楊 潔 朱曉敏 胡子毅 張會民 馮子龍

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是眼科常見且可致盲的眼病之一，其患者眼底表現(xiàn)多樣，以增生型DR(PDR)為致盲的首要原因。PDR的病變特征多與視網(wǎng)膜或視盤上新生血管形成有關。近年，抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)藥物已廣泛應用于糖尿病性黃斑水腫(DME)患者的治療[1-4]，不僅被證實對DR引起的黃斑水腫有效，且可以促進視網(wǎng)膜和視盤上的新生血管消退、減少血管滲漏，進而延緩PDR進展[5-6]。而尋找有效的生物標志物來監(jiān)測抗VEGF藥物的臨床療效則具有重要的參考價值。目前已報道超敏C反應蛋白(hsCRP)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)等全身性炎癥因子可能在抗VEGF藥物治療非應答者中起重要作用[7]。除了血管生成和炎癥外，視網(wǎng)膜纖維化也被證實是PDR發(fā)病機制中的一個有害因素。而轉(zhuǎn)化生長因-β(TGF-β)作為多功能細胞因子，不僅參與了視網(wǎng)膜纖維化過程，還可促進新生血管形成[8]。有研究證實，檢測血清TGF-β1水平可作為監(jiān)測玻璃體內(nèi)阿柏西普治療非PDR(NPDR)和PDR患者臨床療效的有效生物學指標[9]，但TGF-β在監(jiān)測其他抗VEGF藥物治療效果中的作用未見報道。雷珠單抗是我國最常使用的治療黃斑相關性疾病的一線抗VEGF單克隆抗體藥物，主要與VEGF-A結合，阻斷其與VEGF受體(VEGFR)-1和VEGFR-2的相互作用，從而減少內(nèi)皮細胞增殖、血管滲漏和新生血管的形成[10]。本研究將通過測定DR患者血清TGF-β水平來評估其在監(jiān)測雷珠單抗治療效果中的作用，為指導臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究共納入2020 年1月至2020年12 月本院收治的PDR患者40例(PDR組)、NPDR患者40例(NPDR組)、無DR癥狀的糖尿病患者40例(糖尿病組)，所有患者在登記前均閱讀并簽署書面知情同意書。納入標準：(1)年齡≥18歲；(2)明確診斷為1型或2型糖尿病患者；(3)經(jīng)眼底檢查、光學相干斷層掃描(OCT)、眼底熒光素血管造影(FFA)檢查符合視網(wǎng)膜病變的診斷[11]，并進一步明確臨床分期；黃斑中心凹厚度(FMT)>250 μm者。排除標準：與糖尿病無關的黃斑水腫、角膜病變、青光眼、葡萄膜炎、白內(nèi)障、近期眼部手術(6個月內(nèi))者；受試者在先前診斷為其他增生型血管疾病、炎癥性疾病或玻璃體積血情況等；既往接受過視網(wǎng)膜激光光凝或玻璃體內(nèi)注藥治療，包括抗VEGF藥物和激素類者；治療藥物過敏者；無法完成隨訪者。所有研究對象均通過雙眼眼底鏡檢查、FFA評估PDR和NPDR的診斷。另外納入同時期年齡、性別相匹配的40位健康對照者作為對照組，在納入本研究時，所有研究對象均經(jīng)過全面的眼科學評估和知情同意簽字，并進行了空腹靜脈血采樣。本研究嚴格遵守《赫爾辛基宣言》規(guī)定，而且研究方案得到了我院倫理審查機構的批準。

1.2 治療方法所有NDR和PNDR患者均在我院接受玻璃體內(nèi)抗VEGF藥物治療。在手術環(huán)境下，玻璃體內(nèi)注射雷珠單抗前30 min采用復方托吡卡胺滴眼液常規(guī)散瞳，使用50 g·L-1聚維酮碘溶液消毒結膜、結膜表面麻醉后，顳上角膜后側(cè)4.0 mm垂直眼球壁部位進針，深度約1 cm，到達玻璃體后注射雷珠單抗注射液(諾適得)0.05 mL。所有玻璃體內(nèi)注射均在無菌條件下進行。術后應用鹽酸左氧氟沙星滴眼液滴眼預防感染。

1.3 觀察指標及測量方法眼科臨床評價包括雙眼檢眼鏡檢查(Optomap 200Tx超廣角掃描激光檢眼鏡，英國OPTOS公司)、FFA檢查(TOPCON-50DX眼底照相機，日本TOPCON公司)和頻域OCT(SD-OCT)(Spectralis OCT激光眼科診斷儀，德國Heidelberg公司)檢查。所有參與者均接受空腹靜脈采血。NDR和PNDR患者在玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物治療前和治療后需進行2次血液樣本采集。離心獲取血清樣本，并儲存于-80 ℃環(huán)境中。血清樣本用于VEGF-A和TGF-β定量分析?；颊唠S訪1個月，觀察治療前、治療后1個月FMT變化。應用ELISA試劑盒(上海通蔚生物公司)測定血清VEGF-A、TGF-β水平，以水平軸為標準品濃度，垂直軸為吸光度，采用相關軟件繪制標準曲線，計算待測指標水平，試驗前所有試劑混合均勻。

2 結果

2.1 四組受試者一般資料對比四組受試者性別構成比和年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。糖尿病組、PDR組、NPDR組患者糖化血紅蛋白(HbAlc)均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，糖尿病組、PDR組、NPDR組患者HbAlc、糖尿病病程和胰島素使用史比例比較差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 四組受試者一般資料對比

2.2 四組受試者治療前血清VEGF-A、TGF-β水平和FMT比較糖尿病組、NPDR組、PDR組患者血清VEGF-A、TGF-β水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。NPDR組和PDR組患者血清TGF-β水平和FMT較對照組和糖尿病組均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，且PDR組升高更明顯，PDR組與NPDR組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 四組受試者治療前血清VEGF-A、TGF-β水平和FMT比較

2.3 ROC曲線分析血清TGF-β水平用于患者分層的臨床價值經(jīng)ROC曲線分析，血清TGF-β水平可以診斷糖尿病患者(AUC=0.860，P<0.001)、糖尿病人群中的DR患者(AUC=0.756，P<0.001)以及鑒別診斷NPDR和PDR患者(AUC=0.734，P<0.001)，血清TGF-β的最佳閾值分別為461.62 ng·L-1、990.16 ng·L-1、1114.21 ng·L-1(圖1)。

圖1 ROC曲線分析血清TGF-β水平用于患者分層的臨床價值 A:糖尿病患者vs.對照人群；B:DR患者vs.非DR的糖尿病患者；C：PDR患者vs. NPDR患者。

2.4 多元線性回歸分析血清TGF-β水平與其他臨床因素之間的關系經(jīng)多元線性回歸分析，校正年齡、性別、胰島素使用史和是否為PDR等混雜因素后，血清TGF-β水平與HbAlc、糖尿病病程均有關[95%CITGF-β=1.543(1.118～1.849)，95%CIHbAlc=2.699(1.751～4.002)，均為P<0.001]。相關性分析結果顯示，血清TGF-β水平與HbAlc、糖尿病病程均呈正相關性(r=0.703、0.656，均為P<0.001)(圖2)。

圖2 治療前各指標基線值相關性分析散點圖 A：血清TGF-β水平與HbAlc關系散點圖；B：血清TGF-β水平與糖尿病病程關系散點圖。

2.5 NPDR組和PDR組患者治療前后FMT、血清TGF-β、VEGF-A水平變化重復測量的方差分析結果顯示，隨訪1個月后，兩組患者血清VEGF-A水平較基線值降低(P<0.001)，且兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；這兩組患者治療前后血清VEGF-A水平變化趨勢比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組患者治療前后血清TGF-β水平和FMT值變化趨勢均存在組別和時間交互效應(均為P<0.001)；治療后NPDR組患者血清TGF-β水平和FMT值均顯著低于治療前基線值(均為P<0.001)，而PDR組患者治療前后血清TGF-β水平和FMT值差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.326、0.129)(表3)。

表3 NPDR組和PDR組患者血清VEGF-A、TGF-β水平和FMT變化

2.6 抗VEGF藥物治療后1個月血清VEGF-A、TGF-β水平與FMT的關系Spearman秩相關分析結果顯示，治療后1個月，DR患者(包括NPDR組和PDR組患者)血清TGF-β水平與FMT呈正相關性(r=0.808，P<0.001)，血清VEGF-A水平與FMT無相關性(r=0.013，P=0.907)(圖3)。

圖3 治療后1個月DR患者血清VEGF-A、TGF-β水平與FMT的相關性分析散點圖 A：血清TGF-β水平與FMT關系散點圖；B：血清VEGF-A水平與FMT關系散點圖。

3 討論

DR屬于糖尿病視網(wǎng)膜微血管并發(fā)癥之一，通常由于視網(wǎng)膜損害，導致新生血管生成及纖維增生，最終引起視網(wǎng)膜脫落而致盲[12]。DR的發(fā)病機制復雜，血管生成和炎癥是DR發(fā)病機制中最主要的驅(qū)動因素[11]。研究證實，VEGF參與眼部新生血管形成，是影響DR發(fā)生及發(fā)展的主要因素；眼部微循環(huán)障礙會加速VEGF釋放到玻璃體內(nèi)，過高的VEGF會對視網(wǎng)膜新生血管生成形成刺激，增加新生血管形成及黃斑水腫風險。雷珠單抗為抗VEGF代表藥物之一，可阻斷玻璃體內(nèi)VEGF主要活性亞型VEGF-A，并抑制新生血管生成。同時，雷珠單抗能逆轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜與虹膜的新生血管，促使血管內(nèi)皮細胞凋亡及新生血管閉塞，通過阻斷VEGF、維持血-視網(wǎng)膜屏障穩(wěn)定性，進而達到減少視網(wǎng)膜血管滲漏、緩解視網(wǎng)膜水腫的目的[13]。因此，應用抗VEGF藥物治療能從機制上有效改善黃斑水腫，達到DR治療的效果。

目前，對于DR療效的評價有影像學指標和生物學標志物，其中影像學指標主要是超廣角FFA[14-15]、OCT[16]和SD-OCT[17-18]，但由于其成本較高并未得到普及。而生物標志物主要為房水、玻璃體中的細胞因子或生長因子。不過由于玻璃體樣本量小，風險較大，因而目前多數(shù)研究集中于房水樣本。眾所周知，VEGF-A是病理性血管生成的主要促進因子，可激活VEGFR-1和VEGFR-2，而VEGF-B則選擇性地結合VEGFR-1。VEGF-A蛋白以內(nèi)皮細胞為靶點，具有多種作用，包括細胞生長和遷移、血管生成和通透性增加。有研究指出，降低VEGF-A水平可以防止VEGF-A 誘導血管滲漏和促進新血管生成，減少DR患者FMT，提高手術的安全性[19]。而VEGF-B在眼科的作用仍然存在爭議，目前關于VEGF-B的作用研究多集中于心腦血管疾病、惡性腫瘤等方面。因此，VEGF-A被認為是DR中至關重要的生物標志物，與DR的嚴重程度相關[20]。除了血管生成和炎癥外，視網(wǎng)膜纖維化已成為DR進展機制中的一個主要有害因素。TGF-β信號通路與纖維化和細胞外間質(zhì)重塑密切相關，一些報道強調(diào)，TGF-β不僅可促進視網(wǎng)膜纖維化，還可以促進血管生成，例如TGF-β亞型(1、2、3)均能夠誘導VEGF的表達[8]。

從易操作性、樣本易得性等方面考量，循環(huán)標志物具有天然優(yōu)勢。前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，HbAlc≥7%與HbAlc<7%患者間最佳矯正視力提高或FMT降低比較，差異均無統(tǒng)計學意義[21]。進一步擴大研究發(fā)現(xiàn)，抗VEGF藥物治療后視力改善與患者血糖控制、用藥史、血壓、體重指數(shù)或腎功能等均無關[22]。因此，尋找新的標志物對于指導臨床用藥具有重要意義。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)無論是PDR患者還是NPDR患者，經(jīng)抗VEGF藥物治療后1個月，血清VEGF-A水平均普遍降低，且兩組間無明顯差異，血清VEGF-A水平變化與FMT值也無顯著相關性，說明監(jiān)測血清VEGF-A水平并不能完全反應抗VEGF藥物的治療效果。有趣的是，Cutsem等[23]臨床試驗也證實，注射抗VEGF藥物后，其治療反應并不受血清VEGF-A或胎盤生長因子水平的影響。此外，在治療前，糖尿病組、NPDR組和PDR組患者血清VEGF-A水平普遍高于對照組，而這3組患者間差異并無明顯統(tǒng)計學意義，說明血清VEGF-A水平既不能預測DR分期，也不能預測臨床結果。

但是值得注意的是，在本研究中，經(jīng)雷珠單抗注射后1個月時，NPDR組患者血清TGF-β水平逐漸降低，而PDR組患者血清TGF-β水平變化卻較基線值不明顯，這一結果可能與PDR患者不受控制的視網(wǎng)膜新血管生成有關，雖然VEGF信號被抗VEGF藥物所抑制，但是視網(wǎng)膜纖維化仍然存在。另一方面，根據(jù)我們對受試者的分層分析，血清TGF-β可以被認為是一個具有敏感性和特異性的DR進展生物標志物。而本研究證實血清TGF-β水平對于預測糖尿病患者、糖尿病人群中的DR患者以及鑒別診斷NPDR和PDR患者都能夠提供一定的可參考信息。此外，經(jīng)雷珠單抗注射1個月后，NPDR患者FMT降低程度顯著，且黃斑水腫基本消失，而PDR組患者FMT值降低不明顯，血清TGF-β水平也沒有顯著變化，說明抗VEGF藥物對NPDR患者療效更突出。且此時DR患者血清TGF-β水平與FMT呈正相關性，說明在臨床病例管理中，不僅可以監(jiān)測患者黃斑水腫和視網(wǎng)膜基底部，還可以監(jiān)測臨床實驗室參數(shù)，如血清TGF-β水平。TGF-β參與DR發(fā)生有以下幾種機制[8,24-25]：(1)TGF-β促進內(nèi)皮細胞的增生、黏附及細胞外基質(zhì)增生；(2)激活絲裂原活化蛋白激酶，誘導視網(wǎng)膜色素上皮細胞表達VEGF，促進視網(wǎng)膜新生血管形成；(3)促進纖維連接蛋白的合成，導致血管纖維化。在糖尿病內(nèi)皮細胞外基質(zhì)生成和血管重塑中TGF-β亦發(fā)揮重要作用。近期研究結果表明，TGF-β可通過刺激活化素受體樣激酶5合成維持早期DR視網(wǎng)膜血管完整性，延緩視網(wǎng)膜病變進展[8]。因此，不難推測，由于抗VEGF藥物的抗新生血管形成的作用，對抗了TGF-β促進視網(wǎng)膜新生血管形成、內(nèi)皮細胞增生等的作用，在抗VEGF藥物治療過程中表現(xiàn)為隨著療效的提升及癥狀的改善，血清TGF-β水平呈逐漸下降趨勢。

總之，血清TGF-β水平可以被認為是預測從 NPDR到PDR疾病進展的一個生物標志物，它亦可能是抗VEGF藥物臨床療效的次要終點。但是本研究樣本數(shù)量有限，日后需要更大規(guī)模的追蹤研究以加強數(shù)據(jù)支持和關于TGF-β在DR中的預后價值的結論。