楊學(xué)文 張莉 高峰 嚴(yán)士海

慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）是由乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）慢性感染導(dǎo)致的常見消化系統(tǒng)疾病，HBV 在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致進(jìn)步進(jìn)展，調(diào)查表明全球CHB 患者超過2 億人，是肝硬化和肝細(xì)胞癌的重要誘因之一［1］。機(jī)體被HBV感染后產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，同時(shí)增加機(jī)體被EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染的風(fēng)險(xiǎn)［2］。EBV 是一種皰疹病毒，以侵犯人體皮膚及淋巴組織為主，研究發(fā)現(xiàn)EBV 還能夠加重肝臟損傷，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和形成［3］。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLRs）在機(jī)體固有免疫中發(fā)揮重要作用，其中TLR4、TLR9 等分子以多種方式調(diào)控調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Regulatory T cells，Treg）的功能，維持機(jī)體免疫耐受，阻止排異反應(yīng)的發(fā)生［4］，與感染、自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)生相關(guān)［5］，研究發(fā)現(xiàn)Treg 細(xì)胞中TLRs 表達(dá)水平明更高。當(dāng)前的研究對(duì)TLR4、TLR9 在CHB 合并EBV感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及作用尚不完全明確，本研究TLR4、TLR9 對(duì)CHB 合并EBV 感染患者肝功能相關(guān)指標(biāo)及患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年3月至2020年3月江蘇省中醫(yī)院收治的54 例CHB 合并EBV 感染患者作為研究對(duì)象，CHB 診斷依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［6］、EBV 感染診斷依據(jù)《EB 病毒感染實(shí)驗(yàn)室診斷及臨床應(yīng)用專家共識(shí)》［7］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)檢查確診為CHB 合并EBV 感染，且持續(xù)時(shí)間≥6 個(gè)月；②初診患者，未接受抗病毒及免疫抑制劑治療；③患者狀況良好，依從性好，未合并惡性腫瘤、自身免疫疾病及精神神經(jīng)疾?。虎芑颊吲R床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)診斷為甲型肝炎、丙型肝炎等其他疾??；②患者合并惡性腫瘤、重要臟器功能損傷；③患者入院前6 個(gè)月接受過免疫抑制劑治療。另選取本院同期收治的25 例CHB 未合并EBV 感染患者作為對(duì)照組1，25 例僅感染EVB 患者作為對(duì)照組2。其中，研究組中男性37 例、女性17 例，平均年齡（48.29±10.12）歲；對(duì)照組1 男性16 例、女性9 例，平均年齡（49.25±8.13）歲；對(duì)照組2 男性17 例、女性8 例，平均年齡（50.34±9.24）歲。三組患者一般資料均衡可比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究所有患者及家屬均簽署對(duì)研究知情同意書，研究經(jīng)院倫理委員會(huì)審核并通過。

1.2 方法

1.2.1 HBV 與EBV 感染的檢測(cè)方法

患者入院后進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）、乙肝病毒表面抗體（Hepatitis B virus surface antibody，HBsAb）、乙肝病毒E 抗原（HBeAg）、乙肝病毒E 抗體（Hepatitis B virus E antigen，HBe-Ab）、乙肝病毒核心抗體（HBV core antibody，HBcAb）。HBsAg 陽性患者即可診斷為HBV 患者。通過血常規(guī)檢查確認(rèn)患者感染EB 病毒的情況。當(dāng)異型淋巴細(xì)胞超過10%、嗜異凝集試驗(yàn)為陽性、抗EB 病毒載體VCA-IgM 為陽性時(shí)，即可確診為EB 病毒感染。

1.2.2 肝功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

采用AU5800 全自動(dòng)生化分析儀系統(tǒng)（美國(guó)BECKMAN COULTER 公司）檢測(cè)患者血肝功能相關(guān)指標(biāo)水平，包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（Total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（Direct bilirubin，DBIL）、間接膽紅素（Indirect bilirubin，IBIL）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4、TLR9 表達(dá)情況

患者入組后次日清晨空腹采集靜脈血5 mL于肝素抗凝管中，進(jìn)行計(jì)數(shù)后加入紅細(xì)胞裂解液（R1010 紅細(xì)胞裂解液，北京Solarbio 科技有限公司）避光靜置，1 200 g 離心10 min 收集沉淀，離心半徑10 cm，加入磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer salin，PBS，北京中杉金橋生物公司）洗滌兩次，加入TLR4-PE 抗體和TLR9-FITC 抗體（英國(guó)Abcam 公司），充分混勻，避光孵育30 min，PBS洗滌后采用Attune NxT 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞TLR4、TLR9 陽性表達(dá)情況。

1.2.4 患者預(yù)后情況

將研究組所有患者根據(jù)TLR4、TLR9 陽性表達(dá)率中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，采用電話、微信、門診等方式進(jìn)行隨訪，隨訪間隔三個(gè)月，截至2021年6月，隨訪時(shí)間共15 個(gè)月，將CHB 發(fā)展為肝硬化及肝細(xì)胞癌定義為疾病進(jìn)展，研究CHB合并EBV 感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4、TLR9 表達(dá)情況與疾病進(jìn)展的關(guān)系。將54 例研究組患者按照TLR4、TLR9 陽性表達(dá)率中位數(shù)（47.25%）、（44.82%）分別分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，TLR4 高表達(dá)患者發(fā)生疾病進(jìn)展16 例，低表達(dá)患者發(fā)生疾病進(jìn)展7 例。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman 分析數(shù)據(jù)間相關(guān)性；Kaplan-Meier 生存曲線對(duì)比兩組患者生存情況；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4、TLR9 表達(dá)情況

研究組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4、TLR9陽性表達(dá)情況明顯高于兩組對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4、TLR9表達(dá)情況（±s）Table 1 TLR4 and TLR9 in peripheral blood mononuclear cells of the three groups of patients（±s）

表1 3組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4、TLR9表達(dá)情況（±s）Table 1 TLR4 and TLR9 in peripheral blood mononuclear cells of the three groups of patients（±s）

注：與對(duì)照組1 比較，aP＜0.05；與對(duì)照組2 比較，bP＜0.05。

組別研究組對(duì)照組1對(duì)照組2 F 值P 值n 54 25 25 TLR4（%）58.29±8.77ab 50.34±7.53 23.13±3.47 12.325＜0.001 TLR9（%）52.94±5.49ab 44.16±5.13 18.27±2.05 18.723＜0.001

2.2 3 組患者肝功能指標(biāo)比較

研究組患者血ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL、ALP 水平均明顯高于兩組對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3 組患者肝功能相關(guān)指標(biāo)比較（±s）Table 2 Comparison of related indexes of liver function among three groups（±s）

表2 3 組患者肝功能相關(guān)指標(biāo)比較（±s）Table 2 Comparison of related indexes of liver function among three groups（±s）

注：與對(duì)照組1 比較，aP＜0.05）；與對(duì)照組2 比較，bP＜0.05。

組別研究組對(duì)照組1對(duì)照組2 F 值P 值n 54 25 25 ALT（U/L）196.47±40.26ab 117.32±29.74 65.78±14.32 14.077＜0.001 AST（U/L）198.26±41.33ab 108.69±34.16 59.29±12.73 19.728＜0.001 TBIL（μmol/L）60.39±15.88ab 32.52±10.87 18.24±4.12 14.775＜0.001 DBIL（μmol/L）40.53±9.17ab 24.28±7.02 25.34±6.75 16.539＜0.001 IBIL（μmol/L）25.16±5.22ab 13.64±4.03 7.26±1.45 12.199＜0.001 ALP（U/L）106.53±20.46ab 73.54±16.78 69.81±15.62 12.594＜0.001

2.3 單個(gè)核細(xì)胞TLR4、TLR9 水平與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 陽性表達(dá)與血TBIL、IBIL 水平無相關(guān)性（P＞0.05），但和血ALT、AST、DBIL 及ALP 水平呈正相關(guān)（P＜0.05）；單個(gè)核細(xì)胞TLR9 陽性表達(dá)與血TBIL、DBIL 水平無相關(guān)性（P＞0.05），但和血ALT、AST、IBIL 及ALP 水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

表3 單個(gè)核細(xì)胞TLR4、TLR9 水平與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性Table 3 Correlation between TLR4 and TLR9 levels of mononuclear cells and liver function indicators

2.4 TLR4、TLR9 表達(dá)與患者疾病進(jìn)展的關(guān)系

TLR4、TLR9 高表達(dá)患者疾病進(jìn)展率高于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.135、5.684，P＜0.05）。見表4。

表4 TLR4、TLR9 表達(dá)與患者疾病進(jìn)展之間的關(guān)系Table 4 Correlation between TLR4 and TLR9 levels and the development of disease

2.5 TLR4、TLR9 表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

采用Kaplan-Meier 生存曲線分析患者15 個(gè)月內(nèi)進(jìn)展情況，54 例患者存活40 例，死亡13 例，失訪1例，TLR4、TLR9 高表達(dá)患者15 個(gè)月生存率較低表達(dá)患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 TLR4、TLR9 水平與患者預(yù)后的關(guān)系Figure 1 The relationship between TLR4，TLR9 levels and patient prognosis

3 討論

EBV 是常見的皰疹病毒之一，在人群中的傳播感染率超過90%，主要存在與唾液腺組織中可長(zhǎng)達(dá)數(shù)年之久，目前臨床尚無治療EBV 感染的有效方法［8］。EBV 不僅能夠感染人體內(nèi)上皮細(xì)胞，同時(shí)對(duì)T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞具有感染能力，可導(dǎo)致宿主免疫功能異常的發(fā)生，抑制細(xì)胞凋亡的同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，是重要的促癌因素之一［9］。相關(guān)研究表明EBV 對(duì)肝細(xì)胞并無直接損傷作用，其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是導(dǎo)致肝損傷的重要因素之一，合并EBV 感染的CHB 患者外周血T 細(xì)胞亞群分布情況改變［10］，但其機(jī)制尚不完全明確。ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL、ALP 是實(shí)驗(yàn)室檢查中反應(yīng)肝功能的重要指標(biāo)，其中ALT、AST 水平上升反映肝細(xì)胞損傷，而TBIL、DBIL、IBIL 水平上升反映肝臟膽紅素代謝障礙，本研究中結(jié)果顯示合并EBV 感染的CHB 患者血ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL、ALP 水平均明顯高于未合并EBV 感染的CHB 患者，提示EBV 能夠?qū)е赂喂δ軗p傷加重。

TLRs 是一種I 型跨膜蛋白，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞表面，是連接天然免疫和獲得性免疫的重要分子，通過調(diào)節(jié)Treg 細(xì)胞活動(dòng)發(fā)揮其作用［11］。其中TLR4 能夠通過直接調(diào)控Treg 細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖調(diào)節(jié)其免疫抑制功能［12］，而TLR9 的作用尚不完全明確，有研究指出其通過抑制Treg 細(xì)胞活性促進(jìn)機(jī)體免疫的發(fā)生［13］。本研究發(fā)現(xiàn)合并EBV 感染的CHB 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4、TLR9 陽性表達(dá)率均升高，提示TLR4、TLR9 均促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，這與國(guó)內(nèi)學(xué)者張釗等人［14］的研究結(jié)果相符合。崔海霞等人［15］的研究發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體在免疫性肝炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)明顯上升，調(diào)控免疫性肝炎的發(fā)生并與患者預(yù)后相關(guān)，本研究結(jié)果提示TLR4、TLR9 可能通過促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)介導(dǎo)了肝細(xì)胞損傷，導(dǎo)致肝功能損傷和相關(guān)指標(biāo)水平的上升。

本研究還發(fā)現(xiàn)單個(gè)核細(xì)胞中TLR4、TLR9 表達(dá)情況與患者疾病進(jìn)展情況相關(guān)，TLR4、TLR9 高表達(dá)患者進(jìn)展成為肝硬化及肝細(xì)胞癌的人數(shù)多于低表達(dá)患者。炎癥反應(yīng)是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，TLRs 通路激活后能夠介導(dǎo)干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）水平升高，促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖增強(qiáng)機(jī)體炎癥反應(yīng)，其中TLR4 能夠進(jìn)一步促進(jìn)IFN-γ 的合成和釋放［16］，而TLR9 能夠增強(qiáng)膠原蛋白的合成，促進(jìn)肝臟纖維化過程的進(jìn)展［17］，二者還能夠作用于腫瘤微環(huán)境，使炎癥因子水平上調(diào)，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用的同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致肝硬化的形成和腫瘤的進(jìn)展［18］。最后本研究發(fā)現(xiàn)TLR4、TLR9 高表達(dá)患者15 個(gè)月生存率較低表達(dá)患者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，合并EBV 感染的CHB 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4、TLR9 水平陽性表達(dá)率較高，其與患者血ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL、ALP 等肝功能指標(biāo)水平相關(guān)，且能夠促進(jìn)CHB 患者病情進(jìn)展，可能為臨床CHB 的治療提供相關(guān)依據(jù)。本研究的不足之處在于樣本量較少，且隨訪時(shí)間過短，需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量并延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，以減少結(jié)果存在的偏倚。