張醇 程燦 應(yīng)方微 呂潔璇 林寶濤 于莉 嚴(yán)宗輝 聶丹瑤 黎明

真菌廣泛分布于我們生活的環(huán)境，在正常情況下人體有皮膚等屏障可以阻止真菌的侵入，但在眼部外傷，特別是植物外傷后，真菌感染角膜引起真菌性角膜潰瘍，甚至是真菌眼內(nèi)炎[1-3]。該病的臨床癥狀重，用藥時(shí)間長，同時(shí)復(fù)發(fā)率也較高，在部分缺乏檢查手段的地區(qū)確診有一定困難。臨床上，對(duì)該病的早期診斷和早期治療對(duì)患者的視力預(yù)后至關(guān)重要，有助于減少臨床誤診、角膜穿孔、眼內(nèi)炎等嚴(yán)重預(yù)后，對(duì)挽救患者的視力作用非常顯著[2-5]。近年來，我國眼科臨床應(yīng)用活體角膜共焦顯微鏡，能早期、快速地在真菌性角膜潰瘍中發(fā)現(xiàn)真菌菌絲，從而早期確診該病，并通過該設(shè)備儀器的檢查結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥治療[1-5]。

臨床上通過角膜共焦顯微鏡確診的真菌性角膜潰瘍，大部分都是絲狀菌所致，國內(nèi)少有關(guān)于孢子致病的報(bào)道，這是因?yàn)橹虏℃咦虞^小，直徑不到1 μm，在共焦顯微鏡下容易與眼部的雜質(zhì)或者是那他霉素滴眼液的藥物粉塵相混淆，臨床確診困難[1-5]。我們采用激光角膜共焦顯微鏡，對(duì)11例角膜潰瘍刮片、培養(yǎng)確診為近平滑假絲酵母菌患者的角膜潰瘍?cè)詈团囵B(yǎng)菌落涂片進(jìn)行檢測，研究其共焦顯微鏡圖像的特點(diǎn)，為早期診斷該病打下基礎(chǔ)，報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

(一)入選標(biāo)準(zhǔn)：1.患者有以下病史之一：(1)明確的外傷史，特別是植物傷史;(2)角膜接觸鏡佩戴;(3)長期激素應(yīng)用病史;(4)化療或者免疫抑制劑應(yīng)用病史；2.角膜潰瘍有以下特點(diǎn)之一：(1)潰瘍邊界毛糙、不光滑，邊緣可呈毛刷狀，周邊可有偽足、衛(wèi)星灶或免疫環(huán);(2)角膜潰瘍?cè)钣懈捎哺谢蛟旗F狀;(3)可伴有前房積膿、內(nèi)皮斑或者后彈力層皺褶等較重的炎癥反應(yīng)；3.潰瘍?cè)钐幑纹〔摹⒄婢囵B(yǎng)陽性，致病菌鑒定為近平滑假絲酵母菌[1-5]。

(二)入選對(duì)象：從2008年11月至2018年11月在本院潰瘍刮片、真菌培養(yǎng)鑒定為近平滑假絲酵母菌性角膜潰瘍患者共11例(11只眼)，其中男性8例，女性3例；左眼4例，右眼7例?；颊吣挲g(31±4.7)歲(24～49歲)。起病時(shí)間(19±4.6)d(14～26 d)。

二、真菌取材培養(yǎng)方法：采用0．5%愛爾凱因滴眼液點(diǎn)患眼3次表面麻醉，固定患瞼，采用自制胡須刀片在角膜潰瘍?cè)钐幑稳⌒迈r的病變組織，在無菌操作臺(tái)中分別接種于沙氏培養(yǎng)基(SDA)和馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)，然后在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14 d，每日觀察，菌種鑒定時(shí)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種察氏基做小培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和鏡下特征。

三、近平滑假絲酵母菌角膜潰瘍?cè)畹慕悄ぜす夤步癸@微鏡的活體檢查方法：(1)表面麻醉：采用0.5%愛爾凱因滴眼液麻醉患眼3次；(2)鏡頭準(zhǔn)備：用丙酮棉簽清潔共焦顯微鏡頭的前表面后，點(diǎn)上一大滴VidisicTM凝膠作為耦合劑，點(diǎn)凝膠時(shí)應(yīng)避免氣泡逸入其中；(3)共焦顯微鏡鏡頭帽安裝：將共焦顯微鏡Rostock角膜接觸帽從無菌包裝中取出，安裝于物鏡頭上，使鏡頭帽通過耦合劑與物鏡連接；(4)患者體位、頭位及眼位：患者坐于檢查臺(tái)前，頭部的前額和下頜分別緊靠頭托和下顎托，眼位注視前方的固視光點(diǎn)；(5)CCD攝像頭的位置：應(yīng)調(diào)節(jié)CCD懸臂使CCD攝像頭的光軸與激光掃描攝像頭的光軸垂直；(6)將共焦顯微鏡激光物鏡頭前移至患者角膜前5～10 mm處，通過位移微調(diào)，使Rostock角膜接觸帽與角膜中心接觸；(7)再微調(diào)共焦顯微鏡物鏡頭及焦距，當(dāng)顯示器上出現(xiàn)角膜圖像時(shí)踩下記錄所需圖像，最后通過顯示器篩選需要的圖象并存盤；(8)潰瘍?cè)畹倪x點(diǎn)：選擇潰瘍?cè)畹闹醒?、周圍浸潤灶與透明角膜交界區(qū)的上、下、鼻和顳側(cè)共5 點(diǎn)為特定檢查位點(diǎn)；(9)檢查注意事項(xiàng)：檢查時(shí)，物鏡頭需繞潰瘍?cè)顧z查1周，以免遺留死角；。(10)檢查后對(duì)獲取圖像進(jìn)行評(píng)估，應(yīng)注意潰瘍?cè)钪姓婢咦拥挠袩o、孢子密度的高低及形態(tài)。

四、對(duì)培養(yǎng)近平滑假絲酵母菌菌落的激光共焦顯微鏡檢查方法：(1)鏡頭準(zhǔn)備：用丙酮棉簽清潔共焦顯微鏡頭的前表面后；(2)將培養(yǎng)基上的菌落轉(zhuǎn)接涂抹于Rostock角膜接觸帽的外表面，點(diǎn)上一大滴VidisicTM凝膠作為耦合劑，再將其裝在物鏡頭上；(3)打開電源開關(guān)，通過微調(diào)調(diào)整，掃描角膜接觸帽外表面的菌落圖象，同時(shí)踩下記錄按鈕，記錄所需圖像。

結(jié) 果

一、角膜激光共焦顯微鏡觀察活體近平滑假絲酵母菌角膜潰瘍?cè)畹奶攸c(diǎn)

為了便于描述，我們根據(jù)潰瘍?cè)钐庢咦拥亩嗌伲咦佑袩o聚集成團(tuán)現(xiàn)象以及聚集的程度，分類進(jìn)行介紹。

第一類、潰瘍?cè)钐幱墟咦映霈F(xiàn)，孢子數(shù)量可多可少，但孢子尚無聚集成團(tuán)的現(xiàn)象(圖1～4)。

第二類、潰瘍?cè)钐幋罅挎咦泳奂?，形成不同形狀的高反光團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，但這些聚集的孢子密度還不夠大，激光尚能穿過成像(圖5～8)

第三類、團(tuán)塊狀聚集的孢子進(jìn)一步聚集疊加，孢子團(tuán)密度增高，影響激光穿過成像，孢子團(tuán)中央為暗區(qū)，成像不清(圖9～圖11)。

二、近平滑假絲酵母菌培養(yǎng)菌落涂抹在激光共焦顯微鏡下的特點(diǎn)

培養(yǎng)鑒定后的近平滑假絲酵母菌養(yǎng)菌落，涂抹于角膜接觸帽的外表面，再將其裝在物鏡頭上，采用激光角膜共焦顯微鏡觀察菌落特點(diǎn)。在角膜激光顯微鏡下，該菌落由細(xì)小、高反光、顆粒狀的的孢子構(gòu)成，聚集呈團(tuán)塊狀(圖12，13)。

圖1 白色箭頭處顯示潰瘍?cè)顑?nèi)有少量孢子出現(xiàn)，在共焦顯微鏡下孢子非常細(xì)小，直徑在1 μm以下，為中-高反光的細(xì)小顆粒狀結(jié)構(gòu)。上圖右側(cè)是角膜上皮細(xì)胞，黑色箭頭處顯示潰瘍的邊界 圖2 顯示角膜激光共焦顯微鏡下，潰瘍?cè)钐幱写罅挎咦映霈F(xiàn)(大量、細(xì)小、中-高反光的顆粒狀結(jié)構(gòu))，但尚未聚集成團(tuán)。上圖的下方是角膜上皮細(xì)胞，黑色箭頭處顯示潰瘍?cè)畹倪吔?圖3 顯示角膜激光共焦顯微鏡下，潰瘍?cè)钪写罅挎咦映霈F(xiàn)(大量、細(xì)小、中-高反光的顆粒狀結(jié)構(gòu))，但尚未聚集成團(tuán)。上圖的上方可見角膜基質(zhì)細(xì)胞 圖4 顯示角膜激光共焦顯微鏡下，潰瘍?cè)钪械拇罅挎咦?，黑色箭頭處的條索狀結(jié)構(gòu)為角膜顯微縫線，該顯微縫線周圍有較多的孢子出現(xiàn)。白色箭頭處顯示脫落的角膜上皮細(xì)胞 圖5 白色箭頭處顯示大量真菌孢子聚集成不同形狀的高反光、近圓形、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)可見大量細(xì)小的、高反光顆粒狀孢子結(jié)構(gòu)。上圖的下方是角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu) 圖6 白色箭頭處顯示大量真菌孢子聚集成形狀不規(guī)則的、高反光、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)可見大量細(xì)小的、高反光顆粒狀孢子結(jié)構(gòu)。上圖的左下方是角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu) 圖7 顯示大量真菌孢子聚集成更大的、形狀不規(guī)則的、高反光、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，該團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)是由大量細(xì)小的、高反光顆粒狀孢子結(jié)構(gòu)聚集構(gòu)成 圖8 顯示團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步融合為更大片的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)有大量細(xì)小的、高反光顆粒狀孢子結(jié)構(gòu)聚集 圖9 白色箭頭處顯示團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步融合為更大片的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，大量孢子在團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)中央聚集疊加，影響激光穿過成像，為暗反光結(jié)構(gòu)，其內(nèi)成像不清。在這里團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)的周邊部，孢子密度較小，激光仍能通過成像，可見周邊有大量聚集的、細(xì)小、高反光顆粒狀孢子聚集 圖10 顯示大量孢子聚集成弧形、條狀的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，中央有孢子大量聚集、疊加形成的暗區(qū)，周邊可見大量顆粒狀的孢子聚集。白色箭頭處顯示較多孢子聚集、折疊形成類似孢子團(tuán)的邊界結(jié)構(gòu) 圖11 顯示孢子大量聚集、疊加形成的暗區(qū)，其右上方孢子密度較低，可見大量顆粒狀的孢子聚集。上圖的左側(cè)及下方可見角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu) 圖12 共焦顯微鏡下可見大量、細(xì)小、顆粒狀的孢子聚集成團(tuán)塊狀，形態(tài)不規(guī)則。在上圖的背景中可見將孢子涂抹于角膜接觸帽時(shí)產(chǎn)生的刮痕，呈暗反光、細(xì)條狀結(jié)構(gòu) 圖13 大量、細(xì)小、顆粒狀的孢子聚集成團(tuán)塊狀，形態(tài)不規(guī)則。背景中可見將孢子涂抹于角膜接觸帽時(shí)產(chǎn)生的刮痕，呈暗反光、細(xì)條狀結(jié)構(gòu) 圖14 顯示較多、細(xì)小的孢子懸浮于潰瘍周圍角膜條狀的小凹里 圖15 顯示較多脫落的孢子懸浮于潰瘍?cè)畹姆e液里，上圖的左邊可見積液的液氣交界面。

三、近平滑假絲酵母菌的孢子從生長處脫落下來，可以懸浮于潰瘍?cè)畹姆e液或者附近角膜小凹的積液里(圖14，15)。

四、根據(jù)上述圖片分析，真菌性角膜潰瘍?cè)钪械逆咦雍团囵B(yǎng)出的真菌菌落涂片的孢子在角膜激光共焦顯微鏡上的圖像基本一致。

討 論

假絲酵母菌是我國真菌性角膜潰瘍致病菌中的一類，其廣泛存在于人體皮膚、口腔、陰道等處，是典型的條件致病菌。人體致病的假絲酵母菌屬有4～5種，致病力最強(qiáng)的是白色念珠菌(白假絲酵母菌)，該酵母菌的孢子及菌絲均可致病；第二為熱帶假絲酵母菌，第三為近平滑假絲酵母菌位，第四為偽熱帶假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌等[6]。在假絲酵母菌屬中，臨床上眼科最常見是白色念珠菌，臨床報(bào)道最多。近平滑假絲酵母菌相對(duì)較為少見，國內(nèi)臨床上有零星報(bào)道[7-9]，國外報(bào)道較多[10-24]，其在人體眼部常規(guī)情況下僅產(chǎn)生孢子，是孢子致病的酵母菌。同時(shí)在臨床檢驗(yàn)室常規(guī)真菌培養(yǎng)條件下，土豆葡萄糖培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基38 ℃或28 ℃ 培養(yǎng)3～21 d，其菌落中也只出現(xiàn)孢子，不出現(xiàn)菌絲。真菌孢子刮片情況下，不容易與眼部的組織碎屑鑒別，早期刮片容易漏診。通過共焦顯微鏡研究真菌孢子在活體下的特點(diǎn)[1-14]，有助于我們?cè)缙诎l(fā)現(xiàn)診斷該類孢子致病的真菌性角膜潰瘍。

我們搜集了10年間在本院確診的11例近平滑假絲酵母菌所致的真菌性角膜潰瘍，其孢子在角膜潰瘍?cè)钪杏腥缦绿攸c(diǎn)：(1)在潰瘍?cè)钪械逆咦釉诠步癸@微鏡下是中-高反光的細(xì)小顆粒狀結(jié)構(gòu)，孢子非常細(xì)小，直徑在1 μm以下，非常容易與潰瘍?cè)钪械碾s質(zhì)或者藥物粉塵顆粒混淆；孢子未聚集成團(tuán)時(shí)，在潰瘍?cè)钪械姆植伎啥嗫缮?，參見圖1～4；(2)當(dāng)病情發(fā)展，真菌孢子可以聚集成團(tuán)塊狀，這種真菌孢子聚集的團(tuán)塊大小不一，形態(tài)不規(guī)則，參見圖2～8，但其中可見大量密集聚集的孢子顆粒結(jié)構(gòu)；(3)當(dāng)病情進(jìn)一步發(fā)展，孢子不斷聚集，還會(huì)疊加增厚，增厚嚴(yán)重的區(qū)域可以阻擋激光的進(jìn)入，從而影響成像，參見圖[9-11]

將培養(yǎng)的菌落涂抹于角膜接觸帽的外表面，采用激光共焦顯微鏡進(jìn)行觀察，可見大量、細(xì)小、顆粒狀的孢子聚集成團(tuán)塊狀，形態(tài)不規(guī)則，參見圖12～13。活體近平滑酵母菌性角膜潰瘍?cè)钪械逆咦雍团囵B(yǎng)涂片的孢子在角膜激光共焦顯微鏡圖像基本一致，說明角膜激光顯微鏡在檢查活體真菌孢子與涂片后培養(yǎng)的效果基本一致。

酵母菌的孢子非常細(xì)小，直徑常常在1 μm以下，如不進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下很難辨認(rèn)，非常容易于取材時(shí)的雜質(zhì)混淆。而我們常規(guī)角膜潰瘍刮片取材后，是加一滴3.9 mmol/l的氫氧化鉀溶液后，于顯微鏡下查找真菌菌絲及孢子，常規(guī)并不進(jìn)行HE染色。同時(shí)還受限于實(shí)驗(yàn)室檢查人員對(duì)病原菌形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)，對(duì)于此類只有孢子而沒有菌絲的酵母菌非常容易漏診。我們掌握了該類孢子在共焦顯微鏡下的圖像特點(diǎn)后，采用共焦顯微鏡直接檢查角膜潰瘍?cè)?，可以減少對(duì)這類單純孢子致病的真菌性角膜潰瘍的誤診和漏診。

臨床上采用共焦顯微鏡對(duì)潰瘍?cè)钸M(jìn)行檢查時(shí)，應(yīng)注意以下事項(xiàng)：(1)病灶檢查范圍至少應(yīng)包括病灶的中央、周圍浸潤灶與透明角膜交界區(qū)的上、下、鼻和顳側(cè)5個(gè)檢查點(diǎn)；(2)在患者配合地情況下，共焦顯微鏡鏡頭最好繞潰瘍?cè)顧z查一周，以免遺留死角；(3)潰瘍?cè)钪薪悄乃浪樾驾^多，組織水腫嚴(yán)重，背景反光強(qiáng)時(shí)，應(yīng)反復(fù)調(diào)整共聚焦顯微鏡的對(duì)焦平面，將孢子從強(qiáng)背景中區(qū)別開來，避免假陰性結(jié)果；(4)當(dāng)潰瘍?cè)钪械逆咦虞^多時(shí)，可以脫落懸浮于潰瘍?cè)畹姆e液中或者角膜上的小凹液體中，參見圖[14，15]，我們?cè)谶M(jìn)行共焦顯微鏡檢查時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)這種情況，應(yīng)在潰瘍?cè)钐幾屑?xì)檢查，以免漏診；(5)患者如使用過那他霉素滴眼液，藥物粉塵顆粒覆蓋在潰瘍?cè)畋砻鏁?huì)影響孢子的觀察，可以用生理鹽水將潰瘍?cè)畋砻娴乃幬锓蹓m沖洗后再進(jìn)行檢查，以提高檢查的陽性率[2-14]。

角膜激光共焦顯微鏡在我國眼科的臨床應(yīng)用較為廣泛，是早期診斷真菌性角膜潰瘍及指導(dǎo)臨床治療的新型設(shè)備儀器，其對(duì)真菌菌絲所致的角膜潰瘍?cè)\斷陽性率高，檢查時(shí)間短，同時(shí)對(duì)眼部組織無損傷，可以反復(fù)進(jìn)行，有其特有優(yōu)勢。而對(duì)于孢子致病的真菌性角膜潰瘍，臨床報(bào)道較少。近平滑假絲酵母菌是單純孢子致病的一類真菌，臨床上較為少見，同時(shí)致病孢子的直徑太小，容易與潰瘍?cè)钪械碾s質(zhì)混淆。通過對(duì)比活體潰瘍?cè)钪墟咦犹攸c(diǎn)和培養(yǎng)孢子在共焦顯微鏡下的特點(diǎn)，有助于我們減少對(duì)該類孢子致病的真菌性角膜潰瘍的漏診，提高診治水平。角膜激光共焦顯微鏡檢查活體真菌性角膜潰瘍的孢子與培養(yǎng)的效果基本一致，在孢子致病的真菌性角膜潰瘍的研究和臨床診斷方面是十分有用的工具[3-18]。