王立林 鄔旭群 張耿 寧理 盧亮 劉晉洪 許曉絢 鄭欣 左佳蕙 楊崢嶸 趙方 曾勁峰★

在過(guò)去的幾十年里，梅毒的總發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)都有所上升［1］。由于發(fā)病的高危人群與人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）一致（尤其是男男性接觸者），梅毒HIV共感染病例較為常見。梅毒和HIV 共感染可相互影響單一病原體感染病毒學(xué)和免疫學(xué)反應(yīng)過(guò)程，此外臨床表現(xiàn)、臨床診斷和療效間的相互影響也存在爭(zhēng)議［2］。理論上講，一種病原體的感染可能會(huì)促進(jìn)另一種病原體的感染并加速病程惡化。例如，梅毒可能通過(guò)生殖器潰瘍來(lái)增加精液和陰道分泌物中的病毒載量，或通過(guò)降低CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)增加個(gè)體對(duì)HIV 的易感性，從而促進(jìn)HIV 的傳播［3-4］。眾所周知，梅毒可以成功治愈，早期發(fā)現(xiàn)HIV，也可達(dá)到臨床治愈。但是，急性HIV 感染（Acute HIV-1 Infection，AHI）后早期抗病毒治療（anti-retroviral therapy，ART）因?yàn)橐种铺禺愋钥?HIV 抗體生成，減少HIV 抗原，降低病毒DNA/RNA 核酸濃度，會(huì)顯著影響HIV 的檢測(cè)［5-6］。本研究通過(guò)系統(tǒng)追蹤，明確梅毒和HIV 共感染的窗口期患者經(jīng)過(guò)早期治療后，是否會(huì)影響早期免疫學(xué)、病毒學(xué)診斷結(jié)果及治療效果。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本信息

深圳市血液中心無(wú)償獻(xiàn)血者，男，42 歲，漢族，工人，已婚，2018年4月6日（分別為第一次和第二次高危性行后41 天和35 天）在深圳市血液中心第19 次捐獻(xiàn)全血。獻(xiàn)血者問(wèn)詢及體檢未發(fā)現(xiàn)異常及高危風(fēng)險(xiǎn)。本研究經(jīng)深圳市血液中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獻(xiàn)血者已簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）（Murex，雅培公司，美國(guó)）；丙型肝炎病毒抗體（Human anti hepatitis C virus antibody，anti-HCV）（ORTHO，強(qiáng)生公司，美國(guó)）；第四代Genscreen ULTRA-HIV Ag-Ab 試 劑（抗-HIV1，Genscreen ULTRA，伯樂(lè)公司，美國(guó)）；第三代抗-HIV 試劑（抗-HIV2，北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司）；抗-TP 試劑1（DiaSorin S.p.A UK 分公司，英國(guó)）；抗-TP 試劑2（珠海麗珠試劑股份有限公司）。Procleix Ultrio Elite 檢 測(cè) 試 劑，Procleix HIV-1、HCV、HBV Discriminatory Assay 鑒別試劑（Grifols，西班牙）；MPX v2.0 HBV、HCV、HIV（1+2 型）PCR-熒光法NAT 聯(lián)合檢測(cè)試劑（羅氏，美國(guó)）；Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 test，version 2.0（羅氏，美國(guó)）；人類免疫缺陷病毒（HIV 1+2 型）抗體檢測(cè)免疫印跡法試劑盒（Western blotting，WB）HIV BLOT 2.2（MP 生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司，新加坡）。補(bǔ)充膠體金免疫層析法（上?？迫A生物股份有限公司）和膠體硒法Alere DetermineTM HIV1/2（雅培Alere Medical Co.Ltd.，美國(guó)），甲苯胺紅未加熱血清試驗(yàn)（tolulized red unheated serum test，TRUST，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司），梅毒螺旋體抗體血清試驗(yàn)（Treponema pallidum particleagglutination test，TPPA，富士株式會(huì)社，日本）；HIV-1 病毒DNA 檢測(cè)試劑盒（天津精耐特基因生物技術(shù)有限公司）；HIV-1 病毒RNA 定量檢測(cè)試劑盒（Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1，羅氏，美國(guó)）。

諾華全自動(dòng)NAT 平臺(tái)（PROCLEIX Tigris System，美國(guó)諾華）；CAP/CTM 系統(tǒng)［美國(guó)羅氏診斷公司cobass 201 核酸檢測(cè)系統(tǒng)，由全自動(dòng)混樣儀（HAMILTON Microlab STAR IVD，瑞士HAMILTON），核酸提取儀（cobas AmpliPrep）與分析儀（cobas TaqMan），通過(guò)混樣和數(shù)據(jù)管理服務(wù)器連接組成］；AutoBlot System 20 全自動(dòng)免疫蛋白印跡儀（美國(guó)伯樂(lè)）；FACS Calibur 標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀測(cè)（BD Biosciences，San Jose，CA，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 樣本保存

采集全血于EDTA 2K 管中。血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞在采集后6 h 內(nèi)分離，-80℃分裝凍存。

1.3.2 判定規(guī)則

操作方法和結(jié)果的判定均按照試劑說(shuō)明書執(zhí)行。標(biāo)本均經(jīng)3 遍酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），若2 遍及以上反應(yīng)性最終結(jié)果判定為陽(yáng)性，否則判為陰性。

1.3.3 核酸篩查

1.3.3 .1 NAT 單樣本檢測(cè) 樣本定性檢測(cè)獻(xiàn)血者血漿中的HIV-1 RNA、HCV RNA 和HBV DNA；對(duì)初檢單樣本反應(yīng)性的樣本，再做NAT 鑒別檢測(cè)。

1.3.3 .2 NAT 混樣檢測(cè) 模擬6 人份混樣：取1份待測(cè)樣本血漿5 份酶免核酸陰性血漿均勻混合；模擬12 人份混樣：取1 份待測(cè)樣本血漿11 份酶免核酸陰性血漿均勻混合，取混合樣本血漿1 mL/份，進(jìn)行MPX v2.0 PCR-熒光法NAT 聯(lián)合檢測(cè)。

1.3.4 HIV 病毒載量測(cè)定

具體操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書，最低檢測(cè)限為20 copies/mL。

1.3.5 蛋白免疫?。╳estern blottin，WB）跡確證實(shí)驗(yàn)

HIV BLOT 2.2 試劑說(shuō)明書中結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陰性——沒(méi)有病毒特異帶，或者只有p17 帶；HIV-1陽(yáng)性——檢出2 條ENV 帶（gpl60/gp41 和gpl20）及核心蛋白（GAG，包括p17、p24、p55）或酶蛋白（POL，包括p31、p51、p66）；不確定——出現(xiàn)任何特異條帶，但不足以被判斷為陽(yáng)性。

1.3.6 HIV-DNA 定量分析

HIV-1 病毒DNA 檢測(cè)整合到人類白細(xì)胞基因組中HIV-1 病毒DNA［7］。

1.3.7 CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)

應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀測(cè)定全血樣本中CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.8 追蹤隨訪

在兩年時(shí)間對(duì)窗口期獻(xiàn)血者追蹤隨訪11 次，采集其血樣補(bǔ)充進(jìn)口、國(guó)產(chǎn)HIV、梅毒抗體ELISA檢測(cè)，HIV RNA 單人份、多人份混樣核酸檢測(cè)，HIV病毒載量檢測(cè)，蛋白免疫印跡確證實(shí)驗(yàn)，HIV DNA定量分析及CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)。獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血后28天開展HIV ART 治療，49 天開展梅毒治療。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

獻(xiàn)血后第6 天，第4 代抗-HIV ELISA 和CLIA檢測(cè)呈陽(yáng)性。獻(xiàn)血后第26 天，第3 代抗-HIV ELISA 和HIV 快速檢測(cè)陽(yáng)性。早期ART 治療后，第4代抗-HIV ELISA 和CLIA 檢測(cè)信號(hào)值略有下降。然而，第三代抗-HIV ELISA 和HIV 快速篩查試劑檢測(cè)結(jié)果均未明顯降低。HIV-WB 從獻(xiàn)血后42 天開始呈陽(yáng)性，WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖見圖1。在所有方法中，抗-TP 試劑1 ELISA 檢測(cè)早期梅毒感染的效率最高。獻(xiàn)血后第80 天，梅毒治療后血清學(xué)TRUST 實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)陰轉(zhuǎn)。HIV/TP 共感染獻(xiàn)血者治療前后血清學(xué)、核酸學(xué)檢測(cè)結(jié)果見表1。

圖1 WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖Figure 1 Schematic diagram of the WB experiment

2.2 HIV 核酸檢測(cè)結(jié)果

獻(xiàn)血者本次獻(xiàn)血血漿，所有HIV 核酸檢測(cè)方法均顯示反應(yīng)性。獻(xiàn)血后第117 天，除6-MP NAT外，所有NAT 檢測(cè)HIV-RNA 仍呈陽(yáng)性反應(yīng)。經(jīng)過(guò)早期抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，獻(xiàn)血后3 個(gè)月內(nèi)，HIV RNA 病毒載量急劇下降，獻(xiàn)血后246 天降至檢出限以下；獻(xiàn)血后403 天，外周血中仍可檢測(cè)到HIV-1 DNA，見表1。

表1 HIV/TP 共感染獻(xiàn)血者治療前后血清學(xué)、核酸學(xué)檢測(cè)結(jié)果Table 1 Serological and Nucleic acid test results after early treatment of HIV/TP coinfected blood donor

2.3 CD4 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與CD4/CD8 比值

急性感染期間CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4/CD8比值均顯著下降。盡管在第345 天出現(xiàn)CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4/CD8 比值的輕微波動(dòng)，經(jīng)過(guò)ART 和青霉素治療，免疫細(xì)胞下降的趨勢(shì)得到較好逆轉(zhuǎn)。見表2。

表2 CD4 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與CD4/CD8 比值Table 2 Trend of CD4/CD8 ratio after early treatment of HIV/TP coinfection

3 討論

本研究通過(guò)動(dòng)態(tài)追蹤梅毒/艾滋病合并感染窗口期獻(xiàn)血者，評(píng)估在梅毒/艾滋病聯(lián)合感染并進(jìn)行相應(yīng)治療前后，不同檢測(cè)方法（血清學(xué)和核酸檢測(cè)）的試劑診斷效能、機(jī)體免疫細(xì)胞的數(shù)量以及疾病治療效果。

共同感染治療后個(gè)體疾病進(jìn)展通常都會(huì)改變［8］。之前的研究表明，HIV 引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)破壞改變了梅毒病程，艾滋病患者合并梅毒的臨床進(jìn)展通常比未感染該病毒的患者快［9］。梅毒治療通常在合并HIV 感染者中應(yīng)答率較低，表現(xiàn)為非螺旋體滴度下降較慢［10］。在本文病例中，梅毒治療后，抗-TP 水平降低，并在第80 天時(shí)獲得血清學(xué)應(yīng)答。表明艾滋病毒/梅毒共感染的個(gè)體對(duì)梅毒治療反應(yīng)良好，盡管研究者不太確定HIV 共感染是否降低了應(yīng)答率。本研究中不同試劑靈敏度不同，但受共感染影響不大。外生殖器潰瘍（獻(xiàn)血前第28 天）到抗-TP 試劑1、抗-TP ECLIA 和抗-TP 試劑2 血清學(xué)試驗(yàn)陽(yáng)性之間的時(shí)間間隔分別出現(xiàn)在獻(xiàn)血后0、6 和10 天。這些數(shù)據(jù)在單一感染梅毒患者出現(xiàn)癥狀的時(shí)間范圍內(nèi)［11］。梅毒治療臨床療效需要監(jiān)測(cè)非螺旋體抗體滴度，抗體轉(zhuǎn)陰或滴度下降4 倍以上提示治愈。據(jù)報(bào)道，15%～25%的患者在初級(jí)階段治療2～3年后恢復(fù)到血清學(xué)無(wú)反應(yīng)狀態(tài)［12］。本研究中，梅毒治療后血清學(xué)TRUST 實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)陰轉(zhuǎn)與之前的研究結(jié)果一致，即使在合并感染的患者中也是如此［13］。之前研究也通過(guò)比較感染和未感染艾滋病毒的患者，評(píng)估了梅毒治療后艾滋病毒狀況與血清學(xué)結(jié)果的關(guān)系［14］。但是，這些研究的結(jié)果并不一致，所以目前仍然不清楚艾滋病毒感染者是否能達(dá)到梅毒完全清除。這一學(xué)術(shù)爭(zhēng)論的原因或許與①梅毒和HIV感染病程差異性相關(guān)；②對(duì)血清學(xué)無(wú)反應(yīng)的定義不一致有一定聯(lián)系。

根據(jù)英國(guó)性健康與艾滋病協(xié)會(huì)關(guān)于艾滋病毒窗口期（2014年11月）聲明，暴露4 周后第4 代試劑檢測(cè)結(jié)果呈陰性，艾滋病毒感染可能性極低［15］。然而，根據(jù)目前的結(jié)果，HIV 窗口期似乎在合并梅毒感染者中更長(zhǎng)。本研究中，第四代抗-HIV ELISA 試劑和CLIA 檢測(cè)試劑在獻(xiàn)血后第6天呈陽(yáng)性，距離獻(xiàn)血前41 天和35 天高風(fēng)險(xiǎn)暴露已近6 周。因此推測(cè)，窗口期時(shí)間延長(zhǎng)的一個(gè)可能原因是合并梅毒感染影響機(jī)體針對(duì)HIV 的體液反應(yīng)進(jìn)展。

2015年，世界衛(wèi)生組織ART 指南建議，發(fā)現(xiàn)艾滋病毒感染后立即開展抗病毒治療［16］。早期ART治療及時(shí)降低HIV 病毒濃度。本研究中共感染獻(xiàn)血者對(duì)ART 反應(yīng)良好，說(shuō)明了早期治療艾滋病毒的重要作用以及HIV DNA 在共感染后作為病毒庫(kù)長(zhǎng)期存在。

根據(jù)獻(xiàn)血者自述，獻(xiàn)血前第28 天出現(xiàn)一處生殖器潰瘍（下疳）。有研究表明，下疳通常在暴露后10～90 天出現(xiàn)［17］，原發(fā)性梅毒下疳形成后1～4 周是梅毒體液反應(yīng)發(fā)展的窗口期［18］。本研究中聯(lián)合感染對(duì)這一癥狀出現(xiàn)的時(shí)間影響似乎有限。

本例報(bào)告也存在不少局限性。首先，患者有兩次高危行為，但由于缺乏更多信息，無(wú)法確定具體感染時(shí)間。其次，本研究主要集中在檢測(cè)和治療上，有關(guān)共感染對(duì)免疫系統(tǒng)影響的分子機(jī)制仍有待深入研究。后續(xù)將在更多不同階段HIV 與梅毒共感染病人樣本中，分析驗(yàn)證與免疫相關(guān)差異表達(dá)蛋白在不同病程中的功能，探明對(duì)HIV 窗口期抗體生成的影響。