎng)于12孔平板中，放置一蓋玻片進行細胞爬片。經(jīng)過不同處理后，用40 g·L-1多聚甲醛固定玻片上的細胞30 min。PBS洗滌3次×5 min，然后用體積分數(shù)1% Triton X-100在PBS中處理30 min，以提高細胞膜的通透性。為了減少非特異性免疫反應，在室溫下將10 g·L-1牛血清白蛋白滴于細胞上30 min，然后將細胞與初級抗體(抗N-Cadherin、抗E-Cadherin、抗Vimentin、抗SP-1)在4 ℃下孵育過夜。用熒光標記的山羊抗兔IgG二抗孵育 1 h 后，用DAPI染色細胞核。采用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察染色細胞并獲得圖像。

1.3.7 Western blot檢測細胞蛋白表達各組細胞用RIPA裂解液裂解后提取細胞總蛋白，用蛋白定量試劑盒對蛋白定量后，將蛋白在100 g·L-1十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中電泳分離，然后轉移到聚偏氟乙烯膜上。50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入N-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、SP-1一抗孵育過夜，然后經(jīng)山羊抗兔IgG二抗孵育后用ECL化學發(fā)光法顯影，蛋白表達水平根據(jù)β-微管蛋白(β-Tubulin)進行標化。

1.3.8 雙熒光素酶報告基因檢測使用重疊PCR法擴增得到miR-29b及SP-1基因野生型和突變型序列，先用XhoI與Xbal雙酶切pmirGIO載體，再將miR-29b及SP-1目的片段與pmirGIO雙黏載體構建成pmirGIO-miR-29b及pmirGIO-SP-1重組載體，最后將細胞接種于24孔板，待細胞長至70%～80%時，用LipofectamineTM2000將重組報告載體轉染入細胞中。對照組轉染miR-NC質粒。轉染后24 h，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析結果以均數(shù)±標準差表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)。檢驗水準為：α=0.05。

2 結果

2.1 高糖對HLE-B3細胞形態(tài)的影響光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組HLE-B3細胞排列緊密，呈鵝卵石樣貼壁生長；10.5 mmol·L-1D-葡萄糖組、15.5 mmol·L-1D-葡萄糖組、25.5 mmol·L-1D-葡萄糖組、35.5 mmol·L-1D-葡萄糖組培養(yǎng)細胞24 h后，部分細胞表現(xiàn)出一定的纖維樣細胞特性，尤其是用25.5 mmol·L-1D-葡萄糖、35.5 mmol·L-1D-葡萄糖處理的細胞出現(xiàn)變長趨勢且數(shù)量減少(圖1)。

圖1 不同濃度D-葡萄糖培養(yǎng)下HLE-B3細胞形態(tài)特征(×200) A：正常組；B：10.5 mmol·L-1 D-葡萄糖組；C：15.5 mmol·L-1 D-葡萄糖組；D：25.5 mmol·L-1 D-葡萄糖組；E：35.5 mmol·L-1 D-葡萄糖組。

2.2 高糖對HLE-B3細胞miR-29b、SP-1 mRNA表達的影響25.5 mmol·L-1D-葡萄糖組 、35.5 mmol·L-1D-葡萄糖組處理HLE-B3細胞24 h，細胞中miR-29b相對表達量較正常組、10.5 mmol·L-1D-葡萄糖組、15.5 mmol·L-1D-葡萄糖組均顯著降低，且35.5 mmol·L-1D-葡萄糖組HLE-B3細胞miR-29b相對表達量低于25.5 mmol·L-1D-葡萄糖組(均為P<0.05)；同時35.5 mmol·L-1D-葡萄糖組處理HLE-B3細胞24 h，細胞中SP-1 mRNA和蛋白相對表達量較正常組，10.5 mmol·L-1、15.5 mmol·L-1D-葡萄糖組均顯著升高(均為P<0.05)(圖2)。故選擇35.5 mmol·L-1D-葡萄糖作為實驗用最佳高糖濃度。此外，用35.5 mmol·L-1D-葡萄糖處理HLE-B3細胞24 h、48 h時，細胞中miR-29b相對表達量較0 h、6 h、12 h時均顯著降低，同時SP-1 mRNA和蛋白相對表達量均升高(均為P<0.05)；但是處理24 h和48 h時，HLE-B3細胞miR-29b、SP-1 mRNA和蛋白相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05，圖3)。

圖2 不同濃度D-葡萄糖對HLE-B3細胞miR-29b、SP-1 mRNA和蛋白表達的影響 與正常組相比，*P<0.05；與10.5 mmol·L-1D-葡萄糖組相比，#P<0.05；與15.5 mmol·L-1D-葡萄糖組相比，&P<0.05；與25.5 mmol·L-1D-葡萄糖組相比，ΔP<0.05。

圖3 35.5 mmol·L-1 D-葡萄糖處理不同時間對HLE-B3細胞miR-29b、SP-1 mRNA和蛋白表達的影響 與處理0 h相比，*P<0.05；與處理6 h 相比，#P<0.05；與處理12 h相比，&P<0.05。

2.3 轉染效果驗證正常組HLE-B3細胞miR-29b、SP-1 mRNA和蛋白相對表達量(1.002±0.023、1.010±0.038、0.257±0.091)和陰性組(0.998±0.030、1.004±0.033、0.251±0.049)比較差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。miR-29b mimics組HLE-B3細胞miR-29b相對表達量(2.162±0.103)較正常組和陰性組均升高(均為P<0.05)，同時miR-29b mimics組HLE-B3細胞SP-1 mRNA(0.756±0.048)和蛋白(0.159±0.021)相對表達量較正常組和陰性組均降低(均為P<0.05)。miR-29b mimics+SP-1組HLE-B3細胞miR-29b相對表達量(2.089±0.095)與miR-29b mimics組基本一致(P>0.05);SP-1 mRNA和蛋白相對表達量(2.895±0.177、0.890±0.118)較正常組、陰性組和miR-29b mimics組均升高(均為P<0.05)，以上結果表明轉染成功。

2.4 上調miR-29b表達對高糖誘導的HLE-B3細胞遷移活性的影響高糖組HLE-B3細胞Transwell小室遷移數(shù)量和劃痕愈合率[(786±95)個、(81.73±5.39)%]較正常組[(431±61)個、(54.85±7.08)%]均增加(均為P<0.05)。陰性組HLE-B3細胞Transwell小室遷移數(shù)量和劃痕愈合率[(760±116)個、(80.53±6.75)%]與高糖組相比差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。miR-29b mimics組HLE-B3細胞Transwell小室遷移數(shù)量和劃痕愈合率[(479±86)個、(61.49±8.62)%]較高糖組和陰性組均明顯減少(均為P<0.05)。此外miR-29b mimics+SP-1組HLE-B3細胞Transwell小室遷移數(shù)量和劃痕愈合率[(651±102)個、(76.54±7.75)%]均高于miR-29b mimics組(均為P<0.05)。

2.5 上調miR-29b表達對HLE-B3細胞EMT相關蛋白表達的影響免疫熒光染色和Western blot檢測結果顯示，與正常組相比，高糖組細胞中E-Cadherin蛋白表達降低，同時N-Cadherin和Vimentin蛋白表達增強。而與高糖組和陰性組相比，miR-29b mimics組細胞中E-Cadherin蛋白表達增強，同時N-Cadherin 和Vimentin蛋白表達減弱。轉染SP-1后，miR-29b mimics+SP-1組細胞中E-Cadherin蛋白表達較miR-29b mimics組降低，同時N-Cadherin和Vimentin蛋白表達較miR-29b mimics組均升高(均為P<0.05)(圖4、圖5)。

圖4 免疫熒光染色檢測各組HLE-B3細胞EMT相關蛋白的表達情況(×800)

圖5 Western blot檢測各組HLE-B3細胞EMT相關蛋白的表達情況 A：正常組；B：高糖組；C：陰性組；D：miR-29b mimics組；E：miR-29b mimics+SP-1組。

2.6 生物信息學分析及雙熒光素酶報告基因驗證經(jīng)TargetScan、 miRanda及miRDB數(shù)據(jù)庫預測miR-29b的靶基因包含SP-1。經(jīng)雙熒光素酶報告基因分析結果顯示，與轉染miR-NC質粒的對照組相比，轉染miR-29b mimics質?？山档蚐P-1-3’UTR-WT熒光素酶活性約57.5%(1.00±0.09vs0.48±0.05,P<0.05)，但不降低SP-1-3’UTR-MUT熒光素酶活性(1.01±0.09vs0.98±0.07,P>0.05)。

3 討論

糖尿病性白內障是糖尿病常見的眼部慢性并發(fā)癥，其發(fā)病率正在逐年上升[7]。越來越多的miRNAs在白內障發(fā)展過程中的異常表達已經(jīng)確定，而相關機制研究也引起了科研人員更多的關注[8]。本研究證實miR-29b在高糖處理的HLE-B3細胞中表達量降低。上調miR-29b可通過調節(jié)SP-1依賴性信號通路抑制高糖條件下HLE-B3細胞EMT進程，進而對晶狀體上皮細胞產(chǎn)生一定的保護作用。

晶狀體上皮細胞在晶狀體的整個生命周期中負責晶狀體纖維的分化[9]。正常的分化和形態(tài)可以維持晶狀體的正常透明度，而晶狀體上皮細胞的發(fā)育、增殖、分化和凋亡的病理改變可能導致白內障。EMT是一種廣泛存在于真核生物體內自然發(fā)生的細胞生物學程序，可將上皮細胞轉化為更多間充質細胞狀態(tài)的細胞[10-11]，并在各種病理過程中起著重要作用，包括傷口愈合、組織纖維化和癌癥進展[4,12-13]。在這個過程中，晶狀體上皮細胞失去了正常的形態(tài)特征和轉錄程序，但是獲得了間充質細胞的表型特征，包括更強的遷移能力、抗凋亡能力和侵襲性，增加了細胞外間質成分的產(chǎn)生等。然而，EMT調節(jié)糖尿病性白內障的分子機制仍有待于進一步探討。其中miRNAs是機制研究的熱點[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖條件下可誘導HLE-B3細胞中miR-29b表達降低，同時細胞形態(tài)向間充質特征轉化。在EMT過程中，HLE-B3細胞失去了一些上皮特有的特征，包括E-Cadherin表達減少，典型的間充質細胞特性增強，如Vimentin和N-Cadherin表達增加。這說明高糖促進晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT，而EMT是參與糖尿病性白內障形成的關鍵環(huán)節(jié)。

研究表明，上皮細胞向間充質細胞轉化受到miRNAs的調控[9,12]，因此，miRNAs被認為是參與眼睛發(fā)育和疾病發(fā)生的重要功能性分子。Liu等[15]證實miR-199a在糖尿病性白內障囊膜組織和高糖條件下的晶狀體上皮細胞中表達下調，而且miR-199a被證實可以直接靶向調控SP-1蛋白表達，進而抑制糖尿病性白內障患者晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT。Ye等[16]也發(fā)現(xiàn)高糖可抑制miR-144-3p表達，進而通過ROS/NRF2/Notch1/Snail途徑影響晶狀體上皮細胞EMT進程。本研究通過轉染miR-29b mimics質粒上調HLE-B3細胞中miR-29b表達，進而抑制SP-1 mRNA轉錄和翻譯， 從而阻止高糖誘導的HLE-B3細胞EMT進程。生物信息學工具預測，SP-1 mRNA是高度守恒的，是miR-29b的重要目標。SP-1是SP/Kruppel-like因子超家族成員，是許多管家基因轉錄所需的。其過度表達與細胞的異常分化有關，而SP-1的下調會加重內質網(wǎng)應激和未折疊蛋白反應[17]。SP-1亦可以通過相關基因來調節(jié)腫瘤細胞的增殖、EMT和侵襲過程[18]。本研究中，EMT被證實與高糖誘導作用有關，在經(jīng)高糖處理的HLE-B3細胞中發(fā)現(xiàn)E-Cadherin蛋白表達降低，同時N-Cadherin和 Vimentin 蛋白表達增強。雙熒光素酶報告基因分析證實SP-1直接受到miR-29b的調控。上調SP-1表達可逆轉miR-29b對HLE-B3細胞EMT進程的抑制作用。這些結果都表明，上調miR-29b可能通過調節(jié)SP-1表達影響HLE-B3細胞EMT進程，進而延緩或阻止糖尿病性白內障的發(fā)生發(fā)展。說明miR-29b-SP-1-EMT網(wǎng)絡在糖尿病性白內障的發(fā)展中起到一定作用，這為糖尿病性白內障發(fā)病機制的研究提供了新思路。

綜上所述，本研究證實了miR-29b在糖尿病性白內障體外細胞模型中表達下調。上調miR-29b表達可通過靶向SP-1基因參與抑制高糖誘導晶狀體上皮細胞EMT的進程。這些結果為研究糖尿病性白內障發(fā)生發(fā)展的分子機制提供了新的視角，同時，miR-29b、SP-1可能成為糖尿病性白內障治療的新靶點。