包亮亮

(甘肅省地質(zhì)礦產(chǎn)勘查開發(fā)局第三地質(zhì)礦產(chǎn)勘查院，甘肅 蘭州 730050)

污泥是污水處理構(gòu)筑物的沉淀物，含有大量的微生物，其中的糞大腸菌群數(shù)的高低表明了底泥的污染程度，也反映了對(duì)人體健康危害性的大小?！冻擎?zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918-2002)明確規(guī)定了污泥中糞大腸菌群的排放標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)方法，以及控制標(biāo)準(zhǔn)[1]；《城市污水處理廠污泥檢驗(yàn)方法》(CJ/T221-2005)為檢測(cè)城鎮(zhèn)污水處理廠污泥中糞大腸菌群提供了檢測(cè)技術(shù)規(guī)范[2]。測(cè)定污泥中的糞大腸菌群至今仍采用多管發(fā)酵法和濾膜法，標(biāo)準(zhǔn)方法至今沒有改進(jìn)。我國雖然在2006年《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》[3]中采用酶底物方法，但其推廣速度慢，一直沒有得到發(fā)展。直到2018年生態(tài)環(huán)境部發(fā)布HJ1001-2018《水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定酶底物法》后[4]，水質(zhì)檢測(cè)糞大腸菌群的酶底物法才得到推廣和應(yīng)用，但污泥中的糞大腸菌群檢測(cè)工作還停留在多管發(fā)酵法、濾膜法階段。目前，酶底物法已經(jīng)在50多個(gè)發(fā)達(dá)國家得到廣泛應(yīng)用，美國90%以上的實(shí)驗(yàn)室使用酶底物法，因此對(duì)污泥糞大腸菌群酶底物法的推廣以及可行性研究具有重要意義。

1 多管發(fā)酵法

1.1 方法原理

多管發(fā)酵法又稱多管發(fā)酵二步法[5]。(參照水質(zhì)糞大腸菌群多管發(fā)酵檢測(cè)方法[6])將污泥稀釋樣品加入到乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管中，經(jīng) 37 ℃ 初發(fā)酵富集培養(yǎng)，大腸菌群分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)氣的酸使溴甲酚紫指示劑由紫色變?yōu)辄S色，再經(jīng) 44.5 ℃ 復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的膽鹽三號(hào)可抑制干擾菌的生長，最后產(chǎn)氣的細(xì)菌確定為糞大腸菌群。

1.2 儀器和試劑

1)儀器。高壓蒸汽滅菌器；電熱恒溫培養(yǎng)箱：37 ℃，44.5 ℃ 可調(diào)；天平；試管等。

2)試劑。乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、EC 培養(yǎng)基、無菌水等。

1.3 樣品的預(yù)處理和制備

稱取污泥樣品 10 g 于三角瓶，加 90 mL 滅菌生理鹽水，混勻5～10 min，制成1∶10(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)均勻稀釋液。按此方法依次制成1∶100、1∶1000等不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混勻菌液，推薦多管發(fā)酵法稀釋度范圍為質(zhì)量分?jǐn)?shù)：10-2～10-8，選擇3個(gè)連續(xù)稀釋度的混勻樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)流程

1)初發(fā)酵試驗(yàn)。在5個(gè)裝有 5 mL 的三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管中(內(nèi)有導(dǎo)管)，加入 10 mL 混勻稀釋的污泥菌液；于各裝有 10 mL 的單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中加入 1 mL 混勻稀釋的污泥菌液；于剩余5個(gè)試管中加入 0.1 mL 混勻稀釋的污泥菌液。均置于(37±0.5)℃條件下，培養(yǎng) 24 h 觀察。發(fā)酵試管顏色變黃為產(chǎn)酸，玻璃倒管內(nèi)有氣泡為產(chǎn)氣。產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的試管表明試驗(yàn)呈陽性。如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的也為陽性。

2)復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。將初發(fā)酵試驗(yàn)呈陽性或疑似陽性的培養(yǎng)物接種到有EC培養(yǎng)基的試管中。在(44.5±0.5)℃ 下培養(yǎng) 24 h 后觀察，產(chǎn)氣證實(shí)為糞大腸菌群陽性，即證實(shí)有糞大腸菌群存在。查閱HJ347.2-2018中的MPN表，用公式MPN值=MPN指數(shù)×(10 mL/接種量最大值)[7]，換算得出 1 g(mL)污泥中糞大腸菌群數(shù)。

2 酶底物法

2.1 方法原理

方法原理采用水質(zhì)糞大腸菌群酶底物法[4]。在(44.5 ±0.5)℃下培養(yǎng) 24 h，大腸菌群細(xì)菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶和大腸桿菌的β-葡糖醛酸酶分解代謝。選擇培養(yǎng)基中的色原底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解為黃色的鄰硝基苯盼(ONP)腸桿菌科細(xì)菌，培養(yǎng)基呈現(xiàn)黃色反應(yīng)。定量分析水中糞大腸菌群的最大可能數(shù)。

2.2 儀器和試劑

1)儀器。程控定量封口機(jī)，97孔定量盤，100 mL 無菌采樣瓶，恒溫培養(yǎng)箱，手提式壓力蒸汽滅菌鍋，稀釋瓶，移液管等。

2)試劑。MMO-MUG培養(yǎng)基(IDEXX科立得Colilert試劑)，無菌水。

2.3 樣品預(yù)處理

樣品的預(yù)處理同1.3。選擇合適稀釋度的樣品，對(duì)于準(zhǔn)確測(cè)定污泥中糞大腸菌群的最大可能數(shù)具有重要意義，推薦污泥樣品酶底物法稀釋度范圍為(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：10-3～10-8。

2.4 檢測(cè)流程

量取 100 mL 稀釋混勻的樣品于無菌采樣瓶中，加入MMO-MUG 培養(yǎng)基粉末，充分混勻，使培養(yǎng)基完全溶解；全部倒入定量盤內(nèi)，釋放氣泡，用程控定量封口機(jī)封口。于(44.5±0.5)℃培養(yǎng) 24 h 后對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)陽性板判讀結(jié)果。查閱MPN表對(duì)應(yīng)的 100 mL 水中糞大腸菌群的最可能數(shù)，換算得出 1 g(mL)污泥中糞大腸菌群的最可能數(shù)。

3 結(jié)果分析與對(duì)比

采集污水處理廠、醫(yī)療機(jī)構(gòu)、城市排水溝3大類污泥樣品共30組，分別采用多管發(fā)酵法和酶底物法檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析對(duì)比。

本文原始數(shù)據(jù)都以10為底，對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后使用EXCEL和SPSS.25統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

3.1 兩種檢測(cè)結(jié)果比較

對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析得出(圖1)，多管發(fā)酵法個(gè)別檢測(cè)結(jié)果略大于酶底物法，這是由于樣品在初發(fā)酵試驗(yàn)之后，還需復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，在此過程中容易受到到外界因素的干擾和不確定因素的影響，以及污泥樣品的不均性，造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)較大差異的情形，而酶底物法采用先進(jìn)的密封培養(yǎng)技術(shù)，沒有二次污染[8]，且由于科立得試劑獨(dú)有的抑菌功能，能抑制200萬個(gè)異養(yǎng)菌生長，從而使出現(xiàn)假陽性和假陰性的概率大大降低[9]。

圖1 30組污泥樣品檢測(cè)結(jié)果比較

3.2 試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)30組檢測(cè)結(jié)果的t-檢驗(yàn)分析得出，相關(guān)系數(shù)(r)為：0.925。r≥0.8,說明這兩種方法之間高度相關(guān)。tStat=0.447,t0.05(30)=2.045,tStat﹤t0.05(30),P=0.658。P>0.05，即兩種分析方法檢測(cè)結(jié)果無顯著差異。結(jié)果分析見圖2。

圖2 檢測(cè)結(jié)果的線性回歸分析

3.3 兩種方法精密度試驗(yàn)對(duì)比與分析

在該批樣品中選取低濃度、中濃度、高濃度污泥樣品各1份，按不同方法各進(jìn)行了6次重復(fù)測(cè)定，并對(duì)精密度測(cè)試結(jié)果作分析比較。結(jié)果見表1。

從表1表明，無論是對(duì)于低濃度、中濃度，還是高濃度的樣品，酶底物法的RSD%﹥多管發(fā)酵法RSD%，酶底物法重復(fù)性r明顯小于多管發(fā)酵法，說明酶底物法檢測(cè)數(shù)據(jù)波動(dòng)較小。經(jīng)F檢驗(yàn)，低濃度、中濃度、高濃度F計(jì)算值分別為6.57、14.30、39.22。F計(jì)算值﹥F0.05，(5,5)=5.05，說明兩種檢測(cè)方法的精密度有顯著差異，酶底物法精密度明顯大于多管發(fā)酵法。

表1 多管發(fā)酵法與酶底物法精密度的比較

4 酶底物法替代多管發(fā)酵法的可行性探討

4.1 兩種檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)對(duì)比

酶底物法主要是采用先進(jìn)的酶技術(shù)密封培養(yǎng)，易操作，檢測(cè)流程短，無需確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，假陽性概率較低，精密度高，但材料成本相對(duì)較高，其檢測(cè)費(fèi)用比較昂貴，人工成本較低，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)多管發(fā)酵法的不足。

多管發(fā)酵法，其操作步驟繁瑣，整個(gè)操作過程容易受到外界環(huán)境的干擾，控制成本方面具有優(yōu)勢(shì)，技術(shù)操作簡單，檢測(cè)時(shí)間較長，需進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，準(zhǔn)確度相對(duì)酶底物法略低，人工成本較高，大批量樣品檢測(cè)難度較大。兩種方法的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)對(duì)比見表2。

表2 多管發(fā)酵法與酶底物法優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)的對(duì)比

4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較分析

對(duì)檢測(cè)結(jié)果的t檢驗(yàn)分析，兩種檢測(cè)方法無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，兩種分析方法之間高度相關(guān)，其檢測(cè)效果相同，兩種方法檢測(cè)結(jié)果無顯著差異。

4.3 兩種方法精密度檢驗(yàn)

通過對(duì)精密度的分析，兩種檢測(cè)方法的精密度之間存在顯著性差異，酶底物法精密度高于多管發(fā)酵法，且兩種檢測(cè)方法的精密度均在受控范圍之內(nèi)。

5 結(jié)論

隨著微生物檢測(cè)技術(shù)的不斷提高，高效、準(zhǔn)確、環(huán)保、低廉的微生物檢測(cè)技術(shù)將是未來發(fā)展的主要方向。污泥糞大腸菌群采用酶底物法檢測(cè)效果顯著，與傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法比較檢測(cè)結(jié)果基本一致，兩種方法之間高度相關(guān)，無顯著性差異，檢測(cè)結(jié)果無系統(tǒng)誤差。污泥糞大腸菌群酶底物法檢測(cè)精密度高，操作流程簡單，檢測(cè)時(shí)間短，工作效率高，其檢測(cè)效果高于多管發(fā)酵法，適用于各種固體類型的污泥、堆肥、肥料、土壤中的糞大腸菌群檢測(cè)。酶底物法是現(xiàn)階段代替?zhèn)鹘y(tǒng)多管發(fā)酵法最可行有效的替代方法之一。