張雪婷，趙雯雯，王風(fēng)華，呂文憬，張 一，陳建國(guó)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

子宮復(fù)舊指母體在胎盤娩出后子宮在一定時(shí)間內(nèi)逐漸恢復(fù)至未孕狀態(tài)的生理過(guò)程，包括子宮體積和重量的減少，肌肉收縮，內(nèi)膜增生以及血管修復(fù)等一系列變化[1]。但由于飼養(yǎng)環(huán)境不理想易造成感染，誘發(fā)子宮內(nèi)膜炎或盆腔炎[2-3]，分娩次數(shù)過(guò)多影響子宮收縮力以及母體年齡和精神狀態(tài)等原因也常導(dǎo)致子宮復(fù)舊不良。子宮復(fù)舊不良作為一種常見的產(chǎn)后并發(fā)癥會(huì)影響產(chǎn)后恢復(fù)以及下次妊娠，從而影響母體的繁殖力和生產(chǎn)性能，給養(yǎng)殖者帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-8]。脂多糖(LPS)是導(dǎo)致奶牛子宮內(nèi)膜炎優(yōu)勢(shì)菌革蘭陰性菌的主要毒性成分[9]，能夠在體外誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)[10],也可通過(guò)進(jìn)行子宮灌注誘導(dǎo)小鼠發(fā)生急性子宮內(nèi)膜炎[11]。松弛素(RLX)對(duì)生殖系統(tǒng)作用主要是抑制妊娠子宮收縮[12],促進(jìn)膠原降解[13-15]。孕酮和雌二醇在妊娠及分娩中起到重要作用[16]，主要通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因與因子等方式調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖與分化[17-21]。白介素等細(xì)胞因子也參與維持子宮內(nèi)膜的降解與重構(gòu)[22]，并反映機(jī)體的健康狀態(tài)。本試驗(yàn)旨在通過(guò)向子宮灌注LPS和RLX建立2種不同類型的子宮復(fù)舊不良模型，比較其與正常子宮復(fù)舊的小鼠血清中雌二醇及孕酮的水平以及部分細(xì)胞因子的變化，為出現(xiàn)子宮復(fù)舊不良的母體產(chǎn)后治療及藥物療效提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 LPS(Eshcherichiacoli0128∶B8)，購(gòu)自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；RLX，購(gòu)自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司；速眠新Ⅱ注射液，購(gòu)自吉林省敦化市動(dòng)物藥品有限公司；雌二醇、孕酮、腫瘤壞死因子(TNF-α)及白介素1-β(IL-1β)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒，均購(gòu)自NEWA公司。

1.2 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀，PerkinElmer股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)KM小鼠，雌性與雄性，8周齡，體重(35±10)g，均購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 分組及給藥 雄鼠與雌鼠以1∶3的比例進(jìn)行配種，雌鼠確定妊娠后挑出。將剛分娩結(jié)束的雌性KM小鼠隨機(jī)分為3個(gè)大組，每組根據(jù)灌注次數(shù)再隨機(jī)分為5個(gè)小組，分組及給藥劑量見表1。

表1 試驗(yàn)小鼠分組及給藥劑量Table 1 Grouping and dosage of the experimental mice

LPS組按20 μL/只給予5 mg/mL的LPS溶液；RLX組按2.5 μg/只給予1.25 μg/mL的RLX溶液，24 h內(nèi)分4次注射，每次注射0.5 mL；PBS組中各小組分為20 μL劑量組和2 mL劑量組，給予PBS緩沖液20 μL(2 mL)/只。按照0、2 d和4 d各灌注1次的規(guī)則，隔天進(jìn)行1次灌注，共灌注5次。

1.4.2 灌注方法 小鼠麻醉處理后，單手提住尾部使其倒立，平口微量進(jìn)樣器抽取20 μL藥品，將進(jìn)樣器經(jīng)陰道伸入宮腔中約0.8 cm，推注灌注液，并倒提小鼠約1 min。

1.4.3 ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β含量 收集子宮組織制備成10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min后收集上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β的含量。

1.4.4 ELISA檢測(cè)雌二醇、孕酮含量 末次灌注結(jié)束后第2天清晨收集各組小鼠血液樣品，3 000 r/min離心5 min，分離血清，采用ELISA法檢測(cè)血清中雌二醇、孕酮含量。

1.4.5 組織學(xué)檢查 各組小鼠在麻醉、采血及安樂死后，取雙側(cè)子宮固定于10%中性甲醛緩沖液中，經(jīng)組織脫水、透明、包埋、切片并進(jìn)行H.E.染色，光學(xué)顯微鏡觀察并記錄。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用t檢驗(yàn)法比較各組差異，視P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)利用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 LPS和RLX對(duì)子宮組織的影響 3個(gè)組在子宮體寬度及重量上無(wú)明顯差異。H.E.染色后鏡檢結(jié)果如圖1 所示，與PBS組相比，產(chǎn)后8 d時(shí)，LPS組子宮內(nèi)膜完整度較低，仍有部分內(nèi)膜上皮細(xì)胞未更新，宮腔內(nèi)容物排出緩慢，同時(shí)存在黏膜下出血，子宮腺擴(kuò)張伴隨分泌物偏多，肌層出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。與PBS組相比，RLX組子宮體收縮不全導(dǎo)致惡露等宮腔內(nèi)容物不能及時(shí)排出，另有宮腔容積較大，子宮壁較薄等情況出現(xiàn)。

圖1 KM小鼠子宮組織病理學(xué)觀察 (H.E.染色，400×)Fig.1 Histopathological observation of uterus in KM mice (H.E.staining,400×)A：PBS組0 d; B：LPS組0 d; C：RLX組0 d; D：PBS組4 d; E：LPS組4 d; F：RLX組4 d; G：PBS組8 d; H:LPS組8 d; I：RLX組8 d

根據(jù)宮腔內(nèi)容物、內(nèi)膜完整度、子宮腺體分泌等情況進(jìn)行打分，評(píng)定子宮復(fù)舊情況，具體評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 子宮復(fù)舊標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Uterine involution standard

各組子宮復(fù)舊早期、中期和末期情況見表3。與PBS組相比,LPS組和RLX組在0 d時(shí)子宮腺體分泌物稍多。4 d時(shí)LPS組子宮內(nèi)仍有較多內(nèi)容物，子宮收縮緩慢，子宮腺分泌物較多；RLX組子宮壁較薄，宮腔容積較PBS組更大；且2個(gè)組與PBS組相比子宮內(nèi)膜更新緩慢，內(nèi)膜完整度更低。8 d時(shí)PBS組已基本恢復(fù)至未孕水平，子宮復(fù)舊完成；LPS組與之相比各方面均恢復(fù)較差，RLX組則在子宮內(nèi)容物排出、子宮體收縮、子宮腺體分泌等方面恢復(fù)較差?？傮w來(lái)說(shuō)LPS和RLX進(jìn)行子宮灌注均會(huì)引起子宮復(fù)舊不全，LPS主要誘發(fā)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致內(nèi)膜上皮更新遲緩，影響動(dòng)脈血流；RLX主要導(dǎo)致子宮收縮不全，惡露等內(nèi)容物排出不及時(shí)。

表3 各組子宮復(fù)舊評(píng)分Table 3 Uterine involution score of each group

2.2 子宮組織中TNF-α與IL-1β的檢測(cè)與分析 產(chǎn)后不同時(shí)間各組KM小鼠子宮組織TNF-α的濃度變化如圖2A所示，0～8 d期間，LPS組TNF-α濃度一直顯著高于PBS組(P<0.05)，RLX組和PBS組無(wú)顯著差異(P>0.05)，但RLX組TNF-α濃度隨著產(chǎn)后天數(shù)增加呈緩慢上升的趨勢(shì)。產(chǎn)后不同時(shí)間各組KM小鼠子宮組織IL-1β的濃度變化如圖2B所示，0～8 d期間，RLX組IL-1β濃度一直顯著低于PBS組(P<0.05)，LPS組和PBS組無(wú)明顯差異(P>0.05)。RLX組隨時(shí)間推移，子宮組織IL-1β濃度略呈下降趨勢(shì)，其余2個(gè)組略有波動(dòng)，無(wú)明顯變化趨勢(shì)。

圖2 各組子宮組織炎性因子濃度Fig.2 Inflammatory cytokines concentration in uterine tissue of each group與PBS組相比， *：P<0.05， **：P<0.01； 下圖同Compare with PBS group, *：P<0.05， **：P<0.01. The same as below

2.3 血清中雌二醇及孕酮的檢測(cè)與分析 產(chǎn)后不同時(shí)間各組KM小鼠產(chǎn)后血清雌二醇的濃度變化如圖3A所示，0～8 d期間，所有組別雌二醇濃度均呈升高趨勢(shì)。其中0～6 d期間，LPS組與PBS組相比雌二醇極顯著升高(P<0.01)，8 d時(shí)較PBS組顯著提升(P<0.05)。 0～8 d期間，RLX組雌二醇濃度始終極顯著高于PBS組(P<0.01)。此外，RLX組的升高趨勢(shì)較LPS組相比更為明顯。產(chǎn)后不同時(shí)間各組KM小鼠產(chǎn)后血清孕酮的濃度變化如圖3B所示；0～8 d 期間，所有組別孕酮含量均呈上升趨勢(shì)，產(chǎn)后初期上升較為緩慢，4 d開始孕酮濃度迅速升高且0～4 d期間RLX組孕酮含量顯著高于正常組(P<0.05)，后期無(wú)明顯區(qū)別(P>0.05)。

圖3 各組血清中雌二醇(E2)及孕酮(PROG)濃度Fig.3 Estradiol and progesterone of serum concentration in each group

3 討論

當(dāng)前相關(guān)研究多利用未孕小鼠進(jìn)行子宮內(nèi)膜炎造模，忽視了自然分娩后母體更容易受環(huán)境影響誘發(fā)子宮內(nèi)膜炎的情況，同時(shí)因生產(chǎn)等造成肌纖維斷裂、肌肉收縮障礙從而導(dǎo)致子宮復(fù)舊不全的情況也未得到重視，常單一進(jìn)行抗生素給藥或抗炎治療[23]。本試驗(yàn)以產(chǎn)后KM小鼠為對(duì)象，通過(guò)對(duì)子宮灌注LPS和RLX建立子宮內(nèi)膜炎及子宮松弛2種子宮復(fù)舊不良模型[24]，并檢測(cè)TNF-α、IL-1β兩種細(xì)胞因子以及雌二醇及孕酮的濃度，光鏡觀察子宮組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮灌注LPS或RLX后均可導(dǎo)致子宮復(fù)舊不良，其中LPS組主要表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜上皮更新不全，炎癥導(dǎo)致宮腔內(nèi)容物排除不及時(shí)和子宮腺封閉延遲；RLX組主要表現(xiàn)為子宮收縮減慢，宮腔容積偏大。LPS對(duì)TNF-α的分泌具有促進(jìn)作用，而RLX對(duì)IL-1β有明顯的抑制作用。雌二醇與孕酮水平均隨天數(shù)增加而上升，與前期查閱的大部分文獻(xiàn)結(jié)果一致，即LPS及RLX對(duì)雌激素分泌均有促進(jìn)作用，其中RLX對(duì)雌激素分泌的促進(jìn)作用極為顯著(P<0.01)。目前，雌激素是否對(duì)子宮修復(fù)有促進(jìn)作用尚未明確，但確定雌激素與孕酮對(duì)子宮內(nèi)膜的增殖與分泌同時(shí)進(jìn)行調(diào)控。許多研究證實(shí)，雌激素具有抗炎作用[25-26]，本試驗(yàn)中，與PBS組相比，經(jīng)RLX誘導(dǎo)后產(chǎn)后小鼠血清中雌激素水平極顯著提升，其子宮組織中IL-1β含量明顯受到抑制，且抑制效果隨雌激素含量的水平升高而逐漸明顯，證明雌激素能夠抑制子宮組織分泌IL-1β，對(duì)子宮組織有一定的抗炎作用。此外，有研究表明，雌激素能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的生長(zhǎng)[27]，促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)與血管新生。本試驗(yàn)中僅RLX組在0～4 d期間孕酮水平與PBS組間存在顯著差異(P<0.05)。當(dāng)孕酮水平較高時(shí)子宮收縮受到抑制，膠原被降解，影響惡露排出，有利于細(xì)菌繁殖，進(jìn)一步導(dǎo)致子宮復(fù)舊遲緩。由于孕酮與雌激素間存在協(xié)同與拮抗作用[28]，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，提示當(dāng)出現(xiàn)子宮復(fù)舊不良時(shí)可考慮采用雌激素療法，不僅能夠增強(qiáng)子宮收縮力，促進(jìn)血管新生，增加結(jié)締組織膠原合成，同時(shí)發(fā)揮抗炎作用，對(duì)由于不同原因?qū)е碌淖訉m復(fù)舊遲緩可能均有效，但臨床應(yīng)用時(shí)雌激素的具體濃度仍待驗(yàn)證，本試驗(yàn)僅為雌激素治療多種類型子宮復(fù)舊不良提供試驗(yàn)依據(jù)。此前有試驗(yàn)證明，在進(jìn)行單次子宮灌注LPS時(shí)，雌激素對(duì)IL-1β的表達(dá)有抑制作用[29-31]，本試驗(yàn)中LPS為隔天多次灌注且IL-1β水平并未出現(xiàn)明顯改變，具體原因尚需進(jìn)一步分析驗(yàn)證，考慮到LPS誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜炎常呈短時(shí)急性反應(yīng)，而實(shí)際生產(chǎn)中部分子宮內(nèi)膜炎病例可能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，故應(yīng)考慮進(jìn)行細(xì)胞炎性因子鑒定，或配合其他藥物進(jìn)行治療。